Khóa luận Thử nghiệm điều chế Auto-Vaccine phòng tiêu chảy do E.coli trên heo con sau cai sữa

tế bào và quá trình miễn dịch dịch thể.  Quá trình miễn dịch tế bào gồm: da, niêm mạc, hệ bạch huyết, nội tạng (gan, lách), thực bào.  Quá trình miễn dịch dịch thể gồm: kháng thể tự nhiên, bổ thể, interferon, enzyme lysozyme. 2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu Là sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi xuất hiện kháng nguyên. Kháng nguyên này kích thích cơ thể tạo ra miễn dịch chống lại chính kháng nguyên. Miễn dịch đặc hiệu là quá trình phát sinh và phát triển sự hoạt động của 2 nhóm tế bào lympho T và lympho B với sự phối hợp của đại thực bào. Miễn dịch thu đƣợc hay còn gọi là miễn dịch đặc hiệu là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu đƣợc trong quá trình sống. Miễn dịch thu đƣợc chia ra làm hai loại: miễn dịch chủ động và miễn dịch thụ động. i. Miễn dịch thụ động là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu từ bên ngoài. Nếu quá trình tiếp thu miễn dịch xảy ra hoàn toàn tự nhiên nhƣ trong trƣờng hợp thú con tiếp nhận kháng thể từ thú mẹ qua sữa đầu, hoặc gia cầm con tiếp nhận kháng thể từ gia cầm mẹ qua lòng đỏ trứng, đƣợc gọi là miễn dịch thụ động tự nhiên. Còn miễn dịch thụ động có đƣợc do con ngƣời tạo ra nhƣ trƣờng hợp tiêm huyết thanh để phòng và trị bệnh, đƣợc gọi là miễn dịch thụ động nhân tạo. 11 ii. Miễn dịch chủ động là loại miễn dịch mà tự bản thân cơ thể sinh vật tạo ra khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên. Nếu miễn dịch chủ động mà trong đó có sự tham gia của con ngƣời nhƣ trƣờng hợp chủng ngừa vaccine để phòng bệnh, đƣợc là miễn dịch chủ động nhân tạo. Miễn dịch chủ động do cơ thể tiếp thu tự nhiên trong môi trƣờng sống đƣợc gọi là miễn dịch chủ động tự nhiên. Trƣờng hợp này xảy ra khi thú qua khỏi sau đợt dịch bệnh, có khả năng không mắc lại bệnh đó khi bị tái nhiễm. Cũng nhƣ trong hệ thống miễn dịch tự nhiên, miễn dịch thu đƣợc cũng có miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào: Miễn dịch tế bào (còn gọi là quá trình miễn dịch trung gian tế bào): đƣợc biểu thị bởi sự hoạt hóa lympho bào T thuộc đặc hiệu của kháng nguyên. Nhƣ vậy trong miễn dịch trung gian tế bào, lympho bào T đóng vai trò quan trọng. Miễn dịch dịch thể: kháng thể chủ yếu có trong huyết thanh. Kháng thể đặc hiệu cũng có cấu tạo giống nhƣ kháng thể không đặc hiệu và nằm trong 5 lớp A, D, G, E, M nhƣng nó chỉ đƣợc tạo ra khi có kháng nguyên đặc hiệu tác động và đƣợc sự hỗ trợ của lympho bào T. Lympho bào B chịu trách nhiệm trong miễn dịch dịch thể. 2.3.3. Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) 2.3.3.1. Kháng nguyên (antigen) Là những protein lạ mà khi vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể kết hợp đặc hiệu với nó. Tất cả kháng nguyên đều có hai tính chất: tính sinh miễn dịch của kháng nguyên và tính đặc hiệu của kháng nguyên. i. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên: là khả năng tạo sự miễn dịch của cơ thể đối với kháng nguyên. Tính chất này phụ thuộc các điều kiện sau :  Bản chất hoá học của kháng nguyên: thƣờng là những protein lạ đối với cơ thể vật chủ. Các kháng nguyên bản chất hoá học là protein thƣờng là kháng nguyên hoàn toàn và mạnh vì nó kích thích cơ thể tạo ra nhiều kháng 12 thể. Các kháng nguyên bản chất hoá học là lipid, polysaccharide là kháng nguyên yếu, có loại là “bán kháng nguyên” vì nó kích thích yếu hoặc không kích thích cơ thể sinh kháng thể.  Kích thƣớc phân tử của kháng nguyên: nhìn chung kháng nguyên càng có kích thƣớc lớn và cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao. Một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên. Đó là một trong các yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch cao.  Đƣờng xâm nhập của kháng nguyên: thƣờng kháng nguyên xâm nhập qua đƣờng tiêu hoá có tính sinh miễn dịch yếu hơn kháng nguyên xâm nhập qua da.  Liều lƣợng kháng nguyên: nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại, nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch.  Quy trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn tới tính sinh miễn dịch của phân tử kháng nguyên: mỗi loại kháng nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng.  Cá nhân đƣợc miễn dịch: các cơ thể khác nhau có sự đề kháng khác nhau với mầm bệnh (kháng nguyên). Thƣờng cơ thể khoẻ, đƣợc chích vaccine có khả năng miễn dịch tốt hơn cơ thể yếu, không đƣợc chích vaccine.  Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên, phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ), chất bổ trợ... ii. Tính đặc hiệu của kháng nguyên: là sự phản ứng đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể mà kháng nguyên kích thích cơ thể sản sinh ra. Tính đặc hiệu của kháng nguyên phụ thuộc vào các điều kiện sau:  Cấu trúc phân tử protein của kháng nguyên: các monopolypeptide không có tính kháng nguyên vì ở đây chuỗi peptide đƣợc lặp lại nhiều lần với 13 cùng một loại acid amin, do đó không chứa yếu tố lạ đặc trƣng. Các dipolypeptide và đặc biệt là tripolypeptide có tính kháng nguyên mạnh.  Các nhóm quyết định kháng nguyên (epitope): nhóm quyết định kháng nguyên là những điểm thụ thể nằm trên bề mặt kháng nguyên mà tại nơi đó kháng thể gắn vào. Trên mỗi phân tử kháng nguyên có khoảng 10.000 nhóm quyết định kháng nguyên.  Trọng lƣợng phân tử của kháng nguyên: phân tử kháng nguyên càng lớn thì trên đó có nhiều “nhóm quyết định kháng nguyên”, chúng là những kháng nguyên mạnh. Bán kháng nguyên có trọng lƣợng phân tử nhỏ do đó có ít nhóm quyết định kháng nguyên. 2.3.3.2. Kháng thể (antibody) Là những globulin miễn dịch (immunoglobulin-Ig) có trong huyết thanh và dịch chiết tại chỗ. Chúng là 1 loại protein có mang thêm 1 glucid nên còn gọi là glycoprotein. Cấu trúc kháng thể: phân tử kháng thể gồm 4 chuỗi protein trong đó gồm 2 chuỗi nặng (gọi là chuỗi H-heavy) và 2 chuỗi nhẹ (gọi là chuỗi L-light). Trọng lƣợng của kháng thể từ 15 KDa trở lên. Các chuỗi H và L nối với nhau bằng cầu nối disulfide (-S-S-). Chuỗi nặng gồm 4 đoạn polypeptide và chuỗi nhẹ gồm 2 đoạn polypeptide, mỗi đoạn có 110 - 120 acid amin. Trên chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có vùng Fab và Fv kết hợp đƣợc với kháng nguyên, vùng Fc mang tính kết hợp bổ thể. Sự khác nhau giữa các loại kháng thể nằm ở vùng siêu biến V còn vùng hằng định C thì giống nhau. Nhiều kháng nguyên có nhiều yếu tố xác định và do đó phải có 1 bộ kháng thể tƣơng ứng mới tƣơng tác đƣợc với kháng nguyên ấy. Vì vậy, số lƣợng kháng thể hết sức lớn. Phân loại kháng thể: tất cả các kháng thể đƣợc xếp vào 5 lớp Ig. Mỗi lớp phân biệt với các lớp khác nhờ những trình tự acid amine đặc trƣng ở vùng hằng định nằm trên chuỗi nặng tạo nên những đặc tính về cấu trúc và chức năng riêng cho mỗi lớp. 14 i. IgG: có chuỗi nặng là gamma (γ). Là thành phần cơ bản nhất trong huyết thanh. Chiếm khoảng 80% tổng số Ig của huyết tƣơng bình thƣờng. IgG là kháng thể duy nhất truyền từ mẹ sang nhau thai (kháng thể tự nhiên). Khi trẻ lớn lên dần, lƣợng kháng thể này giảm dần. Đến khi trƣởng thành IgG lại gia tăng và đặc biệt tăng cao khi cơ thể bị nhiễm khuẩn. Trong hoạt động đáp ứng miễn dịch, các IgG có 4 chức năng: trung hòa độc tố, ngƣng kết tế bào vi khuẩn và tham gia vào phản ứng Arthus, phối hợp với bổ thể làm tan vi khuẩn, và opsonin hóa. ii. IgM: có chuỗi nặng là muy (μ), là globulin miễn dịch lớn nhất và là lớp miễn dịch chính đƣợc tổng hợp ở bào thai bảo vệ bào thai khỏi bị nhiễm khuẩn. Trong huyết thanh ngƣời bình thƣờng, IgM có nồng độ khoảng 125mg/100ml, đứng thứ hai sau IgG. Khi cơ thể bị kích thích bởi kháng nguyên, IgM là loại kháng thể xuất hiện đầu tiên, tiếp sau đó IgG xuất hiện và thay thế IgM. Thƣờng sau khi IgG xuất hiện thì IgM sẽ tiêu biến, nhƣng cũng có trƣờng hợp IgM tồn tại rất lâu (ví dụ kháng thể IgM chống lại kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella). Chức năng sinh học của IgM: trung hòa ngoại độc tố, ngƣng kết vi khuẩn, phối hợp với bổ thể làm tan vi khuẩn, hấp thụ lên bề mặt lympho B để tạo nên điểm thụ thể dành cho kháng nguyên tƣơng ứng, ảnh hƣởng đến hoạt động của độc tố bằng cách kết hợp với quyết định kháng nguyên nằm trong hoặc gần vị trí hoạt động của độc tố, do đó nó phong bế phản ứng của độc tố. iii. IgA: có chuỗi nặng là alpha (α), IgA có trong nƣớc bọt, sữa non, dịch ruột, đặc biệt là trong huyết thanh và dịch xuất tại chỗ. IgA giữ vai trò chủ yếu trong miễn dịch tại chỗ chống lại các bệnh đƣờng tiêu hoá hay hô hấp. iv. IgD: chuỗi nặng là delta (δ), có trong máu với hàm lƣợng thấp 30mg/100ml. Chúng dễ dàng bị biến tính bởi nhiệt và bị phân giải bởi enzyme. Có vai trò trong miễn dịch tại chỗ, thƣờng xuất hiện nhiều trong bệnh nhân có bệnh mãn tính. Tốc độ tổng hợp của IgD kém hơn IgG khoảng 100 lần nhƣng dị hóa lại 15 nhanh hơn hàng chục lần. IgD tăng trong các trƣờng hợp nhiễm khuẩn mãn tính, nhƣng không đặc hiệu cho loài. IgD có trong kháng thể kháng tuyến giáp trạng, kháng insulin, kháng penicillin. IgD không kết hợp với bổ thể, không gây phản vệ thụ động trên da chuột lang, không đi qua nhau thai. Chức năng sinh học của IgD còn đƣợc biết rất ít, có lẽ IgD có vai trò nhƣ thụ thể cho kháng nguyên vì nó gắn trên bề mặt tế bào lympho B để tạo điểm thụ thể giữa lympho B với kháng nguyên tƣơng ứng. v. IgE: có chuỗi nặng là epsilon (ε). IgE có nồng độ trong huyết thanh thấp 0,025mg/100ml, dễ biến tính khi xử lý bằng nhiệt ở 560C/30 phút. IgE có khả năng hoạt hóa đại thực bào và bạch cầu ái toan, tăng cƣờng thực bào hay tăng cƣờng độc tính của bạch cầu trung tính đối với giun sán. IgE có ít trong huyết thanh và dễ bị phân huỷ. IgE đóng vai trò trung gian trong phản ứng quá mẫn, trực tiếp gây ra những triệu chứng nhƣ sốt mùa hè, hen suyễn, sốt phát ban, và shock quá mẫn.  Sự hình thành kháng thể: nhờ phƣơng pháp đánh dấu kháng thể bằng đồng vị phóng xạ hay chất huỳnh quang, ngƣời ta thấy các kháng thể đƣợc tổng hợp ở tủy đỏ và ở các nang của lách, ở các nang và dây tuỷ của các hạch bạch huyết, ở tuỷ xƣơng, mảng Peyer và những tổ chức lympho khắp cơ thể (phổi, gan…). Một trong những tổ chức quan trọng nhất tham gia vào việc tổng hợp kháng thể là “trung tâm mầm” của lách và hạch bạch huyết. Trung tâm mầm xuất phát từ những “clone” là những tế bào gốc ở tuỷ xƣơng. Ban đầu khi chƣa tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” ở trạng thái “ngủ”, khi tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” bị kích thích và hoạt hoá để tạo ra những tế bào đáp ứng miễn dịch (các lympho bào B và T). Lympho bào B sẽ sản sinh ra dòng lympho B nhớ và tƣơng bào. Tƣơng bào trực tiếp tham gia tạo kháng thể. Nhƣ vậy, tế bào B và “con cháu” của chúng hoạt động theo từng “clone”: chúng biệt hoá, tăng sinh và trƣởng thành theo sự đáp ứng miễn dịch. Trong các tình thế khác nhau, mức độ khác nhau, sự tổng hợp kháng thể phụ thuộc vào tế bào T: nhƣ sự tổng hợp IgE, IgG phụ thuộc rất nhiều vào tế bào T 16 (Ishisaka Bankhurst và cộng sự, 1973). Còn các kháng thể IgM, IgA ít hoặc không phụ thuộc vào tế bào T. Kháng thể đƣợc tổng hợp trong các polyribosome trong tƣơng bào. Các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể đƣợc tổng hợp riêng sau đó chúng kết hợp với nhau ngay trong polyribosome tạo ra 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ. Ngay sau khi các chuỗi globulin miễn dịch đã hình thành xong thì các đƣờng hydratecacbon sẽ liên kết với nhau và kháng thể ra khỏi tƣơng bào. 2.4. Auto-vaccine 2.4.1. Định nghĩa vaccine Vaccine là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có khả năng tạo cho cơ thể đáp ứng miễn dịch, đƣợc dùng với mục đích phòng bệnh hoặc với mục đích khác. 2.4.2. Phân loại vaccine 2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) Sử dụng virus hoặc vi khuẩn sống đã đƣợc xử lý để giảm tính độc. Ví dụ: vaccine sabin chống bại liệt, vaccine sởi, vaccine quai bị. 2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) Vi khuẩn hay virus đƣợc giết chết bằng phƣơng pháp vật lý (nhiệt độ cao, bức xạ, tia cực tím…) hay hoá học (formaldehyde, ethylen imine…). Ví dụ: vaccine salk chống bại liệt dạng tiêm, vaccine dại. Vaccine bất hoạt an toàn hơn vaccine sống nhƣng có hiệu lực miễn dịch yếu hơn. Ngƣời ta thƣờng trộn với chất bổ trợ nhằm tăng sức miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch. 17 2.4.2.3. Các "toxoid” Là các hợp chất độc bất hoạt đƣợc trích từ các vi sinh vật (trong trƣờng hợp chính các độc chất này là phƣơng tiện gây bệnh của vi sinh vật). Chúng đƣợc tiêm cho vật chủ khác (nhƣ ngựa) để tạo kháng thể, rồi chiết lấy kháng thể này để chữa bệnh. Ví dụ: các huyết thanh ngừa uốn ván và bạch hầu. 2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dƣới đơn vị (subunit) i. Vaccine tái tổ hợp: gen mã hoá kháng nguyên đƣợc chuyển nạp vào genome của tế bào nấm men, tế bào vi khuẩn hoặc tế bào động vật thích hợp để tạo ra nhiều kháng nguyên tinh khiết nhờ phƣơng thức nhân bản. Quá trình chuyển nạp gen mã hoá kháng nguyên đƣợc thực hiện qua yếu tố trung gian plasmid. ii. Sử dụng protein tinh sạch hay glycoprotein của virus. 2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu i. Vaccine DNA trần (naked DNA vaccine): gen mã hoá cho một kháng nguyên của tác nhân gây bệnh cũng có thể tách rời rồi đƣa vào vật chủ thông qua vectơ là plasmid hay virus. ii. Vaccine peptide: trên đó có epitope bảo vệ. Peptid có thể liên kết với một protein tải để tăng tính phụ thuộc tế bào lympho T. iii. Vaccine liên kết: chất polysaccharid liên kết với protein có phân tử lƣợng cao để tiếp cận dễ dàng với tế bào lympho T. Ví dụ: virosomes … iv. Vaccine khảm hay vaccine lai ghép (hydrid vaccine): là kết quả của sự kết hợp kĩ thuật tái tổ hợp và kĩ thuật di truyền sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tƣợng "phản tác dụng". Chủng vi sinh vật vaccine đƣợc cấy ghép gen mã hoá kháng nguyên lấy từ vi sinh vật gây bệnh. Vi sinh vật đƣợc cấy ghép là vi sinh vật vectơ. Ví dụ: dùng virus Vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại. Vaccine lai ghép một lúc kích thích cơ thể tạo ra hai đáp ứng miễn dịch là đáp ứng bảo vệ đối với vi sinh vật gây bệnh (virus viêm gan B hay virus dại) và đáp ứng đối với vi sinh vật vectơ (Vaccinia). 18 2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine Auto-vaccine là vaccine mang mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) của vật chủ hay vùng dịch nào đó và đƣợc sử dụng để chủng ngừa cho chính vật chủ hay vùng dịch đó. 2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vaccine Việc đầu tiên trong quy trình sản xuất auto-vaccine là cần phân lập mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) từ mô bệnh hoặc dịch chiết của vật chủ mang bệnh. Tiếp theo, mầm bệnh sẽ đƣợc làm chết hoặc làm yếu bởi các tác nhân hóa học, nhiệt, điện hay phóng xạ… Sau cùng kháng nguyên đƣợc tinh sạch và bổ sung một số chất cần thiết để thành phẩm auto-vaccine. 2.4.5. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của việc sản xuất, sử dụng auto- vaccine 2.4.5.1. Ƣu điểm Là giải pháp phòng ngừa nhanh chóng trong trƣờng hợp không có vaccine hay với những bệnh hiếm gặp. Hạn chế sử dụng những chủng không cần thiết trong vaccine khi tiêm phòng cho vật chủ. Có tính đặc hiệu cao vì tạo miễn dịch chuyên biệt. Phƣơng pháp hiệu quả chống lại vi khuẩn có tính kháng rộng. Phƣơng pháp phòng ngừa hữu hiệu đối với virus biến chủng nhanh hay vi khuẩn kháng kháng sinh nhanh. Có thể đƣợc sử dụng để phòng ngừa những tác nhân gây bệnh ở dạng phân tử (nhƣ prion…) 2.4.5.2. Nhƣợc điểm Quy trình sản xuất auto-vaccine rất khó khăn vì cần phải tinh sạch kháng nguyên. 19 Hạn chế trong việc sử dụng rộng rãi, chỉ đƣợc sử dụng tại nơi mà mầm bệnh đƣợc phân lập để sản xuất auto-vaccine. Chi phí sản xuất cao, giá thành phẩm cao. Khó để thƣơng mại hóa auto-vaccine thành phẩm. 2.5. Chất bổ trợ Ngày nay các hãng sản xuất vaccine luôn bổ sung chất bổ trợ vào sản phẩm của mình. Sử dụng chất bổ trợ nào để đem lại hiệu quả cho vaccine là bí quyết riêng của mỗi công ty. Vậy chất bổ trợ là gì? Chúng có những tác dụng gì để nâng cao hiệu quả của vaccine? 2.5.1. Định nghĩa chất bổ trợ Chất bổ trợ là một tác nhân đƣợc bổ sung vào vaccine có tác dụng tăng cƣờng kích thích hệ miễn dịch, tạo nên sự đáp ứng với vaccine mạnh và dài hơn, qua đó nâng cao hiệu quả của vaccine. Một trong những chất bổ trợ đƣợc sử dụng nhiều và sớm trong vaccine, đặc biệt là vaccine cho ngƣời, là muối nhôm. Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy chất bổ trợ nhôm là nguyên nhân gây chết các neuron vận động sau khi tiêm. Một số chất bổ trợ đƣợc sử dụng trong vaccine thú y và tác dụng của chúng:  Muối nhôm: kéo dài sự biểu hiện của kháng nguyên.  Yếu tố bề mặt (saponin, lysolecithin…): hoạt hóa sự biểu hiện của kháng nguyên.  Nhũ dầu: kéo dài sự biểu hiện kháng nguyên.  Thành phần cấu tạo của vi khuẩn: hoạt hóa đại thực bào và tế bào lympho.  Phức hợp carbonhydrate: hoạt hóa đại thực bào. 20 2.5.2. Tác dụng của chất bổ trợ  Chất bổ trợ giúp kháng nguyên di chuyển đến các hạch lympho, tại đây chúng đƣợc các tế bào lympho T nhận diện. Nhờ vậy mà có nhiều tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa để tham gia tạo kháng thể.  Chất bổ trợ nhƣ một tác nhân bảo vệ vật lý giúp kháng nguyên kéo dài sự biểu hiện bên trong cơ thể đƣợc tiêm vaccine. Qua đó hệ miễn dịch có thêm thời gian để tăng cƣờng điều chỉnh tế bào lympho T và B.  Chất bổ trợ giúp tăng sức chịu đựng tại nơi tiêm, giải tỏa những phản ứng phụ nguy hiểm.  Chất bổ trợ không chỉ tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà còn tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. 2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ đƣợc sử dụng trong đề tài này) Montanide đƣợc sản xuất bởi công ty SEPPIC (trụ sở chính công ty tại Paris, nƣớc Pháp), là chất bổ trợ tăng cƣờng tính hiệu quả và sự ổn định của vaccine, ngoài ra nó còn làm giảm những phản ứng phụ trên cơ thể đƣợc tiêm vaccine và rất dễ sử dụng. Montanide đƣợc sử dụng rộng rãi cho các vaccine thƣơng phẩm trên nhiều loài nhƣ heo, bò, cá… và chỉ đƣợc sử dụng trong thú y. Đặc điểm Montanide:  Dạng dung dịch dầu hỗn hợp Anhydro mannitol ether octodecenoate.  pH: 5 - 7  Không mùi, có màu vàng.  Điểm sôi: > 100oC.  Điểm bốc cháy: > 100oC.  Không tự bốc cháy, không tự nổ.  Không hòa tan trong nƣớc, hòa tan trong các dung môi.  Lƣu trữ: cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh. 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian: 4 tháng 3.1.2. Địa điểm - Phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Vi Sinh - Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi - Thú Y, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM. - Trại heo tƣ nhân ở Bình Dƣơng. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Heo con từ 14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi chƣa tiêm vaccine phòng tiêu chảy do E. coli hoặc chƣa tiến hành điều trị kháng sinh. Số lƣợng : 16 bầy heo con. 3.2.2. Vật liệu và thiết bị Mẫu phân đƣợc lấy từ những heo trong trại có biểu hiện tiêu chảy. 54 mẫu huyết thanh heo con thí nghiệm. 22 Nƣớc muối sinh lý. Môi trƣờng phân lập và thử sinh hóa vi khuẩn E. coli: EMB, KIA, TSA, TSB, môi trƣờng và thuốc thử các phản ứng IMViC. Bộ kít huyết thanh chuẩn để định type đối với vi khuẩn E. coli (F4, F5, F6). Chất bổ trợ Montanide Dung dịch formol 0,3% dùng để bất hoạt vi khuẩn. Tăm bông tiệt trùng, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, kính hiển vi, tủ ấm, tủ lạnh, nhiệt kế, cylindre, máy hấp autoclave... 3.3. Nội dung - Sản xuất auto-vaccine trong phòng thí nghiệm. - Đánh giá hiệu quả của auto-vaccine trên heo con thí nghiệm. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Chọn những heo có dấu hiệu tiêu chảy, chƣa sử dụng kháng sinh. Đầu tiên, dùng bông gòn thấm cồn để sát trùng hậu môn, tiếp theo sử dụng tampon tiệt trùng đƣa vào trong trực tràng khoảng 3cm, ngoáy một đến hai vòng rồi cắm sâu tampon vào giữa ống nghiệm có chứa nƣớc muối sinh lý, đậy nút bông vào cẩn thận. Mẫu đƣợc bảo quản ở 0-4oC trong thùng đá sau đó đem về phòng xét nghiệm để phân lập. Hình 3.1. Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con 23 3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật 3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập Sử dụng môi trƣờng chuyên biệt EMB (Eosin Methylen Blue). Thực hiện phân lập vi khuẩn trực tiếp từ mẫu sang môi trƣờng chuyên biệt EMB trên đĩa petri bằng que cấy vòng. Sau đó đem ủ đĩa EMB đã đƣợc cấy vi khuẩn trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC, 24 giờ. Vi khuẩn E. coli trong môi trƣờng EMB cho khuẩn lạc đƣờng kính khoảng 1- 2mm, màu tím ánh kim, có vùng sậm đục ở giữa khuẩn lạc. Để bắt E. coli, chúng tôi chỉ chọn khuẩn lạc từ những đĩa có trên 2/3 số khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli. 3.4.2.2. Kiểm tra sinh hóa Từ những khuẩn lạc đặc trƣng của E. coli trên môi trƣờng EMB (hơi dẹt, bóng, nhỏ, tím ánh kim, không nhô cao lên thạch), chúng tôi sẽ chọn 3 - 5 khuẩn lạc để cấy chuyển sang môi trƣờng KIA (Kliger Iron Agar), ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ. Vi khuẩn E. coli lên men đƣờng glucose và lactose có sinh hơi. Hình 3.2. Phân lập E. coli trên môi trƣờng EMB Chỉ chọn khuẩn lạc của mẫu A Không chọn khuẩn lạc của mẫu B Khuẩn lạc nghi ngờ E. coli 24 Kết quả trên môi trƣờng KIA của vi khuẩn E. coli là cả phần nghiêng và phần đứng của môi trƣờng đều có màu vàng, có hơi. Từ môi trƣờng KIA, vi khuẩn đƣợc cấy truyền sang môi trƣờng TSA (Tryptone Soya Agar) ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ để nhuộm Gram và thực hiện các phản ứng sinh hóa, phản ứng huyết thanh học. i. Nhuộm Gram: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc nhuộm Gram. Kết quả: E. coli có màu hồng Gram âm. Hình 3.4. Vi khuẩn E. coli hình que, màu hồng Gram âm Hình 3.3. Vi khuẩn E. coli lên men đƣờng sinh hơi trong môi trƣờng KIA 25 ii. Xác định phản ứng sinh hóa: E. coli cho kết quả nghiệm pháp IMViC là ++-- a. Phản ứng Indol: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào các ống môi trƣờng canh tryptone, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử Kovacs’ để thực hiện phản ứng Indol. Kết quả: E. coli cho phản ứng dƣơng tính có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng. b. Phản ứng Methyl Red: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi trƣờng canh Clark-Lubs, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử Methyl Red để thực hiện phản ứng. Kết quả: E. coli có phản ứng dƣơng tính dịch nuôi cấy màu đỏ. Hình 3.5. Phản ứng Indol Hình 3.6. Phản ứng Methyl Red 26 c. Phản ứng Voges Proskauer: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi canh trƣờng Clark-Lubs, ủ 24 giờ. Sau đó, nhỏ thuốc thử là α-naphtol và KOH 40% để thực hiện phản ứng. Kết quả: E. coli có phản ứng âm tính môi trƣờng không có màu đỏ hồng. d. Phản ứng Citrate: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc cấy vào môi trƣờng thạch nghiêng SCA (Simmons Citrate Agar), ủ 24 giờ. Kết quả: E. coli có phản ứng âm tính giữ nguyên màu lục môi trƣờng. Hình 3.7. Phản ứng Voges Proskauer Hình 3.8. Phản ứng Citrate 27 iii. Phản ứng huyết thanh học định type kháng nguyên của vi khuẩn E. coli: bằng phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh của các type F4, F5, F6. Tiến hành: sử dụng lame sạch, nhỏ lên lame 10µl kháng huyết thanh và 10µl nƣớc muối sinh lý bên cạnh. Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn trong ống TSA, trộn vào giọt nƣớc muối sinh lý, trộn đều rồi hòa kháng huyết thanh và vi khuẩn với nhau. Kết quả của phản ứng ngƣng kết đƣợc đọc trong vòng 30 giây sau khi vi khuẩn và kháng huyết thanh đã đƣợc trộn lẫn.Trong trƣờng hợp vi khuẩn có kháng nguyên phù hợp với kháng thể có trong kháng huyết thanh, trong huyễn dịch sẽ hình thành nên các hạt ngƣng kết lớn, màu trắng đục, nhìn thấy rất rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc đọc là dƣơng tính. Nếu huyễn dịch vẫn đồng nhất, không thấy có sự xuất hiện các hạt ngƣng kết, phản ứng đƣợc đọc là âm tính (Diagnostic Pasteur Manual. 3e ed). Sơ đồ 3.1. Qui trình phân lập và định danh vi khuẩn E. coli (Nguyễn Ngọc Hải, 1999) Mẫu phân Nhuộm Gram EMB KIA TSA Thử phản ứng ngưng kết Thử phản ứng sinh hóa 28 3.4.3. Điều chế auto-vaccin Việc chọn lựa kháng nguyên sẽ theo các tiêu chí Vi khuẩn phải có đầy đủ các tính chất về hình dạng khuẩn lạc, màu sắc nhuộm gram, các phản ứng sinh hóa, lên men đƣờng,… nhƣ đã đề cập ở trên. Chủng tuyển chọn đƣợc phân lập từ các heo khác nhau. Chủng định đƣợc type kháng nguyên (F4, F5 hoặc F6), có kết quả ngƣng kết rõ ràng. Sau khi nhuộm Gram, thực hiện phản ứng sinh hóa và phản ứng huyết thanh định type, chúng tôi chọn ra 5 chủng E. coli cho kết quả phản ứng định type rõ nhất. 5 chủng này đƣợc nuôi cấy tăng sinh trong môi trƣờng canh TSB, trong 5 bình thủy tinh khác nhau, có lắc đảo trong quá trình tăng sinh. Sau 24 giờ nuôi tăng sinh, chúng tôi trộn lẫn dịch nuôi ở 5 bình để đếm số lƣợng, xử lý làm chết vi khuẩn và li tâm rửa. Sau lần ly tâm cuối cùng, vi khuẩn đƣợc hòa vào một thể tích nƣớc muối sinh lý thích hợp để đạt nồng độ 2.109 tế bào/ml. Chuẩn bị auto-vaccine: dịch vi khuẩn có nồng độ 2.109 tế bào/ml đƣợc cho vào các flacon đã tiệt trùng, sau đó cho chất bổ trợ Montanide vào (theo tỷ lệ 50 chất bổ trợ và 50 dịch vi khuẩn). Bảo quản các flacon vaccine này ở 00C - 40C. 29 5 chủng E. coli đƣợc chọn lọc Môi trƣờng canh TSB Li tâm bỏ dịch nổi 4000 vòng/phút trong 15