Khóa luận Quy trình chẩn đoán viêm gan C bằng kỹ thuật PCR Elisa và Real-Time PCR

viêm gan C sẽ tùy thuộc vào kết quả của cuộc thử máu này. Nếu genotype được xác định là loại số 1, bệnh nhân cần điều trị khoảng một năm. Nếu là loại số 2 hoặc 3, thời gian sẽ là khoảng 6 tháng. Những loại khác có thể phải điều trị từ 6 đến 12 tháng, tùy theo từng trường hợp. 14 Tên Thuốc Công ty Cơ chế tác động Có trên thị trường PEG-Interferon-alpha (Pegasys®) PEG-Interferron-alpha 2b (Peg-Intron®) Ribavirin Interferon alpha-2a (Roferon-A ) Interferon alpha-2b (Intron® A ) Interferon Đang nghiên cứu Pha III Viramidine(Taribavirin) Interferon –Beta Zadaxin Pha II VX-950 Valoppicitabine (NM283) SCH503034 Albuferon Suvus (Methylene blue) Omega interferon Multiferon Actilon (CPG 10101) Roche Schering-Plough Copegas®(Roche),Rebetol® ( Schering Plough), Ribaphere®, Vilona®,Virazole® Roche Schering-Plough Các hãng thuốc và dạng thuốc generic khác Valeant Pharma Serono SciClone Certex Indenix/Novartis Schering-Plough Human Genome Sciences/Novartis Bioenvision Intarcia Therapeutics Viragen/Valentis Coley Interferron tác động kéo dài Interferon tác động kéo dài Nucleosid ức chế polymerase Hiệp lực với interferon Interferron điều trị viêm gan siêu vi B và một số dạng C Nucleosid ức chế polymerase Tiến dược của ribavirin Interveron-Beta 1a,tác nhân miễn dịch Ức chế NS3 serine protease Nucleosid ức chế polymerase Ức chế NS3 serine protease Interferon-alpha gắn kết với albumin) Xanh methylen Tác nhân miễn dịch Interferon tác động kéo dài,đã sử dụng ở một số quốc gia,ngoại trừ Hoà Kỳ và chau âu Chủ vận TLR9 ( Tác nhận miễn dịch) Bàng 1.1: Các thuốc trên thị trường dùng điều trị viêm gan C và các thuốc có triển vọng [22] 15 1.6. Định lượng RNA-HCV trong huyết thanh 1.6.1.Phương pháp PCR ELISA [8], [15], 17] 1.6.1.1 Định nghĩa: ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu xét nghiệm. Phương pháp này dựa vào nguyên lý tính bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Do trong thành phần phản ứng có enzyme, khi thêm cơ chất tương ứng, enzyme sẽ biến đổi cơ chất và tạo tín hiệu có thể xác định được. Khi virus viêm gan C vào trong cơ thể thì hệ thống miễn dịch của cơ thể sẽ tạo ra những chất để chống lại việc xâm nhập này, những chất này gọi là kháng thể. Nếu cơ thể có kháng thể (Anti-HCV) có nghĩa là đã có sự hiện diện của virus viêm gan C. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ quyết định cường độ màu ánh sáng phát ra. 1.6.1.2 Phương pháp xét nghiệm virus HCV bằng ELISA Có 2 cách : + Phương pháp gián tiếp là phương pháp miễn dịch, nghĩa là qua phản ứng kháng nguyên kháng thể ta sẽ xác định được kiểu của kháng thể, từ đó biết được type huyết thanh của siêu vi C (HCV serotype) + Phương pháp trực tiếp dựa trên sự phân tích trực tiếp trên gen của siêu vi C để xác định kiểu gen của siêu vi C (HCV genotype). Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm và có thể thực hiện hoàn toàn trên máy tự động. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn ít nhiều nhược điểm như không định được chi kiểu (subtype), không biết được tình trạng bệnh nhân có hay không có HCV-RNA (tình trạng siêu vi đang tăng sinh để điều trị đặc hiệu), ở bệnh nhân bị ức chế hay suy giảm miễn dịch sẽ không có anti HCV từ đó không xác định được loại HCV, không phân biệt được 16 giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại và loại HCV đang nhiễm. Và một điều cực kỳ quan trọng là sự phù hợp giữa type huyết thanh và kiểu gen vẫn còn nhiều khác nhau. Dễ bị dương tính giả, chi phí cao. Hiện nay, người ta kết hợp phương PCR với phương pháp ELISA để phát hiện virus HCV, người ta hay gọi là phương pháp PCR-ELISA. Để nhân bản cDNA được tách chiết từ RNA HCV trong huyết thanh người bệnh, sau đó ta cho vào trong vi giếng tiến hành xét nghiệm. Hình 1.7. Các vi giếng của microtiter plate chứa kháng nguyên *Phương pháp PCR-ELISA: Dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin. Đầu tiên, người ta tách chiết HCV RNA từ huyết thanh và chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược, cDNA này được dùng làm bản mẫu (template) cho phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer sẽ được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy, sản phẩm PCR tạo ra sẽ có một mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau bước nhân bản, sản phẩm PCR được biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng. Mặt trong mỗi vi giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối với biotin sẽ giữ các mạch mang bitotin ở đầu 5’. Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu cho HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai. Probe này được đánh dấu ở đầu 3’ với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Phức hợp kháng thể kháng digoxigenin-alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi 17 cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào. Cường độ màu tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong mẫu. Việc định lượng HCV RNA có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy giá trị cường độ màu ở mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những mẫu có nồng độ HCV RNA biết trước. Phương pháp này có khả năng phát hiện HCV với nồng độ là 600 IU/ml. Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 600 IU/ml đến 850.000 IU/ml. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. 1.6.2. Phương pháp khuếch đại tín hiệu [12], [14] Phương pháp khuếch đại tín hiệu: là phương pháp phát hiện và định lượng RNA bằng kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu. Bộ gen virus lúc đầu được lai vào một giá, thì các bộ dò oligonucleotide liên kết/bắt cặp đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi các phân tử lai được khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử dụng: +Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology) +Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture) 1.6.2.1. Kỹ thuật DNA nhánh-bDNA (Branched DNA technology) Trong xét nghiệm này, mẫu dò lai với acid nucleic đích không khuếch đại trước. Có sự gia tăng tín hiệu lai đáng kể, thường được thêm vào bộ khuếch đại bDNA (bDNA Amlifier). RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó, phức hợp RNA HCV – probe được cố định trên một vi giếng (microwell) và tiếp tục được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi probe này liên kết với nhiều phân tử alkline phosphatase (Hình 1.8). Cuối cùng, cơ chất của enzyme được cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang (chemiluminescent) sẽ được thu nhận bởi máy đọc tín hiệu ánh sáng. 18 Hình 1.8. Kỹ thuật bDNA nhánh Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai lọai probe (probe cố định RNA HCV vào vi giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV) phải được thiết kế sao cho có thể định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau. Phương pháp này có thể phát hiện tối thiểu 7.105 phân tử HBV-DNA/ml máu. So với Real-time PCR, kĩ thuật bDNA ít nhạy hơn và không thể đo lượng virus < 200.000 bản sao/ml. 1.6.2.2. Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture) Kỹ thuật này dự trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA. Các mẫu được xử lý bằng dung dịch ly giải để giải phóng các nucleic acid có trong tế bào. Sau đó các probe DNA hoặc RNA được cho vào và phản ứng lai xảy ra. Phức hợp lai 19 được cho vào trong các ống nghiệm hoặc trong các vi giếng của microtiter plate có phủ một kháng thể đa dòng (polyclonal antibody). Kháng thể đa dòng này bắt giữ (capture) toàn bộ các phân tử lai DNA:RNA hiện diện trong phản ứng. Các phân tử nucleic acid khác như phân tử DNA mạch đơn, RNA, thể lai DNA:RNA, RNA:RNA không phản ứng với kháng thể này và bị rửa trôi. Sau đó, các phân tử lai DNA:RNA đã được bắt giữ sẽ liên kết đặc hiệu với một kháng thể thứ hai cộng hợp với alkaline phosphatase. Một phân tử lai có thể liên kết với nhiều phức hợp kháng thể - alkaline phosphatase nên sẽ làm gia tăng độ nhạy của kỹ thuật. Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU (Relative Light Unit) có cường độ tương ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu ban đầu. 1.6.3. Phương pháp PCR [3], [5] Kỹ thuật PCR (PCR - polymerase chain reation: phản ứng tổng hợp chuỗi nhờ DNA polymerase) được mô tả năm 1985 bởi K.Mullis và các cộng sự cho phép khuyếch đại, nghĩa là làm tăng một cách rất lớn, lượng DNA sử dụng ban đầu, mức độ khuếch đại là vô cùng lớn, mà về lý thuyết người ta có thể có được một lượng nguyên liệu (nhiều microgram) từ một phân tử DNA. Bằng phương pháp tạo dòng in vivo người ta có thể khuyến đại AND nhờ vi khuẩn. Trong kỹ thuật PCR, sự khuếch đại được thực hiện in vitro, nhờ enzyme (đó là DNA - polymerase), không cần đến sự hiện diện của tế bào. 1.6.3.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR: Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào những đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự 20 DNA, ta chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là xuôi và ngược so với chiều phiên mã của gen. 1.6.3.2 Các giai đoạn của một chu kỳ phản ứng PCR Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm ba bước: (Hình 1.9) Hình 1.9. Nguyên tắc hoạt động của PCR [10] 21 Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Phân tử bị biến tính cao hơn Tm của phân tử. Nhiệt độ phản ứng là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút, hai mạch DNA khuôn bị biến tính, duỗi xoắn và tách ra. Bước 2: Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ được hạ thấp xuống nhiệt độ Ta (nhiệt độ bắt cặp) của mồi, khoảng 40 - 70oC trong 30 giây đến 1 phút, cho phép các mồi bắt cặp vào khuôn. Bước 3: kéo dài (nhiệt độ 72oC) Nhiệt độ được tăng lên 72oC, là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme DNA polymerase để hoạt động tổng hợp mạch mới từ đoạn mồi. Thời gian này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại (từ 30 giây đến vài phút). Thông thường một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ. 1.6.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR Một phản ứng PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản sau: - Khuôn acid nudcleic DNA mẫu phải thật tinh sạch, nhưng nếu DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào thì việc chẩn đoán bằng PCR vẫn cho ra kết quả tốt. Giảm lượng mẫu ban đầu còn lại sẽ hạn chế được việc khuếch đại “ký sinh”, tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn hoặc virus. Ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy thành từng phần nhưng trong các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết,… Thông thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng. -Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95oC, không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Một 22 phản ứng PCR từ 25 - 50µl thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm trong giới hạn từ 0.5 - 2.5 đơn vị. Enzyme này có hoạt tính polymerase 5’- 3’ và hoạt tính exonuclease 5’- 3’ nhưng không có hoạt tính exonuclease 5’- 3’ nhưng không có hoạt tính exonuclease 3’- 5’ (đọc sửa), chỉ dùng Tag DNA polymerase để phiên mã ngược cDNA từ mARN để phát hiện ra virus HCV nói riêng và xét nghiệm có hay không có một gen cụ thể trong DNA đích nói chung, chứ không dùng enzyme này để nghiên cứu chức năng của gen vì enzyme này có tỷ lệ sai xót 1/10000, nghĩa là sau 25 lần tái bản thì khoảng 10% sản phẩm có chứa đột biến. -Mồi ( Primer ) Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao, có vai trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, và là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR. Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn nồng độ mồi thường là 0.1-1µl. Mồi thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau: +Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5oC. +Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”. +Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi. +Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng. +Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. +Thành phần GC khoảng 40-60%. +Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản. -dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) 23 Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng (với nồng độ MgCl2 1.5mM) là 200-250µl, chúng ta phải giữ nồng độ của tất cả các deoxynucleotide bằng nhau, để tránh sự gắn kết nhầm lẫn. Nếu nồng độ dNTPs cao hơn 4µl sẽ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”, và sự mất cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase -MgCl2 Có vai trò là một cofactor cho enzyme Tag polymerase hoạt động. Ngoài ra, mồi; DNA bản mẫu; dNTPs; EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó sẽ cạnh tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh. Ngược lại nếu nồng độ quá thấp (<0.5µM) sẽ làm xấu đi quá trình kéo dài chuỗi. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl2 tối ưu nhất nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR, thông thường là từ 1.5 - 4µM. Ph sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. -Dung dịch đệm PCR Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp. Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris – HCl, pH 8.3 ở nhiệt 200C. pH sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. 1.6.3.4. Phương pháp Real-time PCR [4, tr. 152-153], [9], [11] Trong sinh hoc phân tử Real - time PCR (PCR đúng thời điểm) là kỹ thuật phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng PCR dùng để nhân bội và định lượng đồng thời phân tử DNA đích. Nó có khả năng vừa phát hiện vừa định lượng trình tự đặc hiệu trong mẫu DNA. ) Nguyên tắc real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, đặc điểm cơ bản của Reat - time PCR là DNA nhân bội được định lượng đúng thời điểm sau mỗi chu kỳ phản ứng, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm 24 lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye) vào DNA mạch kép hoặc dùng mẫu dò DNA oligonucleotide được biến đổi để phát huỳnh quang khi lai với DNA bổ trợ, phản ứng PCR đúng thời điểm được kết hợp với RT - PCR (revserse transcription-polymerase chain reaction) để định lượng mRNA có hàm lượng nhỏ, giúp nhà nghiên cứu định lượng mức độ biểu hiện gen một cách tương đối tại một thời điểm cụ thể hoặc ở những tế bào hoặc mô cụ thể. Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR mục tiêu sẽ được theo dõi hàm lượng theo một thời gian thật (real time) của phản ứng. ) Thiết bị Thực chất, thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác và cũng không cần phải qua bước điện di hoặc lai phân tử như kỹ thuật PCR truyền thống, vì vậy nguy cơ ngoại nhiễm do sản phẩm của lần nhân bản trước được loại bỏ và việc phân tích kết quả sau phản ứng được tiến hành hoàn toàn tự động nên đặc biệt thích hợp thao tác trên số lượng mẫu lớn. Thiết bị nhân bản nucleic acid có sử dụng huỳnh quang thông dụng trên thị trường hiện này gồm có máy Mx 400 hay Mx 300 (Stratagene). Máy real-time PCR và hệ thống máy tính, phần mềm hỗ trợ. Hình 1.10. Máy Stratagene Mx3000P 25 Các chất phát huỳnh quang trong mỗi phản ứng được kích thích bằng một nguồn sáng laser (ABI Prism 7700) hoặc đèn tungsten halogen (iCycler). Ánh sáng huỳnh quang phát ra được thu nhận qua một Charged Coupled Device camera (CCD camera) và được chuyển thành một tính hiệu mà máy vi tính có thể phân tích được. ) Phản ứng phát huỳnh quang (khi dùng mẫu dò Taqmam) Việc định lượng số bản sao khuếch đại sẽ dựa vào mẫu dò (probe). Mẫu dò là một đoạn oligonucleotide ngắn xác định, được đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn acid nucleic khác có trình tự bổ sung với nó. Về cơ bản, mẫu dò cũng tương tự như mồi, chỉ khác ở chỗ mẫu dò được gắn thêm một cơ chất có thể phát tín hiệu (thường là đồng vị phóng xạ P32/P33, hoặc chất phát huỳnh quang). Trong real-time PCR có nhiều loại mẫu dò nhưng trong chẩn đoán HCV chỉ sử dụng mẫu dò thủy giải (hydrolysis probe) : Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe): còn được gọi là Taqman probe, người ta dựa vào đăc tính exonuclease 5’- 3’ của Tag polymerase để hình thành phương pháp, loại mẫu dò dựa trên sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang khi lai ( Hình 1.11). Mẫu dò này là oligonucleotide có chứa thuốc nhuộm “phát huỳnh quang” (reporter) thường gắn vào base ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’. Mẫu dò được thiết kế để lai với vùng giữa của sản phẩm PCR. Khi phát xạ, thuốc nhuộm phát huỳnh quang bị kích thích, truyền năng lượng cho phân tử thuốc nhuộm dập tắt bên cạnh chứ không phát sáng, tạo nên cơ chất không phát huỳnh quang. Trong quá trình PCR, khi enzyme DNA polymerase tái bản khuôn có mẫu dò gắn vào, hoạt tính 5’- 3’ của enzyme cắt bỏ mẫu dò. Động thái đó tách thuốc nhuộm phát huỳnh quang khỏi thuốc nhuộm dập tắt và sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang không xảy ra nữa. Ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong 26 Hình 1.11. Real-time,sử dụng Taqman probe để định lượng Mồi 1 và mồi 2 để tái bản DNA.Mẩu dò gắn vào một mạch và nằm giữa 2 mạch Mẫu dò chứa 2 base bị biến đổi,một phát huỳnh quang (R) nằm ở đầu 5’,và base kia bị biến đổi ức chế phát quang (Q) nằm ở đầu 3’. Khi quá trình tái bản diễn ra,sản phẩm từ mồi 1 thay thế đầu 5’ của mẫu dò và hoạt tính exonuclease của polymerase cắt chất phát quang từ vật dò.Sự kiện tách chất phát quang khỏi chất ức chế cho phép nó phát huỳnh quang.Lượng phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm PCR được tạo ra và được đo ở mỗi chu kỳ. phản ứng, tỷ lệ với tốc độ mẫu dò bị cắt bỏ và có thể đo lường được. Taqman probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện. Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp mồi từ 8-10oC nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải mẫu dò bởi Taq polymerase. 27 ) Một số điều lưu ý khi thực hiện phản ứng real-time PCR -Kích thước sản phẩm PCR trong phản ứng Reat-time PCR Chiều dài tối ưu của sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR thường nhỏ hơn 100bp. Sản phẩm có kích thước ngắn nhân bản hiệu quả hơn và chịu các điều kiện bất lợi của phản ứng tốt hơn so với các sản phẩm có kích thước lớn. Sản phẩm kích thước nhỏ có thể biến tính ở nhiệt độ 92oC và chỉ cần 15 giây để Taq polymerase tổng hợp hoàn toàn một mạch mới bổ sung. -Cặp primer Cần phải cẩn thận trong việc chọn lọc mồi, probe quyết định sự thành công trong việc khuếch đại của PCR. Mồi phải đạt được sự cân bằng giữa sự chuyên tính và sự hiệu quả của PCR. Thành phần GC của cặp primer gần giống như thành phần GC của probe khoảng 20% - 80%, cần tránh các nucleotide lặp lại, đặc biệt là G, nếu giá trị Tm càng lớn, cơ hội cho priming nhầm càng cao. Nhiệt độ nóng chảy của cặp primer trong khoảng 58-60oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của probe từ 8-100C. -Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – Ct): Đây là khái niệm trung tâm của kỹ thuật real-time PCR. Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật này dựa vào một đường cong chuẩn (standard curve) được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu đã biết trước nồng độ nucleic acid. Chu kỳ ngưỡng của một mẫu là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt trên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận. Tín hiệu huỳnh quang nền được tạo ra trong phản ứng real- time PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR. Chất phát huỳnh quang này khác với chất phát huỳnh quang được sử dụng để định lượng. Trong phản ứng real-time PCR sử dụng Taqman probe thì chính quencher của Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng. 28 -Đường cong chuẩn (standard curve): Việc định lượng trong phản ứng real-time PCR được thực hiện bằng cách so sánh hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu thử nghiệm với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết được nhân bản đồng thời. Các thiết bị thực hiện phản úng real-time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng (Ct) của các mẫu có nồng độ nucleic acid biết trước (các mẫu chuẩn - standard samples). Sau đó, nồng độ nucleic acid của các mẫu thử nghiệm sẽ được tính toán dựa trên đường cong chuẩn này. 29 CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu [3],[6] 2.1.1. Vật liệu sinh học Mẫu thử nghiệm: mẫu huyết thanh. 2.1.2 Hóa chất Z Hóa chất cho tách chiết RNA: - Dung dịch (1) (Trizol) gồm: phenol 38%, guanidine thyocianat 0.8M, glycerol 5%, pH 4.0 - Dung dịch (2): Chloroform - Dung dịch (3): Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa. - Dung dịch (4): Ethanol 70%. - Dung dịch (5): nước cất đã qua xử lý bằng DEPC. Z Hóa chất trong phản ứng ELISA: - Digoxigenin, ABTS - 2, 2' - Azino-bis (3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid) - Streptavidin microtiter plate - Tris-HCl, Nacl, NaOH, bovine serum Albumin, Sodium Dodecyl Sulfate Z Hóa chất trong phản ứng RT: - Thành phần của 1 phản ứng RT 20µl: Dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 0.5mM, Reverse Transcriptase, mồi ngược, RNA bản mẫu, nước cất vô trùng. Z Hóa chất trong real-time PCR: - Thành phần của 1 phản ứng real-time PCR 25µl: dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, Taq DNA polymerase 0.625 unit, MgCl2 1.5mM, cDNA bản mẫu, nước cất vô trùng, mồi và mẫu dò. - Chuẩn bị các eppendorf gồm : *Các mẫu thử ( unknown ) *Mẫu chứng dương (positive control) chứa cDNA của virus HCV 30 *Mẫu chứng âm (negative control ) *Standard HCV : dùng xây dựng đường chuẩn Tube PCR mix chứa standard 102 copies Tube PCR mix chứa standard 104 copies Tube PCR mix chứa standard 106 copies 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ -Dàn máy ELISA Hình 2.1. Máy ủ lắc Hình 2.2. Máy khay rửa vi thẻ Hình 2.3. Máy đọc vi thẻ 31 -Máy luân nhiệt (MJ Research ) -Máy luân nhiệt real-time iCycler (Bio-Rad) Hình 2.4. Máy luân nhiệt Real-time iCyCler -Ly tâm eppendorf lạnh (Hermle) Hình 2.5. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml 32 -Máy ủ nhiệt khô (Fisher Scientific ) -Máy vortek (Ika Labortechnik) Hình 2.7. Máy vortex Hình 2.6. Máy ủ nhiệt khô 33 -Máy chụp hình kỹ thuật số (Olympus) và bộ lọc tia UV (Kodak) -Máy ly tâm thu huyết thanh và máy ly tâm -Miropipette 0.5-10µl, 20-100µl, 100-1000µl. -Tủ cấy vô trùng. -Vật liệu tiêu hao: găng tay, khẩu trang, đầu tip có phin lọc, eppendorf. 2.2. Phương pháp [2], [3], [5], [7] Hình 2.10 Quy trình phát hiện HCV Hình 2.8. Máy ly tâm thu huyết thanh Hình 2.9. Máy ly tâm 34 2.2.1. Ly trích RNA 2.2.1.1. Nguyên tắc: Việc tách chiết RNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào (2) loại protein (3) tủa RNA. Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. * Mục đích của việc tách chiết là RNA tinh sạch là: +Chiết được RNA tinh sạch + Thu được RNA tối đa + Loại được protein Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa t