Khóa luận Qui trình nhân giống dâu tây in vitro

cấy quang tự dưỡng Nuôi cấy quang tự dưỡng Đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công trong ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất cây trồng. Phương pháp vi nhân quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và đồng thời làm hạ giá thành cây in vitro. Phương pháp này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuyếch tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, độ ẩm, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy,...) thay vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường cấy như độ đường, muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cấy quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Nói đúng hơn sử dụng chất hữu cơ bao gồm cả chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi trường. Điều này dựa trên cơ sở tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp lục tố đều có khả năng quang hợp để tồn tại và phát triển. Tất cả các cơ quan dùng trong môi trường nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khả năng quang hợp. Chúng đều có thể nhận CO2 không khí làm nguồn trong carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy. Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon cho chính quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Sự loại bỏ đường trong môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm. Điều này đem lại ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể song song với việc giảm nguyên vật liệu. Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa cây cấy được xem như là nhà kính thu nhỏ. Với phương pháp này sự tăng trưởng phát triển của cây in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2 sự trao đổi khí. Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai nhân tố chính quan trọng nhất trong nuôi cấy quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố, sự gia tăng khác biệt giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài hộp cấy và sự gia tăng của ánh sáng làm cho hiệu quả quang hợp tăng lên. 1.5. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hệ số nhân giống cao: Từ một mẫu vật sạch bệnh ban đầu, bằng con đường nuôi cấy mô có thể nhân nhanh và cung cấp một lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng hạn chế. Đối với khoai tây chẳng hạn, từ một cây sạch bệnh trong ống nghiệm (in vitro) trong vòng một năm có thể nhân lên hàng ngàn cây trong phòng thí nghiệm. Chất lượng giống tốt: Mẫu cây ban đầu (có thể sạch hoặc không sạch bệnh) được nhập in vitro và nhân nhanh. Khi đạt một số lượng nhất định cần thiết, mẫu được kiểm tra bệnh virus bằng các phương pháp huyết thanh (ELISA, ngưng kết antigene – antibody), hoặc cây chỉ thị. Mẫu không nhiễm tiếp tục được nhân nhanh cho mục đích sử dụng (sản xuất giống hoặc phục vụ các nghiên cứu lai tạo giống). Mẫu đồng nhất về mặt di truyền, dòng cây mong muốn, có khả năng ra hoa và tạo quả sớm. Khả năng chủ động trong nhân giống: Trong điều kiện phòng thí nghiệm có kiểm soát, kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân giống quanh năm. Vì vậy, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch sản xuất, cung cấp giống 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trinh nuôi cấy mô tế bào thực vật Các nhân tố trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có 3 nhân tố chính: Đảm bảo điều kiện vô trùng Chọn đúng môi trường và chuẩn bị đúng cách Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp với trước và sau khi cấy. 1.6.1. Yếu tố vô trùng 1.6.1.1. Ý nghĩa của việc nuôi cấy vô trùng tế bào nuôi cấy mô tế bào thực vật - Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật chứa đường, các chất khoáng, vitamin… là điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật phát triển mạnh mẽ. - Do tế bào nấm và vi khuẩn hơn nhiều so với tế bào thực vật nên chỉ cần nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì chúng nhanh chóng phủ đầy trên toàn bề mặt môi trường, bề mặt mô tế bào thực vật. Các vi sinh vật lấn áp tế bào nuôi cấy mô thực vật sẽ làm cho mô thực vật phát triển chậm lại và chết dần. 1.6.1.2. Nguồn tạp nhiễm Có 3 nguồn tạp nhiễm chính: Dụng cụ, nút đậy, môi trườn nuôi cấy không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt mô có chứa các sợi nấm, bào tử nấm và bào tử vi khuẩn. Trong quá trình thao tác làm nhiễm các bào tử nấm hoạc vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy. 1.6.2. Kỹ thuật vô trùng 1.6.2.1. Vô trùng thuỷ tinh, nút đậy, môi trường Dụng cụ thuỷ tinh: thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các phòng thí nghiệm bằng dung dịch sulfocromate một lần trước khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch để ráo trước khi sử dụng . Trong trường hợp các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi phải vô trùng, có thể khử trùng bằng cách đưa vào tủ sấy sấy trong nhiều giờ dụng cụ phải được gói trong giấy nhôm hoặc cất trong hộp kim loại để tránh bị nhiễm trơ lại sau khi khử trùng. Bảng 1.1 Thời gian khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng nhiệt độ và nhiệt độ khử trùng. Nhiệt độ khử trùng (oC) Thời gian khử trùng (Phút) 160 45 170 20 180 10 190 7,5 Nút đậy: thường là nút đậy không thấm nước. Nút đậy phải chặt để bụi đi qua được đồng thời nước ở môi trường cũng không bốc hơi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông thấm nước là một loại chất đơn giản nhất nhưng có những nhược điểm sau: - Nếu khi nút bông bị ướt hoạc dính môi trường thì sẽ bị nấm nhất là đối với những thí nghiệm lâu dài. - Thao tác nút bông chậm không thể sản xuất trên qui mô lớn. - Chỉ dùng vài lần rồi bỏ. Môi trường : Môi trường nuôi vấy thường được hấp khử trùng trong nồi autoclave, khử trùng bằng áp suất hơi bão hòa. Thời gian thường 15 -30 phút ở áp suất 1atm nhiệt độ 121oC. Bảng 1.2: bảng thể tích và thời gian hấp khử trùng( Autoclave) Thể tích môi trường (ml) Thời gian hấp khử trùng (phút) <50 15 75 20 250 - 500 25 1000 30 Việc hấp khử trùng này không hợp với các chất nhạy cảm với nhiều như: acid amin, các vitamin, hormone tăng trưởng, các chất kháng sinh. Các chất này thường được khử bằng cách lọc qua màng lọc polyethylen hoặc sợi cellulose. Các lỗ màng này có thể giữ lại các vi sinh vật. 1.6.2.2. Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Vô trùng phòng cấy: Trước khi đưa vào sử dụng hoặc cứ sau 2-3 tháng, phòng cấy phải được xử lý hơi formalin bằng cách rót formol 40% ra một số đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do, đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formalin đi và khử hơi formalin thừa bằng dung dịch amoniac 25% cũng để rải rác trong phòng 24h. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy ngoài đèn tử ngoại trong box cần có 4 đèn tử ngoại 40W trên trần. Chỉ cho các đèn tử ngoại làm việc khi không có người làm việc trong box cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút và tắt trước 30 phút trước khi làm việc hoặc bật sau khi đã ngưng làm việc. Cần hạn chế chuyển động không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu. Các dụng cụ làm việc phải chuẩn bị đầy đủ, bố trí hợp lý, thuận tiện để làm việc và hạn chế đi lại khi cấy, ra vào buồng cấy, đóng cửa cẩn thận. Phòng nuôi cũng phải được khử trùng trước là bằng xà bông bột, sau đó lau bằng dung dịch calcium hypochlorite loãng hoặc cồn 70%. Tất cả trần, sàn đều phải được lau như vậy mỗi tuần. Không được khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử. Khử trùng các dụng cụ kim loại và môi trường khoáng: Các dụng cụ kim loại được khử trùng bằng không khí nóng (130o – 170oC). Các dụng cụ này phải được gói kín trước khi khử trùng, nên gói trong giấy nhôm là tốt nhất. Không nên hấp khử trùng dụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm kim loại bị rỉ sét và bị ăn mòn. Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới một áp suất nhất định nút gòn, khăn vải, các vật dụng phòng thí nghiệm bằng thủy tinh, các bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, các bộ lọc, nước, môi trường khoáng đều có thể khử trùng bằng nồi hấp. Gần như tất cả vi sinh vật đều bị tiêu diệt bởi hơi nước trong nồi hấp thời gian từ 10 - 30 phút ở nhiệt độ 121o, 1,5 atm. Môi trường sau khi pha chế có thể chuyển vào bình cấy với lượng cần thiết trước khi hấp tiệt trùng, cũng có thể hấp trước với khối lượng lớn và rót chuyển vào bình cấy trong box cấy. Thời gian hấp tiệt trùng phụ thuộc dung tích môi trường trong dụng cụ đựng khi hấp ở nhiệt độ 121o, 1,5atm. Thời gian tối thiểu này gồm cả thời gian cần thiết để nhiệt độ nồi hấp đạt đến 121oC và 15 phút tiệt trùng. Đối với môi trường khoáng, áp suất không nên cao quá 1atm vì áp suất cao sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm với nhiệt độ. Sau khi tiệt trùng, môi trường được chuyển ngay sang phòng cấy để làm nguội và sử dụng theo yêu cầu. Nếu là môi trường thạch hấp với khối lượng lớn trước khi chia vào bình cấy, thì chuyển ngay vào box cấy đã được vô trùng để tránh nhiễm. Trên bàn thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Các dụng cụ khác để cấy như bình môi trường, ống nghiệm, bình đựng mẫu cấy chuyền… Đều được xử lý khử trùng bề mặt bằng cách lau bằng cồn 70 % trước khi đưa vào trong box cấy. 1.6.3. Yếu tố môi trường Một trong nghững yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường. Thành phẩn này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi. Tuy nhiên tất cả các môi trường nuôi cấy thành phần dinh dưỡng bao gồm 5 phần: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô tế bào thực vậtnhư môi trường MS (Murashige và skoog), B5 (Ganborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng cao và một số môi trường khác mô tả bởi White, Gautheret, Nitach Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp. 1.6.3.1.Khoáng đa lượng Nhu cầu khoáng của mô, tế bào tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp N, P, K, Ca, Mg và Fe. 1.6.3.2. Khoáng vi lượng Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm thành công do argar và hóa chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Zn, Cu, B, Mn, Co, Mo... 1.6.3.3.Carbon và nguồn năng lượng Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường hay gặp nhất là glucose và surcose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như: Lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng nguồn carbohydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Sucruse là nguồn carbon quan trọng đối với mô tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một số tham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật. 1.6.3.4.Vitamin Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác nhiều quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng.các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamin (B1), acid nicotinic, piridorxite (B6) và mio- inositol. 1.6.3.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trong nuôi cấy mô thực vật có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Miller là người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ phytohormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay sự tạo rễ không giống nhau. Auxin: Tự nhiên là hợp chất tương đối dơn giản: indol-3- acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống như IAA và có cùng vai trò với IAA trong cơ quan đều được gọ là auxin (như: IBA, NAA. 2,4-D, 2,4,5- t và phenoxyacetic acid) auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khôi phục tạo mới mô phân sinh chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh), auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khỏi rễ (phát thể non của rễ) nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tạo được), amino acid (như arginin), và nhất là các hợp chất othordiphenollic (như cafeic acid, chlorogenic acid) Cytokinin: là một loại chất sinh trưởng thực vật thực vật kích thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong cac base của DNA và hợp chất cytokinin đầu tiên được khám phá ra là kinetine, tiếp theo là zeatin một chất có trong phần lớn thực vật và một vài vi khuẩn cấu trúc gần giống kinetine nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin hơn 30 cytokinin khác nhau được cô lập. Ngày nay, cytokinin để chỉ một hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lí giống kinetin. Nhiều hợp chất có hoạt tính cytokinin, chúng đều là apminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, ví dụ như BA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin và cytokinin tác động trên cả 2 bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu) auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí là tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách: sự phân vách chỉ xảy ra khi cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp đỡ sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng lá tế bào lá trưởng thành. Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao sự tao rễ, A/C thấp sự tạo chồi, vậy cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin( giúp tạo rễ) và cytokinin giúp tạo chồi. Sự cân bằng giữa 2 phytohormone này là một trong những yếu tố kiểm soát phát triển. (2,4- diclorophenoxy) acetic acid Napthalene acetic acid Kinetin 6- Benzyl adenin Hình 3.1. Công thức một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài 5 thành phẩn cơ bản trên người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, ETDA...) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa. Dịch chiết nấm men... vào môi trường nuôi cấy. 1.6.3.6. Các chất hữu cơ không xác định Bổ xung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng mô. Chất bổ sung là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, cà chua. Tuy nhiên chỉ có nước dừa và protein hydrolysate là được được sử dụng rộng rãi. 1.6.3.7. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác Mặc dù tế bào cáo khả năng tổng hợp các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung amino acid vào môi trường nuôi cấy là kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Amino acid cung cấp cho nguồn tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitơ này được tế bào hấp thu nhanh hơn so với nitơ vô cơ. Các nguồn nitơ thường được sử dụng là nguồn amino acid như casein hydrolysate, L- glutamine, L- asparine và adenine. 1.6.3.8. Than hoạt tính Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp các chất cản, hút các chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môi trường. Tác dụng càng tăng trưởng của mô trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2ip. Khả năng kích thích tăng trưởng là do than hoạt tính kết hợp với chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt quá trình nuôi cấy. 1.6.3.9. Yếu tố làm đặc môi trường Argar là chất thường được sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. Khi argar được trộn chung với nước thì tạo ra ở dạng gel và tan ở nhiệt độ từ 600 – 1000C, đặc lại khi nhiệt độ xuống còn 450 vì vậy argar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa argar không bị phản ứng với các chất trong môi trường. Độ ứng của argar quyết định bởi số argar sử dụng và pH môi trường. 1.6.4. Khử trùng mô thực vật Các mô thực vật hầu như là các bộ phận của cây. Các mẫu trước khi nhập mẫu đòi hỏi phải tiến hành khử trùng bề mặt mẫu tránh tạp nhiễm. Các bước để xử lý khử trùng gây bề mặt mẫu vật: - Chọn lựa mẫu cấy tốt nhất, rửa kỹ mẫu bằng nước máy (trong dòng chảy) cho sạch bụi bẩn. - Ngâm rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng trong ba phút (lắc nhẹ liên tục trong quá trình ngâm) - Rửa sạch xà phòng bằng nước máy (trong dòng chảy). Chuyển vào box đã được xử lý, vô trùng từ trước, mọi thao tác từ đây đều phải áp dụng các biện pháp vô trùng. - Dùng panh vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng (panh này không dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắc nhẹ) mẫu trong dung dịch khử trùng trong thời gian ấn định. – Chú ý: Hiệu quả xử lí các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ, và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào, và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề mặt các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử trùng trước tiên nguời ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70o sau đó mới xử lí dung dịch diệt khuẩn. Đồngthời người ta có thể cho thêm vào các chất giảm sức căng bề mặt như tween 80, Fotoflo, teepol vào dung dịch diệt khuẩn. Bảng 1.3. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng( Street (1974) Tác nhân vô trùng       Nồng độ %      Thời gian xử lý        Hiệu quả (phút) Calci hypochlorit            9 – 10                  5 – 30                   Rất tốt Natri hypochlorit              2                       5 – 30                  Rất tốt Hydro peroxid               10 – 12                5 – 15                   Tốt Nước Brom                   1 - 2                       2 – 10                 Rất tốt HgCl2 0.1 – 1                   2 – 10                  Trung bình Chất kháng sinh       4 – 50 mg/l                   30 – 60              Khá tốt - Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3-4 lần. Nếu rửa không sạch, chất khử trùng có thể làm chết mẫu. - Nhập mẫu sau khi khử trùng chuyển mẫu ra giấy thấm (dưới lớp giấy thấm có một lớp giấy không thấm hoặc đĩa petri vô trùng). Tiến hành cắt tách mẫu, tỉa bỏ các phần dập nát, hư hỏng và cấy chuyển ngay mẫu thu được vào môi trường nhập mẫu đã chuẩn bị trước. Sau trên dưới một tháng (tùy từng loại mẫu) cấy chuyễn những mẫu sạch sang môi trường nhân nhanh. 1.7.Giới thiệu và phân loại dâu tây 1.7.1 .Nguồn gốc và phân loại dâu tây Dâu tây có tên khoa học là Fragaria hay còn gọi là dâu đất là một loài thuộc họ hoa hồng. Xuất sứ từ châu Mỹ và được các nhà làm vườn châu Âu lai tạo thế kỷ 18 và tạo ra giống dâu ngày nay. Hình thái quả dâu tây là một loại quả giả, nghĩa là phần thịt không bắt nguồn từ bầu nhụy (Là các hạt mà người thông thường nhìn thấy, trên thực tế chúng là một dạng quả bế) mà từ cái móc ở đáy hypanthium để giữ các bầu nhụy. Từ quan điểm thực vật học, các hạt là quả thực sự của thực vật, và phần cùi mọng nước của dâu tây là mô đế hoa bị biến đổi. Hình 1.6. Quả dâu tây Dâu tây là cây được nhiều nguời ưa thích vì hình dạng, màu sắc và mùi vị. Phân loại khoa học: Giới : Plantea (thực vật) Ngành : Angiospermae (hạt kín) Lớp : Rosids (hoa hồng) Bộ : Rosales (hoa hồng) Họ : Rosaceae (hoa hồng) Hình 1.7. Cây dâu tây Chi : Fragaria Loài : Fragaria. sp (có hơn 20 loài trên thế giới) 1.7.2. Phương pháp nhân giống dâu tây 1.7.2.1. Phương pháp truyền thống Cắt cành từ cây mẹ. Phương pháp này hệ số nhân giống thấp cây dễ bị hoái hóa, đồng thời rễ cây yếu. Phương pháp này không đảm bảo sạch bệnh cây bị tryền bệnh từ đời này sang đời khác. Phương pháp nhân giống in vitro: Sử dụng chồi cây tiến hành nhân giống trong phòng thí nghiệm, lúc này cây sẽ được nuôi cấy một cách hoàn chỉnh nhanh chóng, ta được giống sạch bệnh và trẻ hóa được giống cây. 1.7.2.2. Các bước nhân giống dâu tây in vitro Trước khi đi sâu vào qui trình nhân giống cây dâu tây, ta sẽ đi tổng quát các bước nhân giống in vitro Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy: Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu kích thước và vị trí lấy mẫu đó... Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dihloroisocyanurate, chlorua thủy ngân,... Tạo thể nhân giống in vitro: Mẫu cấy trên môi trường để tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Nhân giống in vitro: Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống bằng cách tạo cụm từ chồi mô sẹo. Trong môi trường nhân giống giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống . Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thuờng là môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài. Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh: Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các cơ chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình ra rễ. Điều kiện nuôi cấy gần như với điều kiện bên ngoài , một bước làm thích nghi trước khi tách khỏi điều kiện nuôi cấy in vitro. Sự tạo rễ phụ thuộc vò các yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin kích thích quá trình ra rễ in vitro Chuyển cây con in- vitro ra vườn ươm: Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch argar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,... sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài lúc này ta có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong qui trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt giữa diều kiện sống in vitro và ex vitro. Cây con in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sánh cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp cây con dễ bị stress dễ bị mất nước dẫn đến hiện tượng chất. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cấy mô phải mát, cường độ ánh sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con thường được cấy trong luống cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp và giữ độ ẩm, trong những ngày đầu tiên phải phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô dần dần lui đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lí ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ, nồng độ thấp đẻ rút ngắn quá trình ra rễ CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm Tiến hành tại tổ nuôi cấy, phòng sản xuất (Trung Tâm Nghiên Cứu Khoai