Khóa luận Quy trình phát hiện listeria monocytogenes trong thủy hải sản đông lạnh

colsamin (NAG) - Acid N0- acetylmuramic (NAM) - Tetrapepid chứa cả D- và L- axit amin. - Thành tế bào rất dày, hấp thu và giữ lại màu tím khi nhuộm với thuốc nhuộm tím tinh thể. - Thành tế bào làm những nhiệm vụ sau : - Tham gia quá trình trao ñổi chất. - Là nơi chứa ñựng nhiều chất có chứa hoạt tính sinh học. - Bao nhầy : - Bào vệ vi khuẩn trong ñiều kiện khô hạn. - Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi bị thực bào. - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn. - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể. Hình 2.4. Lông roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes. 18 2.2.6. Yếu tố ñộc lực. 2.2.6.1. Tổ hợp gen của Listeria monocytogenes. _ Gen prfA (prfA): hoạt hoá quá trình lây lan cho tế bào chủ của vi khuẩn. _ Gen plcA (PI-PLC) (phosphatidy linocitol-specific phospholipase C) là protein ñược mã hoá bởi gen plcA,33kDa), có tác dụng dung giải màng không bào của thể thực bào. _ Gen plcB(PC-PLC) (phosphatidulcholine-spefic phospholipase C, là protein ñược mã hoá bởi gen pclB, 29kDa):, có tác dụng dung giải màng không bào của thể thực bào. _ Gen hly (LLO là protein ñược mã hoá bởi gen hly, 58.5kDa), có tác dụng giải phóng vi khuẩn ra khỏi lkhông bào của tế bào chủ. _ Gen mpl (Mpl metallprotease ñược mã hoá bởi gen mpl,60kDa) là gen chứa 510 amino axit, có vai trò tham gia vào quá trình hoạt ñộng của gen plcB. _ Gen actA ( AtcA là protein ñược mã hoá bởi gen ACTa,97kDa) có chức năng giúp vi khuẩn lây lan từ tế bào này sang tế bào khác. _ Gen inlA (InlA là protein ñược mã hoá bởi gen inlA, 80kDa). Protein InlA ảnh hưởng mạnh tới internalin khác, xoá bỏ inlA thì sẽ dẫn tới biểu hiện inlB cao hơn, có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ. _ Gen inlB (InlB là protein ñược mã hoá bởi gen inlB, 67kDa), có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ. _ Trong ñó gen prfA có vai trò như yếu tố ñiều hoà chính nhằm ổn ñịnh hoạt ñộng của các gen plcA, plcB, hly, mpl, actA, inlA, inlB. Ngoài ra, còn có gen hly mã hoá protein tạo ra sản phẩm Listeriolysin O (LLO) là tác nhân gây bệnh Listeriosis ở người và ñộng vật, plcA mã hoá tạo PI-PLC và gen 19 plcB mã hoá tạo PC-PLC, gen inlA ,mã hoá cho internalin A, gen inlB mã hoá cho internalin B, gen inlC mã hoá cho internalin C. tất cả các gen này ñều phụ thuộpc vào gen prfA. 2.2.6.2. ðộc tố listeriolysin A (LLO). _ Listeriosin A (LLO) là một ñộc tố protêin ñược tiết bởi L.monocytogenes thóat khỏi không bào và thực bào chủ có trọng lựơng 58.6 kDa, hình thành 1 chuỗi polypeptide gồm 529 amino acid. Trình tự ñầu N có ñặc ñiểm là phần ñầu có tính ái nước, mang ñiện tích dương và ñượ theo sau bởi 20 ñầu kỵ nước. trình tự này mã hoá trực tiếp cho protein và ñược phân cắt sau vị trí lysine 25. kết quả là LLO ñược bắt ñầu từ amino axit thứ 26 và có trọng lượng phân tử là 55.8kDa, dài 504 axit amin. _ LLO thuộc nhóm ñộc tố gắn lên cholesterol ñược hoạt hoá bởi nhóm thiol ñược tạo ra ở hầu hết các vi khuẩn Gram (+). _ Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan ñến pH của môi trường. Nó hoạt ñộng cao nhất ở pH 5.5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7.0. Sự phát hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của Listeria monocytogenes. Sau quá trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hoá LLO. Chính ñộc tố này xúc tiến quá trình ly giải không bào và vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất, trong khi ñó pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO. 2.2.6.3. Vai trò của yếu tố ñộc lực. _ Listeria monocytogenes tồn tại trong môi trường ña dạng như: môi trường sống bao gồm ñất, nước, thức phẩm, ñộng vật. Gen prfA quy ñịnh sự biểu hiện của các gen có tính ñộc ñó. Bên ngoài tế bào chủ, gen prfA tồn tại ở 20 trạng thái hoạt ñộng thấp. Khi ở bên trong tế bào chủ, gen prfAkích hoạt (prfA*) và biểu hiện các gen cần thiết cho cuộc xâm nhập vào tế bào chủ. _ Listeria monocytogenes xâm nhập vào tế bào của cơ thể vật chủ thông qua cơ chế thực bào. Nếu Listeria monocytogenes vẫn còn sống sau giai ñoạn ñầu xâm nhiễm này, nó ñược cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt ñượ gọi là internalin A (inlA) và internalin B (inlB). InlA tương tác với e- Carherin tạo ñiều kiện cho Listeria monocytogenes ñi vào tế bào biểu mô, InlB nhận diện Clq-R ( hoặc Met) cho phép Listeria monocytogenes xâm nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ. Sauk hi xâm nhiễm ñược vào tế bào vật chủ, Listeria monocytogenes phân giải không bào tạo ra các lỗ trên màng tế bào và hoạt giải ñộc tính lưu huỳnh PI-PLC kết hợp với PC- PLC, giúp LLO phân giảikhông bào. 21 Hình 2.5. Cơ chế xâm nhập vào tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes. 22 _ Sau khi phân giải không bào, Listeria monocytogenes ñược phóng thích vào cytosol, tại ñây chúng phát triển và nhân lên, trong giai ñoạn này ñòi hỏi phải có protein bề mặt khác như ActA ñể nó di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác, và tổng hợp actin. ðuôi actin cho phép vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ khác, nó phụ thuộc vào hoạt ñộng của PC-PLC và Mpl. 2.2.7. Bệnh và triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. 2.2.7.1. Bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. - Nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai:
Hội chứng này xuất hiện trong khoảng một phần ba các trường hợp nhiễm Listeria mặc dù tỷ lệ này có thể cao hơn nhiều trong các ñợt dịch. Hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn ñều xãy ra vào 3 tháng cuối của thai kỳ. ða số phụ nữ mang thai bị nhiễm Listeria monocytogenes có dấu hiệu: sốt , mệt mỏi và ñau lưng, có khi thấy bị tiêu chảy, ñau bụng, buồn nôn hoặc nôn trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn. Vi khuẩn có thể lây truyền qua rau thai dẫn ñến nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng ñệm và màng ối, sinh non, hoặc bệnh khởi phát ở giai ñoạn sớm ở những trẻ mới sinh. Phụ nữ nhiễm bệnh dễ bị sãy thai tự nhiên. Trẻ sơ sinh tuần lễ ñầu tiên khởi phát bệnh với những dấu hiệu nhiễm khuẩn, khó thở, những tổn thương ở da, hội chứng u hạt nhiễm khuẩn ñặc trưng bởi những ổ áp-xe rải rác ở gan, lách, tuyến thượng thận, phổi và những cơ quan khác. Nếu nhiễm khuẩn bào thai ở giai ñoạn sớm thường ñi kèm với những biến chứng sản khoa như : sinh non và viêm màng ñệm và màng ối. − Nhiễm Listeria ở trẻ sơ sinh: 23
Gần giống như các trường hợp nhiễm khuẩn liên cầu nhóm B ở trẻ sơ sinh, nhiễm Listeria ở trẻ sơ sinh có thể ñược chia thành hai nhóm khởi phát sớm và muộn. Khởi phát sớm là biểu hiện nhiễm khuẩn trong vòng 5 ngày, nhất là khoảng 48 giờ sau sinh. Bệnh khởi phát muộn thì phát bệnh sau 5 ngày từ khi sinh, trung bình là 14 ngày. Tỷ lệ tử vong cao tới 60% cho nhóm khởi phát sớm và 25% cho nhóm khởi phát muộn.
ða số các trường hợp bệnh khởi phát sớm bị truyền nhiễm Listeria monocytogenes từ trong tử cung qua nguồn vi khuẩn trong máu mẹ. Nhiễm khuẩn từ âm ñạo là cực kỳ hiếm gặp. Biểu hiện kinh ñiển của bệnh khởi phát sớm là bệnh u hạt nhiễm khuẩn ở trẻ sơ sinh vời ñặc tính là có u hạt rải rác ở một số cơ quan nội tạng. Mặc dù biểu hiện ñiển hình hơn của dạng bệnh này là nhiễm khuẩn huyết kèm theo viêm phổi và viêm màng não. Có thể có ban sần và ban dạng gờ nhú. Trên thực tế thường khó phân biệt giữa bệnh Listeriosis khởi phát sớm và các thể khác của nhiễm khuẩn trẻ sơ sinh trên các bệnh cảnh lâm sàng ñơn ñộc.
Trái ngược với thể khởi phát sớm của bệnh này, trẻ sơ sinh có khởi phát muộn thường biểu hiện khỏe mạnh lúc trẻ mới sinh. Người ta cho rằng trẻ sơ sinh bị vi khuẩn ngay từ lúc mới sinh, nhưng do các yếu tố chưa biết nào ñó, việc khởi phát bệnh bị chậm lại. Cũng giống như vậy, nhưng các trường hợp nhiễm khuẩn do nhiễm trùng bệnh viện xãy ra sau khi trẻ ñược sinh ra dã ñược ghi nhận trong nhiều báo cáo về các nhóm nhiễm Listeria khởi phát muộn. Bệnh khởi phát muộn hay có viêm màng não hoặc viêm não màng não (ở 90% các trường hợp). Khởi phát muôn thường âm thầm hơn so với thể bệnh khởi phát sớm với những triệu chứng thường gặp như trẻ bú kém hoặc bỏ bú, khó chịu và sốt. 24 - Nhiễm Listeria ở người trưởng thành.
Nhiễm Listeria ở người trưởng thành thường gặp trên các bệnh cảnh suy giảm miễn dịch, ñặc biệt khi hệ miễn dịch của tế bào bị suy giảm như trong u hệ lympho, các hệ thống ñiều trị chống thải ghép trong các ca ghép cơ quan nội tạng hoặc ghép tủy xương tự thân hoặc cùng loài, khi ñó bệnh xãy ra ñiển hình dưới dạng một biến chứng muộn. Ngay trong thời kỳ ñầu của ñại dịch AIDS, Listeria monocytogenes không ñược coi là tác nhân gây bệnh quan trọng với bệnh nhân nhiễm HIV, và có một số ý kiến giải thích khá thuyết phục cho hiện tượng này như hoạt tính kháng Listeria của cotrimoxazole ñược dùng trong ñiều trị dự phòng nhiễm Pneumocystis jiroveci trước ñó. Những nghiên cứu gần ñây lại cho thấy, nhiễm Listeria xãy ra ở bệnh nhân dương tính với HIV cao hơn 150-300 lần so với nhóm ñối chứng. Những bệnh mạn tính khác như nghiện rượu và tiểu ñường cũng là ñiều kiện thuận lợi cho việc lây nhiễm Listeria monocytogenes.
Nhiễm Listeria tiến triển ở người trưởng thành có thể ñược xếp thành ba nhóm tùy theo các biểu hiện lâm sàng: bệnh liên quan ñến hệ thống thần kinh trung ương (CNS) chiếm khoảng 75% các trường hợp, nhiễm khuẩn huyết nguyên phát và nhóm các loại khác bao gồm phổ rộng các loại nhiễm trùng tại chỗ. - Nhiễm khuẩn hệ thần kinh:
Viêm màng não có hoặc không có dấu hiệu thần kinh cục bộ là biểu hiện hay gặp nhất của nhiễm Listeria hệ thần kinh trung ương. Giống như các trường hợp viêm màng não mủ khác, viêm màng não do Listeria thường khởi phát cấp tính với sốt cao, cứng gáy và sợ ánh sáng, nhưng có thêm 25 các rối loạn vận ñộng như run rẩy hoặc mất khả năng ñiều hòa. Co giật cũng thường hay xuất hiện hơn so với các thể khác của viêm màng não.
Biểu hiện của viêm màng não hay gặp nhất của nhiễm Listeria hệ thần kinh trung ương là viêm màng não, thường hay ảnh hưởng nhất ñến vùng não sau. Thể này có tiến triển theo kiểu hai thì ñiển hình: tiền triệu chứng không ñặc hiệu như ñau ñầu, buồn nôn, nôn và sốt, tiếp ñó là liệt dây thần kinh không ñối xứng tiến triển, các dấu hiệu tiểu não hoặc liệt nhẹ nửa người và suy giảm ý thức. Tiên lượng bệnh xấu, tỷ lệ di chứng thần kinh cao ở các trường hợp sống sót. Nguồn gốc nhiễm khuẩn thần kinh là từ nhiễm khuẩn huyết, không có bằng chứng cho thấy là lây bệnh từ những vị trí nhiễm bệnh khác. - Nhiễm khuẩn huyết:
Nhiễm khuẩn huyết nguyên phát là biểu hiện hay gặp thứ hai trong nhiễm Listeria tiến triển ở người lớn tuổi không mang thai, khoảng 25-50% các trường hợp. Không có ñặc ñiểm lâm sàng phân biệt cho thể hiện nhiễm Listeria này. Bệnh nhân có thể bị tụt huyết áp nặng với bệnh cảnh lâm sang tương tự như trong shock nôi ñộc tố vi khuẩn Gram âm, là trường hợp có thể kèm theo hội chứng suy giảm hô hấp ở người lớn. - Viêm màng trong tim xãy ra trên các van tim ñã có tổn thương từ trước, hay gây tình trạng nghẽn mạch hệ thống. - Viêm dạ dày ruột cấp tính gây tiêu chảy ở những người bị suy giảm miễn dịch. - Nhiễm khuẩn ở ñộng vật:
Trong số các ñộng vật, bệnh do Listeria monocytogenes tác ñộng chuyên biệt trên gia súc, cứu và dê với thời gian ủ bệnh từ 2-6 tuần. ðộng vật bị 26 nhiễm Listeria monocytogenes chủ yếu là qua thức ăn bị nhiễm Listeria monocytogenes, qua ñường hô hấphoặc do tiếp xúc trực tiếp. Sự phát bệnh xãy ra kèm theo sự suy giảm miễn dịch ñối với tác nhân gây bệnh do các yếu tố gây stress (mang thai, sự ñông ñúc, sự vận chuyển, ñiều kiện môi trường kém). ðộng vật bị nhiễm bệnh do Listeria monocytogenes thường sốt, biếng ăn, suy nhược và bị mất phương hướng. 2.2.7.2. Các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. - Các triệu chứng của Listeriosis thường bắt ñầu xuất hiện vài ngày sau khi ăn uống phải các loại thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, có một số trường hợp thời gian kéo dài ñến 2 tháng mới xuất hiện các dấu hiệu ñầu tiên của bệnh. Các dấu hiệu và triệu chứng của bệnh thường gặp là: tiêu chảy, sốt 380C ( 100,40F) hoặc cao hơn, ñau các cơ, có các cơn ớn lạnh hoặc rung mình buồn nôn. - Nếu xuất hiện tình trạng nhiễm Listeria vào hệ thần kinh, một số các dấu hiệu bệnh và triệu chứng cũng gần tương tự với nhiễm Listeria khu trú. Bao gồm: sốt, ñau các cơ và các cơn rung mình, ớn lạnh nhưng chúng thường diễn biến nặng hơn các triệu chứng và bệnh lý thường có ở tình trạng lan tỏa. Có những thay ñổi về tâm thần. Có xáo trộn về mặt nhận thức và tinh thần, có cơn co giật, nhứt ñầu, mất thăng bằng, ñau ở cổ ( cổ có thể bị cứng, khó chuyển ñộng), có cơn ñộng kinh, mất kiểm soát vận ñộng các chi. 2.2.8. Cơ chế gây bệnh. 27 Hình 2.6. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Listeria monocytogenes. - Từ lâu, các nhà khoa học ñã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người. - Sau khi xâm nhập vào cơ thể qua ñường tiêu hóa, Listeria monocytogenes tiếp tục di chuyển qua dạ dày rồi ñi vào các mô ở ruột non của vật chủ, bao gồm các tế bào biểu mô và các ñại thực bào của mảng Peyer. Trong suốt quá trình di chuyển chúng sẽ không gây ra những thương tổn mô học 28 nếu liều lượng không ñủ lớn. Trong dịch lympho hoặc máu thì Listeria monocytogenes di chuyển rất nhanh ñến hạch bạch huyết, lá lách và gan rồi nhanh chóng ñi sâu vào không bào, hầu hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy không bào nhờ kết hợp với pH thấp, các enzyme thủy phân và oxy hóa trong không bào. - Từ không bào chúng sẽ dy chuyển vào tế bào chất và nhân lên trong vòng 30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40-60 phút ở trong tế bào gan và ñại thực bào. Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thành sau 5-7 ngày. Tuy nhiên, nếu không ñạt ñược ñáp ứng ñược miễn dịch ở tế bào bạch huyết CD8+ và gamma, interferon gián tiếp hoạt hóa ñại thực bào. Nếu tế bào của vật chủ không tạo ra ñủ ñáp ứng miễn dịch thì Listeria monocytogenes sẽ di chuyển ñến các vị trí khác trong cơ thể như não và nhau thai. Gây ra hiện tượng sẩy thai ở phụ nữ, các dị tật bẩm sinh ở trẻ em, viêm màng não, gây tử vong cho thai nhi. - Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóngtạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và ñẩy sang tế bào liền kề. Khi ñó, vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề ñó. - Giáo sư Ireton và nhóm của ông ñã phát hiện ra một quá trình thứ hai hổ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh mà trước ñây chưa ñược biết ñến. Qúa trình này dần dần ñã làm suy yếu khả năng tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh của tế bào thứ hai. Vi khuẩn Listeria di chuyển qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người sử dụng một phần khung của tế bàogọi là sợi actin. Vi khuẩn Listeria có màu xanh và sới actin có màu ñỏ. Sợi actin hình thành một cấu trúc dạng ñuôi phía sau vi khuẩn. Những sợi 29 actin này, có tác dụng ñẩy vi khuẩn Listeria qua tế bào chất của té bào trong cơ thể người. - Màng tế bào hay lớp ngoài cùng của tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra. Tình trạng căng ñó kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn Listeria không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề. - Tuy nhiên phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại protein trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm ñi ñộ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, ñiều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn ñể xuyên thủng màng tế bào và sau ñó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn. Phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton cũng ñưa ra bản báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm ñộ căng là ngăn chặn chức năng protein Tuba trong cơ thể người. Thông thường, chức năng của Tuba trong tế bào người không nhiễm bệnh là tạo ra ñộ căng của màng tế bào. Protein InIC trong vi khuẩn Listeria ñã khống chế sự hoạt ñộng của Tuba, làm giảm ñộ căng và giúp vi khuẩn lây lan sang các tế bào liền kề. Vi khuẩn mang mầm bệnh có thể lây lan bằng cách kiểm soát ñộ căng của màng tế bào trong tế bào người. 2.2.9. Tình hình nhiễm listeria monocytogenes ở Việt Nam và trên thế giới. - ðến những năm 1980, thực phẩm ñược coi là tác nhân chính gây truyền nhiễm Listeriosis. - Vào những năm 1981, tại Canada , một trận ñại dịch từ thực phẩm ñã làm ảnh hưởng ñến 41 bệnh nhân là do ăn phải cải bắp lây nhiễm từ các phân tử cừu bị nhiễm bệnh. - Vào năm 1983, ở Boston có 49 người bị nhiễm bệnh Listeriosis do tiêu thụ phải sữa không ñược tuyệt trùng kỹ lưỡng. 30 - Năm 1985, các trận dịch bệnh lớn xãy ra ở Bắc Mỹ tại California bắt nguồn từ phomat mềm có 142 người bị nhiễm, những phomat khác gây ra 122 trườnghợp bị nhiễm Listeriosis ở Switzerland. Trong khi ở Anh, có 300 trường hợp bị nhiễm trùng Listeriosis. - Những năm 1990, ở Pháp dịch bện xãy ra do ăn phải lưỡi lợn, thịt lợn, phomat mềm bị nhiễm khuẩn. - Trong thời gian vừa qua, trước tình hình số lượng các mẫu cá tra ñông lạnh bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes ngày càng gia tăng, thực hiện chỉ ñạo của lãnh ñạo bộ, cục quản lý chất lượng nông lâm thủy hải sản (NAFIQAD) ñã có quyết ñịnh thành lập nhóm công tác chủ trì thực hiện ñề tài khoa học cấp cơ sở “Xác ñịnh nguyên nhân lây nhiễm và ñề xuất giải pháp kiểm xoát mối nguy hiểm Listeria monocytogenes trong sản phẩm cá tra ñông lạnh”. Ngày 6/11/2009, cục ñã tổ chức hội nghị nghiệm thu ñánh giá kết quả thực hiện ñề tài. - Theo số liệu các kết quả phân tích của ñề tài cho thấy 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu ñược lấy tại các nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán thành phẩm) bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes. - Vào ngày 19/3/2007, cơ quan quản lý thực phẩm Anh quốc có lệnh thu hồi các loại bánh mì kẹp thịt, do công ty thực phẩm Anchor cung cấp cho hệ thống bệnh viện và trường học tại Luân ðôn, do sản phẩm này bị nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes. - ðây không phải là lần ñầu, mà từ nhiều năm qua vi khuẩn này ñã gây ra các vụ ngộ ñộc thực phẩm lớn tại một số quốc gia trên thế giới (Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ…..). Chúng ta có thể ñiểm qua vài vụ ngộ ñộc ñiển hình 31 như sau: Vào tháng 12 năm 1999, tại Pháp có vụ ngộ ñộc do ăn phải hamburger có nhiễm vi khuẩn Listeria gây cho 27 người mắc bệnh. Trong ñó, có 7 người chết. Theo thống kê của Mỹ, hàng năm số bệnh lây nhiễm Listeria khoảng 2500 người, với gần 500 người chết. Thống kê tại Anh từ năm 2001-2005 có 1933 người mắc bệnh do vi khuẩn Listeria gây ra… - Trong những năm qua, những con cá hun khói, và bơ có liên quan ñến dịh Listeriosis do vi khuẩn Listeria gây ra tại Thụy ðiển và Finland. - Cơ quan hữu quan các nước trên từng cảnh báo về loại vi khuẩn này. ðồng thời cũng ñề ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt nguồn nguyên liệu thực phẩm. Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ gây ra ngộ ñộc thực phẩm mà quan trọng hơn là chúng gây ra các bệnh lý nguy hiểm như xảy thai, viêm màng não, nhiễm trùng huyết. Thường giai ñoạn ủ bệnh từ vài ngày ñến 2 tháng. Chính vì vậy, người ta thường không nhận biết ñược ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này. Dấu hiệu khởi phát của bệnh là có sốt, khó chịu, ñau lưng. Nếu ñộc tố ñủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ ñộc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng nôn mủa, tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu…. 2.2.10. Nguyên tắc ñiều trị. - Mặc dù trên invitro cho thấy còn nhạy cảm với nhiều thuốc (trừ Cephalosporin và Fosfomycin), kết quả ñiều trị bằng liệu phápkháng sinh trong bệnh nhiễm Listeria tiến triển thường không tốt, một phần do sự chậm chễ trong việc bắt ñầu ñiều trị bằng kháng sinh thích hợp khi chưa ñưa ra ñược chẩn ñoán sớm trong quá trình bệnh và một phần do nhiều bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch. Hơn nữa, Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn ký sinh nội tế bào không bắt buộc, và 32 nhiều thuốc kháng sinh có khả năng thâm nhập bên trong tế bào kém. Thậm chí nếu có thể thâm nhập ñược, các thuốc này có thể không ổn ñịnh hoặc giảm hoạt tính trong ñiều kiện môi trường này. - Khả năng thâm nhập nội bào kém và nhiều ý kiến cho rằng các β-lactam chỉ có khả năng kìm khuẩn ñối với Listeria monocytogenes, nhưng các aminopenicillins, amoxicillin và ampicillin ñược cho là các thuốc thích hợp trong các trường hợp Listeria xâm nhiễm làm gây bệnh Listeriosis. Mặc dù phải dùng ở liều cao hơn so với bình thường (8-12g/ngày, chia 2 lần). Nhiều tác giả khuyến cáo nên sử dụng thêm một aminoglycoside, như gentamicin 5-7mg/kg/ngày. Các mô hình ñộng vật thực nghiệm sử dụng ampicillin gắn liposomal hoặc phân tử nano cũng cho kết quả khả quan mặc dù hiện tượng này vẫn ñược ñánh giá lại trên lâm sàng. - Thời gian tối ưu của liệu pháp kháng sinh cho bệnh Listeriosis vẫn chưa ñược xác ñịnh, ñiều này phụ thuộc vào nhiều biểu hiện lâm sàng khác nhau và các ñiều kiện thuận lợi ñể gây bệnh, nhưng nói chung ñược khuyến cáo tối thiểu là 2 tuần trong nhiễm khuẩn nguyên phát và nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai ít nhất 3 tuần với viêm màng não và bệnh ở trẻ sơ sinh. Liệu trình ngắn hơn có thể làm bệnh tái phát. Viêm màng trong tim có thể cần ñược ñiều trị tối 6 tuần. - Với những bệnh nhân không dung nạp với ampicillin +/- aminoglycoside, cotrimoxazole ñược coi là liệu pháp thay thế chấp nhận ñược. - Việc lựa chọn kháng sinh cho bệnh nhân trong trường hợp không dung nạp với cả ampicillin và cotrimoxazole là một vấn ñề khó khăn. ðiều trị bằng Vancomycin cũng cho kết quả kém, và mặc dù các thuốc khác như carbapenem, fluoroquinolone thế hệ mới hơn, linezelid và 33 quinupristin/dalfopristin có hoạt tính tốt trên invitro chống lại Listeria monocytogenes, nhưng kinh nghiệm với những thuốc này trên lâm sàng vẫn còn rất hạn chế. - Kháng kháng sinh mắc phải ở các chủng phân lập trên lâm sàng tương ñối hiếm gặp, mặc dù kháng tetracycline ở các chủng mang gen tetM ñã ñược ghi nhận với khả năng kháng thuốc qua plasmid. Với nhiều loại kháng sinh khác cơ chế ñể kháng qua trung gian plasmid cũng ñã ñược ghi nhận. 2.2.11. Cách phòng ngừa. - Giữ thức ăn ngoài giới hạn của vùng nhiệt ñộ nguy hiểm từ 40C ñến 600C. - Thức ăn nào cần giữ lạnh thì phải giữ ở nhiệt ñộ 40C hoặc thấp hơn, còn những thức ăn nóng thì phải giữ ở nhiệt ñộ trên 600C trở lên. - Nấu chín toàn bộ thức ăn tươi có nguồn gốc từ ñộng vật. - Giữ vệ sinh tối ña lúc nấu nướng hay chuẩn bị bữa ăn. Chùi rữa dụng cụ, dao, thớt bằng dung dịch Javel pha loãng trong nước. - Cẩn thận với các loại cá và ñồ biển hun khói. - Rửa tay bằng savon. - Thường xuyên chùi rữa, tẩy trùng tủ lạnh. - Không nên dung thực phẩm có mùi lạ. - Không dung thực phẩm quá thời hạn sử dụng. - Không ñể thực phẩm tươi sống chung với thức ăn ñã nấu chin. - Thức ăn nấu chín dung ngay không ñể lâu ngày trong tủ lạnh. - Rữa kỹ thức ăn trước khi sử dụng. - Giữ thức ăn ñã ñược nấu chín tách biệt khỏi rau, thực phẩm chưa chế biến. 34 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ðỊNH VI KHUẨN L.MNOCYTOGENES. 3.1. Phương pháp xác ñịnh truyền thống. 3.1.1. Nguyên lý và phương pháp. − Sử dụng phương pháp cấy ñếm Listeria monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt ñộ 300C trong 48h. chọn các khuẩn lạc nghi ngờ khẳng ñịnh Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa. 3.1.2. Phạm vi phát hiện vi khuẩn. − Phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn Listeria monocytogenes trong thủy sản. 3.1.3. Dụng cụ sử dụng. − Mẫu thực phẩm cần kiểm tra. − Bình tam giác 500ml, ống lên men (Durham). − Tủ ấm 30-500C. − Que cấy vòng. − Que cấy thẳng. − Kính hiển vi. − ðĩa petri. − Pipettes 25,10 và 1ml. − ống nghiệm có nắp ñậy. 3.1.4.Môi trường ñể nuôi cấy. - Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichment Broth I(LB I). - Canh tăng sinh thứ cấp Listeria Enrichment Broth II (LB II) 35 - Môi trường Enrichment Broth (EB) cải tiến từ môi trường LB, ñược sử dụng trong môi trường tăng sinh từng giai ñọan. - Môi trường Oxford Agar, nôi trường Palcam Agar. - Thạch máu. - Môi trường thạch mềm BHI. - Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR). - Thuốc thử catalase, oxidase. 3.1.5.Quy trình phân tích vi khuẩn Listeria Monocytogenes. 3.1.5.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes. 36 Thạch mềm, ủ ở 250C, 25-48h Thạch máu, ở 370C,2 4-48h Soi canh khuẩn BHI ñã ủ ở 250C Canh RPR, ủ ở 370C, 48 giờ Thử nghiệm Catalas e. CAMP với S.aureus và R.equi Tan máu yếu Di ñộng hình dù trong thạch mềm Âm tính Dương tính Dương tính Chuyển ñộng xoay tròn Kết luận: Listeria monocytogenes (+)/(-) trong 25 mẫu thử nghiệm Canh XPR, ủ ở 370C, 48 giờ Thử nghiệm Oxydase S.aureus (+), r.equi (-) Âm tính Sơ ñồ 3.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes. ðồng nhất 25g mẫu trong 225ml LB I, ủ ở 300C, 24h. Cấy 0.1ml canh khuẩn sang 10ml môi trường LB II ủ