Khóa luận Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

ïc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng. Agarose là vật liệu ổn định, đồng nhất và dễ dàng tạo hạt. Tuy nhiên do vấn đề giá cả nên chỉ được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu và vì mục đích y học Cellulose và các dẫn xuất của chúng như CM – cellulose, DEAE – cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẽ nhưng lại không đồng nhất và ổn định nên chỉ được sử dụng ở dạng sợi và vi hạt. Alginate, carragenan là hai vật liệu khá mới mẻ. Các vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào, enzyme. Tuy nhiên gel của hai loại vật liệu này đều không ổn định trong môi trường có phosphate. Tinh bột là vật liệu rất phong phú và rẻ tiền. Từ lâu, tinh bột dùng để đóng gạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzyme như là lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase, .. . tuy nhiên, có nhược điểm là độ trương nở còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng vì vậy khả năng cố định và hoạt tính của enzyme còn thấp. Chitin và chitosan là một vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố định enzyme và tế bào. Chitin và chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường dùng để cố định enzyme qua cầu nối glutaraldehyte và sodiumtripolyphosphate, ferrocianur potassium, .. .. cả chitin và chitosan đều có một nhược điểm là tính chất kỵ nước, độ trương nở kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ. Chất mang là proteine thường dùng như gelatin, keratin, albumin. Vật liệu thuộc nhóm này thường dễ tạo màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là NH2 vì vậy thường được sử dụng nhốt enzyme trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyte. Nhưng có nhược điểm là thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn, hay gây ra các phản ứng miễn dịch với cơ thể khi sử dụng trên người và động vật. Chất mang là các polymer tổng hợp: Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định enzyme như polyacrylamide, polyester, polyvinyalcohol, polyvinyacetate, polyacrylic, polystyrene, polyethylene ghép với vinyl monomer, … ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương nở tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước siêu lỗ, … tuy nhiên các polymer tổng hợp cũng bộc lộ những nhược điểm nhất định như: một số có giá thành cao như polyacrylic, polyacrylamide; có khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững không thể phân huỷ trong tự nhiên vì vậy gây ô nhiễm môi trường. Chất mang vô cơ: ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang còn có một số chất mang vô cơ đã được xử dụng thương mại như sợi bông thuỷ tinh, silicum oxide, alluminium oxide, magnesium oxide. Đây là những dạng oxide có cấu trúc siêu lỗ và có khả năng hấp phụ tốt. Nhược điểm của các vật liệu này là tan trong dung dịch kiềm có pH lớn hơn 7.5 2.9.4 Phương pháp cố định a) phân loại Dựa vào bản chất các liên kết tạo thành giữa chất mang và enzyme, người ta chia thành hai phương pháp cố định: phương pháp vật lý (liên kết vật lý) và phương pháp hoá học (liên kết đồng hoá trị). Theo Scouten và Gerhartz, có bốn phương pháp cố định enzyme là: Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) Phương pháp hấp thụ vật lý (physical adsorption) Phương pháp nhốt (entrapment) Phương pháp khâu mạch ( cross – linking). Phương pháp tạo enzyme không hoà tan Phương pháp nhốt Nhốt trong cấu trúc mạng gel: Đây là phương pháp khá đơn giản, enzyme ít bị biến đổi qua quá trình cố định. Để gói enzyme vào trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hoá các gel khi có mặt đồng thời enzyme. Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp người ta thu được enzyme bị nhốt trong các lỗ gel. Gel đã có enzyme có thể nghiên nhỏ bằng cách đồng hoá hoặc ép qua rây có lỗ nhở rồi đem sấy ở nhiệt độ thấp. Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1993) thu được bằng cách trùng hợp acrylamine với N, và nN – metylenbisacrylamine. Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng hợp thu được dễ tạo thành hạt và tuỳ vào điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác nhau. Alginate và carragennan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuận lợi để gói enzyme và tế bào. Canxialginate là một trong những vật liệu thích hợp cho phương pháp nhốt enzyme, hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt. Dạng các sợi tổng hợp: Phương pháp này được thực hiện bằng việc trộn enzyme vào chất mangm tạo dịch lỏng, cho dịch lỏng này chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chế sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp ở các màng. Phương pháp này được Dinelli (1972) tiến hành giống như tạo sợi celluloza triacetate trong methylen clorua và enzyme dạng dung dịch trong đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất của nitơ. Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào trong một cái bể đông tụ có chứa toluene, sau đó được làm khô trong chân không. Dạng bao vi thể: Enzyme được nhốt trong bao vi thể có màng bán thấm, màng này được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuyếch tán ra ngoài. Vì ezyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất lớn hơn so với trường hợp nhốt trong cấu trúc dạng gel. Dạng màng siêu lọc: Phương pháp này đơn giản tương tự như nhốt trong bao vi thể. Enzyme được giữ trong màng siêu lọc. Màng bán thấm này cho phép các cơ chất và sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp qua lại tự do, nhưng giữ lại enzyme có trọng lượng phân tử cao. 2.9.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme không hoà tan là: 2.9..5.1 Bản chất và tính chất hoá học của chất mang Các tính chất lý học của chất mang như tính hoà tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước, .. đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền, và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hoá học của chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tơi khả năng chất mang hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng. Dẫn xuất enzyme không hào tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme hoà tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế biến tính của enzyme trong dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen và liên kết kỵ nước. Sự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác. 2.9.5.2 Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu tố Kích thước lỗ gel của chất polymer. Trọng lượng phân tử của cơ chất. Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do. Trong vấn đề này, đường kính lỗ của chất mang polymer và trọng lượng phân tử của cơ chất đóng vai trò hàng đầu. Song những hạn chế khuyếch tán không đơn giản như vậy bởi vì còn có sự khác biệt nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do. 2.9.5.3 Aûnh hưởng của pH lên enzyme không hào tan Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của enzyme cố định. pH tối ưu của enzyme hoà tan, sự chuyển dịch pH tối ưu là do ảnh hưởng của trường tĩnh điện của chất mang tạo nên. 2.9.6 Ưùng dụng của enzyme cố định Trong công nghiệp: Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hoá chất, … Rượu bia: các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn. Chế biến sữa: enzyme lactase cố định để thuỷ phân lactose sữa. Năm 1969, Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định Năm 1971, đã sử dụng chymotrypsin liên kết cộng hoá trị với carboximethyl cellulose làm đông tụ sữa thay cho remin đắt tiền. Trong y học: Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu. Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Do đó, cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ. Enzyme cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh. Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như: lượng glucose, urea, cholesterol, … enzyme horse radish peroxidase cố định trên polystyrene cùng với kháng thể, giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kỹ thuật ELISA). Trong nghiên cứu khoa học: Năm 1967, điện cực enzyme đầu tiên đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoseoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt có gel polyacrylamide. Nhúng điện cực vào dung dịch có glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuyếch tán vào gel có chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ của phản ứng và nồng độ glucose. Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử proteinem sử dụng trong phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc hiệu vơi enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng chế phẩm tế bào cố định để xử lý nước thải đạt hiệu quả. Trong bảo vệ môi trường: Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu bia, chế biến đường, .. chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu hữu cơ. Do đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lý nước thải sinh học nhằm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra môi trường bên ngoài. 2.9.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thuỷ phân bằng enzyme a. Aûnh hưởng nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm b. Aûnh hưởng của nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng. Với từng loại enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng. Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thuỷ phân một cơ chất cụ thể, trong điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme. c. Aûnh hưởng của các chất kiềm hãm và các chất hoạt hoá Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hoá) hoặc làm giảm (chất kìm hãm) hoạt độ enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu và thay đổi tuỳ từng chất, tuỳ từng enzyme. Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hoá bởi enzyme. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein. Chất hoạt hoá là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất này thường có bản chất hoá học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hoá có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. d. Aûnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng của enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt qua giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đưa nhiệt độ lên quá cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 00C enzyme bị hạn chế rất mạnh, như khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp. Ơû nhiệt độ thấp (0 – 410C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng. Ơû nhiệt độ sau đó (tuỳ thuộc vào từng loại enzyme, ở khoảng 450C), vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80 – 1000C. Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường. e. Aûnh hưởng của pH môi trường pH của môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thuỷ phân vì nó ảnh hưởng đến mực độ ion hoá cơ chất, ion hoá enzyme và đến độ bền của protein – enzyme. Đa số enzyme bền trong khoản từ pH 5 – 9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền như: cơ chất, Coennzyme, Ca2+ ... Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ ... Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepxin, protease acid của vi sinh vật, .. .) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10. f. Aûnh hưởng của thời gian thuỷ phân Trong quá trình thuỷ phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ, .. . thời gian thuỷ phản cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết trong quá trình thuỷ phân. Khi cơ chất cần thuỷ phân thuỷ phân hết, quá trình thuỷ phân kết thúc. Thời gian thuỷ phân thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chât lượng sản phẩm tốt. Trong thực tế, thời gian thuỷ phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thuỷ phân cụ thể. g. Aûnh hưởng của lượng nước Với phản ứng thuỷ phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng. Nước có ảnh hưởng đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thuỷ phân bởi enzyme. Vì thế, nước là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thuỷ phân bởi enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế các phản ứng do enzyme xúc tác. Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thời gian: đề tài được thực hiện từ tháng 04 năm 2010 đến tháng 05 năm 2010 Địa điểm: phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học – Viện Sinh Học Nhiệt Đới 3.2 Vật liệu 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm Vỏ đầu tôm dùng trong thí nghiệm được thu từ các công ty chế biến thuỷ sản. Vỏ đầu tôm đem về được rửa sạch, đem phơi khô 3 nắng sau đó sấy khô giòn ở 600C. tiếp theo đem xay nhỏ đến kích cỡ 2 – 4 mm, bỏ trong bao PE và bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát để làm nguyên liệu sản xuất chitosan Cám mì, cám gạo, bã đậu nành, trấu, lúa mua ở chợ, giống Aspergillus Oryzae được cung cấp từ Viện Sinh Học Nhiệt Đới 3.2.2 Thiết bị Các thiết bị chủ yếu được sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm: Cân điện tử 2200g, độ chính xác 10-6 Máy đo quang phổ UV – Vis Máy ly tâm lạnh Máy đo pH Bể ổn nhiệt Bộ chưng cất đạm Kjeldahl Tủ sấy Máy xay sinh tố Ống nghiệm và giá ống nghiệm Phễu lọc và giấy lọc Pipet thuỷ tinh 1ml, 2ml, 5ml,10ml, 25ml Becher và erlen các loại 3.2.3 Hoá chất Hoá chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm Hình a Hình b Hình c Hình d Hình e Hình f hình g Hình 3.1 một số dụng cụ thực hiện thí nghiệm a máy lắc; b máy đo pH; c, d cân phân tích; e bể ủ nhiệt; f, g máy ly tâm 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford a) Nguyên tắc Protein khi phản ứng với Coomassie (coomassie brilliant blue – CBB) sẽ hình thành hợp chất có màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, ngoài ra phương pháp này còn dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian b) Hoá chất Thuốc nhuộm Bradford: hoà tan 5mg thuốc nhuộm coomassie brilliant blue G250 vào 23,5g cồn 960, thêm 42,5g H3PO4 85% và chỉnh tới 500ml bằng nước cất Dung dịch albumin 0.1mg/ml: cân 10mg albumin pha với nước cất thành 100ml Dịch mẫu protein: 1ml cho phản ứng c) Tiến hành thí nghiệm Bảng 3.1: xây dựng đường chuẩn albumin ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Dung dịch albumin (0.1mg/ml) (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Hút 1ml dung dịch protein pha loãng như bảng trên, thêm 2ml thuốc nhuộm Bradford, lắc đều. Sau đó để yên 10 phút rồi đo OD tại bước sóng 595 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (rOD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml) d) Xác định hàm lượng protein trong mẫu Tương tự hút 1ml protein cần phân tích thêm 2ml thuốc thử Bradford, để yên 10 phút đem đo OD tại bước sóng 595nm Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích (OD595* độ pha loãng của mẫu). 3.3.2. Định lượng protein theo phương pháp Biure a) Nguyên tắc Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540nm. Cường độ màu của phản ứng tỷ lệ với số lượng liên kết peptid (-CO – NH-) trong chuỗi polypeptide. Phương pháp biure được sử dụng đối với các mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn (>= vài mg/ml). b) Thực hành Nguyên liệu và hoá chất: dung dịch albumin tiêu chuẩn 1% Thuốc thử biure: CuSO4 1.5g. Tarkat kilium và natrium 6g. Nước cất 500ml. Lắc cho tan, cho thêm vào 300ml dung dịch NaOH 2.5N lắc đều. Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất cho đủ 1000ml. Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu nghiên cứu và 4ml thuốc thử biure, lắc đều, để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh. So màu ở bước sóng 540nm. Xác định mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. Lập đồ thị chuẩn, lấy sáu ống nghiệm, đánh số từ 1 – 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm như sau: Bảng 3.2 lập đồ thị chuẩn nồng độ protein STT Protein 1% (ml) H2O (ml) Thuốc thử biure (ml) Nồng độ protein (mg/ml) OD 1 0.0 1.0 4 0 2 0.2 0.8 4 2 3 0.4 0.6 4 4 4 0.6 0.4 4 6 5 0.8 0.2 4 8 6 1.0 0.0 4 10 Lắc đều, để yên các ống nghiệm trongg 30 phút ở nhiệt độ phòng. So màu dung dịch trong các ống ở bước sóng 540nm. Ghi nhận các giá trị mật độ quang. c) Tính kết quả Trị số quang của những ống chứng (từ ống 2 – 6) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (rOD) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml). tương tự vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml). 3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme (phương pháp Amano) a) Nguyên tắc Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme được biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thuỷ phân protein của enzyme b) Dụng cụ thiết bị Oáng nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc, bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ UV – Vis, máy đo pH. c) Hoá chất HCl 0.1M, Na2CO3 0.4M, dung dịch Trichloacetic (TCA 0.4M), tyrosin tinh khiết, thuốc thử Folin, đệm phosphate pH = 7 0.1M, dung dịch casein 1% d) Các bước tiến hành Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10,20 .., .., ..100 µg/ml dung dịch HCl Thêm 5ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào 1ml dung dịch Tyrosin đã pha trên. Thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp Trộn đều, để yên dung dịch ở 370C trong 20 phút Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả Đối với ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0.1M thay cho Tyrosin đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660nm ghi nhận kết quả Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 10 trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị rOD1 đến rOD10. vẽ đồ thị dựa vào sự biến thiên của rOD theo nồng độ protease, đồ thị này gọi là đường chuẩn Tyrosin Xác định hoạt tính enzyme protease Cho 1ml dung dịch casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 370C trong 10 – 15 phút Cho 1ml dịch chiết enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 370C trong 1 giờ Cho vào 2ml dung dịch TCA 0.4M để ngưng phản ứng của enzyme Để yên dung dịch trong 25 phút, lọc dung dịch này qua giấy lọc để loài tủa Hút 1ml dịch lọc Cho 5ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào 1ml dịch lọc Thêm vào 1ml thuốc thử Folin Trộn đều để yên ở 370C trong 20 phút Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm ghi nhận kết quả này là Am. Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả này là A0. e) Tính toán Nguyên tắc: hàm lượng tyrosin được giải phóng do enzyme protease thuỷ phân được tính bằng cách lấy (Am – A0 ) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosin để xác định hoạt độ protease. Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ta lượng amino acid tương đương với 100 g tyrosin trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0)*F*n*1/100. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – A0)*F*n*1/100*V/m. [(10/As10 – A0) + (20/As20 – A0) + .. .+ (50/As100 – A0)] F = 10 Trong đó: Am : độ hấp thu của mẫu A0 : độ hấp thụ của ống đối chứng F : hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng 660 nm trên đường chuẩn. n : hệ số pha loãng của enzyme 1/100 : hệ số chuyển đổi. V : thể tích của dung dịch enzyme m : khối lượng chế phẩm enzyme thô. 3.3.4 Xác định hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme Hoạt tính của dịch chiết enzyme đượ