Khóa luận Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizotonia solani gây bệnh khô vẳn lúa

càng nhiều và liên kết lại với nhau thành từng đám chồng chất lại với nhau với nhiều màu sắc khác nhau nên trông vằn vện nhƣ da cọp hoặc các vân mây. Phần trên vết bệnh mọc những sợi nấm màu trắng, có thể mọc ở phần thân trên mặt nƣớc lên trên cổ bông, sau đó xuất hiện nhiều khuẩn hạch còn non có màu trắng về già có màu nâu vàng kích thƣớc hạch lớn thƣờng có hình dẹt hoặc hình nhƣ trái đậu phộng.( Nguồn: www.mard.gov.vn) Trên đồng ruộng, các vết bệnh đầu tiên thƣờng xuất hiện trên những lá lúa ở gần mặt nƣớc. Khi điều kiện thích hợp cho sự phát triển bệnh, các vết bệnh sẽ phát triển trên cả bẹ lá và phiến lá, điều này thƣờng làm lá chết. Trong trƣờng hợp bệnh nghiêm trọng, tất cả các lá trên cây lúa sẽ bị chết. Ở các vùng nhiệt đới, bệnh đốm vằn thƣờng làm cho hầu hết các lá trên cây lúa đều bị chết (theo Ou, 1983). 2.2.2. Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh Mầm bệnh tồn lƣu trên đồng ruộng từ những cây lúa bị bệnh trong mùa trƣớc. Hạch của nấm nổi trên mặt ruộng trong quá trình làm đất. Nó có thể trôi giạt theo nƣớc và tiếp xúc với cây lúa, thông qua đó gây bệnh cho cây lúa. Nấm xâm nhập vào mô cây qua khí khổng hoặc có thể xuyên trực tiếp qua cutin (Ou, 1983). Thông thƣờng, nấm xâm nhập vào từ mặt trong của lá nhƣng đôi khi nấm cũng xâm nhập từ cả 2 mặt của phiến lá. Nấm có khả năng gây bệnh trong phạm vi nhiệt độ 23 - 350C, nhiệt độ tối thích là 300C- 320C, ẩm độ tƣơng đối 96 - 97% (theo Ou, 1983). Ngoài ra, khi đồng ruộng có lƣợng đạm quá cao sẽ kích thích 8 bệnh phát triển và lƣợng Kali quá thấp sẽ làm cho bệnh nặng thêm. Các cây lúa có tán rộng, bẹ dày sẽ ít nhiễm bệnh hơn so với các cây lúa thấp và có bẹ ngắn. Ngay sau khi các vết bệnh đầu tiên đã hình thành, sợi nấm mọc nhanh chóng trong cây lúa và các mô của chúng. Các vết bệnh sẽ phát triển ra 2 bên và lan rộng lên bên trên, sau đó, vết bệnh thứ 2 sẽ hình thành. Khi các vết bệnh còn non, các sợi nấm phát triển rất tích cực nhƣng đối với các vết bệnh đã bạc màu thì sợi nấm phát triển rất chậm. Bệnh có thể phát triển theo chiều ngang ( lây nhiễm sang cây bên cạnh) hoặc chiều đứng (bệnh phát triển từ gốc lên lá bông lúa). Bệnh phát triển càng cao thì năng suất sẽ càng giảm. Sự lây nhiễm chiều ngang của bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh nhƣ: nhiệt độ, ẩm độ, mật độ sạ, cấy lúa… Ngƣợc lại, sự phát triển dọc của bệnh phụ thuộc nhiều vào cây lúa nhƣ giống kháng, lƣợng N, K trong thân cây. (Nguồn: www.mard.gov.vn) 2.2.3. Phòng và chống bệnh khô vằn lúa Hiện nay vẫn chƣa có đƣợc những phƣơng pháp trừ nấm hoàn toàn hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. Tuy nhiên, có thể dùng nhiều biện pháp để phòng bệnh nhƣ: Làm sạch cỏ. Cày bừa, lật đất để vùi hạch nấm. Đốt rơm rạ sau khi thu hoạch. Sạ cấy với mật độ thích hợp. Bón cân đối N - P - K, không nên bón N nhiều và bón thúc muộn. Ngoài ra, ta có thể dùng các thuốc hoá học nhƣ: validacin, anvil, rovral, monceren, topsin-m, carbenzim… để trừ bệnh. Các loại nấm đối kháng với R. solani nhƣ Trichoderma spp cũng là một trong những sự lựa chọn tốt. (Nguồn: www.mard.gov.vn) 9 2.3. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng. Đó là nhóm của DNase, ghi nhận các trình tự đặc biệt của nucleotide, và cắt DNA tại vị trí rất đặc biệt. Ngƣời ta xem nó nhƣ là chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant). Nguyên tắc của phƣơng pháp RFLP: sự đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn (restriction enzyme), là phƣơng pháp tạo nên các đoạn cắt khác nhau phân biệt đƣợc bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn đƣợc gọi là các fingerprinting đặc trƣng cho từng phân tử DNA. Xử lý các mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn, các gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lƣợng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, còn những gen có cấu trúc hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. Quy trình của phƣơng pháp RFLP Quy trình phƣơng pháp RFLP thông thƣờng: - Tách chiết và tinh sạch DNA. - Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi cùng một enzyme cắt giới hạn. - Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot. Quy trình phƣơng pháp RFLP dựa trên PCR (phƣơng pháp RFLP-PCR): - Tách chiết DNA tổng số. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích. - Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. - Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã đƣợc cắt. Phƣơng pháp này đã đƣợc rất nhiều ngƣời sử dụng để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền. Năm 1988, Mc. Couch và ctv đã sử dụng marker phân tử RFLP để thiết lập bản đồ di truyền trên cây lúa bao gồm 135 loci. Bản đồ phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng 1389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (Indica) và Bulu Dalam (Javanica). 10 Ba năm sau, Saito và ctv đã thiết lập 1 bản đồ khác dựa trên cặp lai kasalath (Indica) và FI134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci. ( theo Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.3.2. Phƣơng pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự primer, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. Thông thƣờng, restriction enzyme sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thƣờng xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thƣờng xuyên (nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt). Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích. AFLP nhanh, không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc toàn bộ gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu, không cần biết trƣớc trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thƣơng mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. Năm 1999, Liu đã áp dụng phƣơng pháp AFLP để phân nhóm di truyền trên cây khoai lang. Ngoài ra, AFLP cũng đã đƣợc áp dụng thành công để xây dựng nên bản đồ QTL tìm đƣợc gen chịu mặn (theo Nguyễn Thị Lang, 2002). 11 2.3.3. Microsatellite Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng có tính biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA nhƣ: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n …. Microsatellite là các VNTR có số đơn vị trình tự lõi từ 1-6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần. Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao. Dựa trên trình tự DNA microsatellite đƣợc bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thƣớc các đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng từ 100 - 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide. Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ƣu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội. Microsatellite đƣợc sử dụng rất nhiều trong phân tích genome, do tính đa hình phong phú, tiết kiệm thời gian so với các phƣơng pháp khác. Tại Việt Nam, phƣơng pháp microsatellite đã thành công trong việc phân nhóm di truyền lúa mùa địa phƣơng, xây dựng bản đồ gen rầy nâu và xây dựng bản đồ gen kháng mặn trên lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 1.1.1. 2.3.4.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện 12 nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn DNA tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử (marker) trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Về cơ bản kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 1.1.2. 2.3.4.2. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD Nồng độ primer tối ƣu thƣờng nằm trong khoảng từ 0,2 – 0,3 mM. Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên bảng gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu xem là thích hợp cho mỗi phản ứng: 10 – 50 ng/25 μl thể tích phản ứng. PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq - polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau, sự thay đổi nồng độ Mg2+ thƣờng thay đổi số lƣợng băng DNA trên gel. Taq - polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq - polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm. Việc chọn loại Taq polymerase phù hợp là rất quan trọng. 13 Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. RAPD thƣờng đƣợc tiến hành với 45 chu kỳ (KurtWeising và ctv, 1995). 2.3.4.3. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD Về mặt kĩ thuật : phƣơng pháp RAPD không đòi hỏi ta phải biết trƣớc trình tự gen của sinh vật cần nghiên cứu. Số lƣợng DNA cần thiết ít và không cần quá tinh sạch. Thời gian thực hiện ngắn, thao tác đơn giản. Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá sự đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Thị Lang, 2002). 1.1.3. 2.3.4.4 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 1.1.4. Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao và không ổn định. Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao (Nguyễn Thị Lang, 2002). 1.1.5. 2.3.4.5. Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua.v.v. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã đƣợc áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespora cassiicola (Nguồn: NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf). 14 Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002). Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn đƣợc áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002). 1.1.6. 2.3.4.6. Những cải tiến của kỹ thuật RAPD Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD đƣợc mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer nhƣ kỹ thuật RAPD thông thƣờng. Phƣơng pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình. Cải tiến thứ 2 là cắt DNA bằng các enzyme giới hạn trƣớc hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lƣợng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt đƣợc các chỉ thị đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995). 2.4. Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của nấm R.solani 2.4.1.Nghiên cứu trong nƣớc Nguyễn Thị Nghiêm (1997) bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR sử dụng hai primer chuyên biệt ERIC1 và ERIC2 đã chia 137 dòng nấm R. solani Kühn thu thập ở đồng bằng sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau.(dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Nguyễn Thị Huệ (2003), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng rDNA-ITS cho biết hai dòng nấm R. solani phân lập từ cây húng quế và cây bông cho các đoạn cắt giới hạn có kích thƣớc khác nhau khi đƣợc cắt bởi enzyme MboI. 15 Hồ Viết Thế (2005), khi cắt bằng enzyme HaeIII trên vùng rDNA-ITS của 4 dòng R. solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau, đều cho hai đoạn cắt giống nhau. Do đó, không thể phân tích đƣợc tính đa hình về mặt di truyền của 4 dòng này khi cắt bằng enzyme HaeIII. (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng ITS-rDNA với việc sử dụng 3 enzyme cắt TaqI, AluI, HaeIII đã nhận thấy có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của 9 dòng R. solani phân lập từ các cây ký chủ khác nhau. 2.4.2 Các nghiên cứu ở nƣớc ngoài Ducan và ctv (1993) đã dùng phƣơng pháp RAPD để xác định tính đa dạng di truyền của 23 dòng nấm R. solani phân lập đƣợc với các primer T7 (GTAATACGACTCACTATAG), R1 (GTCCSTTCSGTCGGTGCT) , USP (GTAAAACGACGGCCAGT), họ đã tạo ra nhiều sản phẩm đa dạng trên bộ gen của nấm có kích thƣớc từ 0.1 đến 1.5 kb. Matsumoto và ctv. (1996), dựa trên phân tích RFLP của gen rDNA 28S đã chỉ ra sự khác nhau giữa 3 nhóm tiếp hợp AG-1, AG-2, và AG-4 khi cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI, HaeIII, HhaI và HpaII. Năm 2004, Mayee và ctv đã sử dụng phƣơng pháp RAPD để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 20 dòng nấm R.solani phân lập đƣợc trên rễ cây bông vải ở Ấn Độ. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng 8 primer. Kết quả phản ứng RAPD đƣợc xử lí đã cho thấy hệ số di truyền của các dòng nấm này khoảng từ 0,35 -1 và hệ số di truyền trung bình của mỗi nguồn nấm là 0,67. Yang và ctv (1995) đã sử dụng phƣơng pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều nơi khác nhau nhƣ: Western Australia, Newdegate, Esperance. Tất cả các dòng nấm đƣợc nghiên cứu đều thuộc AG-8. (Nguồn: www.cababstractsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2004305722) 1999, Bounoun và các ctv cũng dựa trên phản ứng RAPD để chia nhỏ phân nhóm AG-3 thành các nhóm phụ khác nhau. Họ đã sử dụng đến 40 primer. Các đoạn 16 đặc hiệu đƣợc xác nhận bằng kỹ thuật Southern blot. (Nguồn: Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm - Thời gian: từ 01/03/2005 đến 30/08/2005 - Địa điểm: Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Nguồn nấm 17 dòng phân lập nấm R. solani do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học cung cấp. Các dòng nấm này đƣợc phân lập từ các phiến lá và bẹ lá lúa bị bệnh khô vằn. Kí hiệu nấm và địa điểm thu thập đƣợc trình bày ở bảng 3.1. 3.2.2. Những hoá chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 3.2.2.1. Những hoá chất sử dụng để li trích DNA: - Nitơ lỏng - Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS, 1% β- mercaptoethanol. - Hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) - Hỗn hợp chloroform:izoamyl alcohol (24:1) - Natri acetate 3 M, pH 8.0 - Isopropanol 100%, Ethanol 70% - TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. 3.2.2.2. Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD: - Dung dịch đệm PCR 5X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl) (Promega ) - MgCl2 25 mM (Promega) 17 - dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Promega) - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Promega) - Primer (Bảng 3.2) Bảng 3.1. Kí hiệu và địa điểm thu thập 17 dòng phân lập nấm R. Solani đƣợc sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3.2. Tên và trình tự của các primer đã sử dụng trong nghiên cứu Tên primer Trình tự (5’- 3’) OPL-08 AGCAGGTGGA OPL-05 GGGCGGTACT STT Kí hiệu nấm Địa điểm thu thập 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 L31 L38 L50 L54 L55 L56 L58 L59 L61 L63 L64 L651 L66 L72 L75 L781 L79 Cát Hải, Hải Phòng Quỳnh Lƣu, Nghệ An Dakmil, Dak Lak Phú Lộc, Thừa Thiên- Huế Đức Phổ, Quãng Ngãi Tuy Phƣớc, Bình Định Ninh Hoà, Khánh Hoà Chƣ Xê, Gia Lai Nhơn Trạch, Đồng Nai Đạ Tẻh, Lâm Đồng Châu Đức, Bà Rịa Vũng Tàu Đồng Xoài, Bình Phƣớc Tân Châu, Tây Ninh Cần Đƣớc, Long An Giồng Trôm, Bến Tre Hồng Dân, Bạc Liêu Mỹ Tú, Sóc Trăng 18 OPM-13 GGTGGTCAAG 3.2.2.3. Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X - Ethidium bromide 3.2.3. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 3.2.3.1. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong ly trích: - Khay đựng nitơ - Cối và chày sứ - Eppendorf 1,5 ml - Micropipette các loại - Đầu tip các loại - Bồn ủ nhiệt (water bath) - Máy vortex - Máy ly tâm lạnh - Tủ 4oC và - 20oC 3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong phản ứng RAPD: - Hộp đá khô -20oC - Eppendorf 0,2 ml - Micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu tip tƣơng ứng - Máy luân nhiệt - Tủ thao tác vô trùng 3.2.3.3. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di - Cân kĩ thuật 4 số - Lò viba - Khay đổ gel 19 - Bồn và máy điện di (Bio-rad) - Máy chụp hình gel (Gel doc). - Ống đong 3.3. Phƣơng pháp tiến hành 3.3.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani Quy trình ly trích DNA tổng số: dựa trên quy trình đƣợc đề xuất bởi Lee và Taylor (1990), đã đƣợc Nguyễn Thị Tiến Sỹ cải tiến năm 2005. Quy trình ly trích DNA tổng số - Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm đã đƣợc làm khô kiệt trong nitơ lỏng. - Thêm 600 µl lysis buffer và vortex cho tới khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl). - Ủ 30 phút ở 65oC. - Thêm một thể tích tƣơng ứng (600 µl) hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), và lắc nhẹ. - Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Chuyển dịch nổi (khoảng 400 µl) vào một ống eppendorf mới. - Thêm 400 µl hỗn hợp chloroform, izoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ. Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (25 – 28oC). - Hút lấy dịch nổi (khoảng 200 µl) vào một eppendorf mới. - Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 0,5 thể tích isopropanol (100 µl). Trộn nhẹ nhàng nhƣng cẩn thận. - Ly tâm 5 phút (14000 vòng/phút ở 4oC) - Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70% lạnh. - Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với một thể tích TE 1X (từ 50-100 µl) và trữ ở 4oC hoặc -20oC cho đến khi sử dụng. - Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA bằng cách điện di trên gel agarose. 3.3.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD: 20 Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện theo qui trình do Ducan và các cvt đề xuất năm 1993 (Bảng 3.3 và 3.4). Tuy nhiên khi thực hiện phản ứng RAPD theo qui trình này chúng tôi thấy thời gian thực hiện phản ứng quá dài (5 giờ), lƣợng hoá chất sử dụng quá nhiều cho một phản ứng và sản phẩm cũng chƣa thật tốt . Do đó, qui trình cần đƣợc tối ƣu để có thể rút ngắn thời gian thực hiện và có kết quả tốt . Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (45 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94 o C 94 o C 36 o C 72 o C 72 o C 2 phút 1 phút 1 phút 2 phút 7 phút Bảng 3.4. Thành phần hoá chất để thực hiện phản ứng RAPD Hoá chất phản ứng Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PRC buffer MgCl2 dNTP’S Primer Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 5X 25 mM 10 mM 10 mM 5U/µl 20-50 ng/µl 5 µl 3 µl 1 µl 0,75 µl 0, 3µl 2 µl 11, 75 µl 1X 3 mM 0,4 mM 0,3 mM 1,5 U 20 -50 ng Tổng 25 µl 3.3.2.1. Thí nghiệm 1 : Khảo sát số lượng chu kì phản ứng : Mục đích của nghiệm thức này là khảo sát sự ảnh hƣởng của số chu kì nhiệt của phản ứng lên kết quả của phản ứng RAPD. 21 Chu trình nhiệt đƣợc thực hiện theo bảng 3.3 với số chu kì lần lƣợt thay đổi là 35, 40 và 45. Kết quả khảo sát đƣợc phân tích trên gel agarose 2% Đánh giá kết quả: dựa vào số băng hình thành và sự thể hiện rõ các băng. 3.3.2.2. Thí nghhiệm 2 : Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD: a/ Thí nghiệm 2.1 : Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ MgCl2 và primer lên phản ứng RAPD Mục đích: Xác định nồng độ MgCl2 và primer thích hợp cho phản ứng RAPD cho các dòng phân lập nấm R.solani. Nồng độ của MgCl2 và primer đƣợc lần lƣợt thay đổi trong các nghiệm thức để có thể tìm thấy nồng độ thích hợp nhất cho phản ứng RAPD (bảng 3.6). Các thành phần còn lại đƣợc giữ nguyên nhƣ ở bảng 3.4. Kết quả khảo sát đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel. Đánh giá kết quả: số băng hình thành, độ rõ của các băng sản phẩm và không xuất hiện tạp. Bảng 3.5. Nồng độ MgCl2 và primer đƣợc khảo sát trong thí nghiệm 2.1 Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối 1 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 3μl 0,75 μl 3 mM 0,3 mM 2 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 3,5 μl 0,75 μl 3,5 mM 0,3 mM 3 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 4 μl 0,75 μl 4 mM 0,3 mM 4 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 4 μl 1μl 4 mM 0,4 mM 5 MgCl2 25 mM 4 μl 4 mM 22 b/ Thí nghiệm 2.2 : Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase và DNA mẫu lên phản ứng RAPD Mục đích: Xác định nồng độ Taq polymerase và DNA mẫu thích hợp cho phản ứng RAPD trên nấm R.solani. Sau khi đã chọn đƣợc nồng độ MgCl2 và primer thích hợp trong thí nghiệm 2.1, thí nghiệm 2.2 đƣợc thực hiện với nồng độ của Taq polymerase và DNA mẫu lần lƣợt thay đổi (bảng 3.7). Buffer, dNTP’S giữ nguyên nồng độ nhƣ ở bảng 3.4. Nồng độ MgCl2 và primer là nồng độ tối ƣu đã thu đƣợc trong thí nghiệm 2.1. Kết quả khảo sát đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel. Đánh giá kết quả: số băng hình thành, độ rõ của các băng sản phẩm và không xuất hiện tạp. Bảng 3.6. Nồng độ DNA mẫu và Taq polymerase đƣợc khảo sát trong thí nghiệm 2.2 Primer 10 mM 0.5 μl 0,2 mM Nghiệm thức Hoá chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối 23 3.3.3. Thực hiện phản ứng RAPD: Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện theo qui trình nhiệt và thành phần hoá chất đã đƣợc tối ƣu sau các thí nghiệm trên. Kết quả phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 2%. Các băng sản phẩm điện di sẽ đƣợc mã hoá và xử lí bằng phần mềm NTYSYSpc 2.1. 3.3.4. Điện di sản phẩm RAPD Quy trình thực hiện Cho 0.5g agaro