Khóa luận Thử nghiệm khả năng ứng dụng Protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin

nhƣ Chƣơng trình chất lƣợng (QMS) theo HACCP, ISO 9001-2000, SSOP, GMP. Các hệ thống dây chuyền IQF tự động hiện đại có khả năng sản xuất các mặt hàng giá trị cao. Thành phần dinh dƣỡng của tôm biển: Các loài tôm biển đƣợc chế biến xuất khẩu chủ yếu : tôm sú, tôm bạc (tôm he chân trắng), tôm sắt, tôm thẻ, tôm chì. 2.2.2. Thành phần hoá học trong các phần của tôm  Theo Samuel keyers, 1985, đầu tôm chứa một lƣợng lớn những chất dinh dƣỡng, nhƣ các acid amin, Nucleotid rất hấp dẫn tính ăn của các loài động vật thuỷ sản nên đƣợc tận dụng để bổ sung vào khẩu phần ăn của chúng hoặc cho gia súc, gia cầm (Samuel P.M, 1986). Thành phần hoá học trong đầu tôm Thành phần Hàm lƣợng (%) Ẩm độ Đạm toàn phần Protein thô Lipid Canxi Phospho 73,22 1,86 11,64 2,01 2,19 0,37 (Kết quả phân tích tại Viện Pasteur) Protein thuộc loại hoàn thiện và chứa nhiều acid amin nhƣ: tyrozyn, tryptophan, xistin và ít lyzyn, histidin hơn so với các protein của thịt cá. Thịt tôm còn chứa một lƣợng lớn vitamin B2 cũng nhƣ các nguyên tố khoáng, Ca, P, Fe, Cu, Iot,… Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g sản phẩm ăn đƣợc Thành phần chính Muối khoáng Vitamin Kcal g Mg mg Calories Moisture Protein Lipid Glucid Ash Calci Phosphor Iron A B1 B2 PP 82 79,2 17,6 0,9 0,9 1,4 79 184 1,6 20 0,04 0,08 2,3 14  Cơ quan nội tạng của tôm [4] Khi giải phẫu tôm, ngƣời ta thấy cơ quan nội tạng của tôm tập trung chủ yếu ở phần đầu, bao gồm hệ tiêu hóa, tuần hoàn, hô hấp, bài tiết, sinh dục… Dạ dày là phần chính của hệ tiêu hóa. Ngoài dạ dày ra, hệ tiêu hóa còn có ruột giữa (ngắn), ruột sau (dài) chạy qua cả phần bụng. Hệ tiêu hóa là nơi tập trung các Enzyme khác nhau, đặc biệt là protease phân giải protein có hoạt tính khá mạnh, giúp cho việc tiêu hóa thức ăn của tôm. Ngoài ra, một số cơ quan khác nhƣ gan, tụy, ống dẫn tiêu hóa,…cũng chứa nhiều protease.  Vỏ tôm [2] Thành phần của vỏ tôm gồm có: khoáng, protein, H2O, Chitin, ngoài ra còn có một số thành phần khác nhƣ lipit, các sắc tố chủ yếu là Asthaxanthin,…Tỷ lệ giữa các thành phần này không ổn định, phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ giống loài, mùa vụ, đặc điểm sinh thái – sinh lý. Chitin là thành phần chủ yếu của vỏ tôm. Vì vậy, đây là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất Chitin – Chitosan. 2.2.3. Enzyme protease từ tôm [4] 2.2.3.1. Tính chất Protease của tôm cũng nhƣ của các loài động vật thuỷ sản khác là các protease nội bào, tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó là nội tạng và cơ thịt. Đặc biệt là ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nôi tạng nằm ở phần đầu nên hệ Enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu, sau đó đến các cơ quan khác. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serine dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao. Một số protease tiêu biểu nhƣ: cathepsin, dipeptidase, carboxypeptidase, trypsin …. (Nguồn: Bộ nội thƣơng, 1982. Trƣờng đại học Thƣơng nghiệp thƣơng phẩm học hàng thực phẩm, tập II. HN) Khả năng hoạt động của các Enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài. Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô đƣợc xác định nhƣ khả năng hoạt động phân giải casein ở tôm càng xanh và tôm đất thấp hơn ở Penaeus pencillatus, P. monodon và P. japonnicus. 15 Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về protease đầu tôm biển và thạc sĩ Nguyễn Thị Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các Enzyme tiêu hoá protein là các Enzyme hoạt động mạnh trong môi trƣờng kiềm. Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease từ tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trƣờng gần trung tính. Nhƣ vậy, qua một số nghiên cứu của một số tác giả cho thấy Enzyme từ tôm nói chung là các protease kiềm tính. Các Enzyme này đều có tính chất chung của Enzyme là: - Hoà tan đƣợc trong nƣớc, dung dịch nƣớc muối và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào tính chất này để tách chiết chúng. - Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hoà (sulphatamon), ethanol, acetone để thu chế phẩm Enzyme. - Hoạt tính của Enzyme có thể tăng hoặc giảm dƣới tác dụng của các chất hoạt hoá hoặc chất ức chế. - Độ hoạt động của Enzyme chịu ảnh hƣởng lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trƣờng… 2.2.3.2. Phân loại Có nhiều cách phân loại protease tuỳ theo khả năng thuỷ phân khác nhau mà các protease có các đặc tính khác nhau. Nhóm Enzyme này có tác dụng thuỷ phân protide, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thủy phân liên kết peptide mà còn có thể thuỷ phân cả liên kết ester và có thể xúc tác cho chuyển vị gốc acid amine. Tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau. - Trypsin Loại Enzyme này có trong dịch vị tuỵ tạng. Trypsin trong động vật thuỷ sản nói chung và trong tôm nói riêng, tồn tại ở dạng không hoạt động gọi là trypsinogene chúng đƣợc hoạt hoá bởi Enzyme enterokinase. Trypsin là loại protease kiềm tính, phân tử lƣợng khoảng 23.800 Da, điểm đẳng điện ở pH=10,5. Đa số trypsin hoạt động ở pH thích hợp là 8,0; khả năng tác dụng của trypsin khá mạnh với các loại protide với phân tử lƣợng thấp ở các mối liên kết peptide, ester. Trypsin từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 380C khi cho tác dụng với cơ chất là casein trong 24 giờ. 16 - Peptidase, ereptase (erepsin) và các loại khác Peptidase tham gia thuỷ phân liên kết peptide trong phân tử protide và các polipeptide. Khả năng tác dụng cũng nhƣ tính đặc hiệu của Enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm kề bên mối liên kết peptide. - Carbohydrase Enzyme này xúc tác thuỷ phân các glucid và glucozit. 2.3. Chitin 2.3.1. Đại cƣơng về Chitin [2] Lịch sử phát hiện Cách đây hơn 180 năm, Chitin lần đầu tiên đƣợc tìm thấy bởi Braconnot vào năm 1811, khi ông thu đƣợc một chất có khả năng bền với kiềm và gọi là “Fungin” từ nấm bậc cao. Sau đó, tên Chitin đƣợc Odier đề nghị vào 1923 khi tách đƣợc một polisaccharide từ cánh cứng của bọ da. Ngày nay, Chitin đƣợc phát hiện ở cả động vật lẫn thực vật. Phân bố Chitin hiện diện ở thực vật bậc thấp. Trong thế giới thực vật, Chitin chỉ giới hạn ở loài nấm, tảo lục, địa y, noãn khuẩn. Ở tôm, Chitin hiện diện ở dạng kết hợp với các thành phần khác. Chitin hiện diện ở động vật bậc thấp. Chitin là thành phần cấu tạo nên xƣơng hữu cơ chính ở động vật không xƣơng sống (trùng đốt, tiết túc, nhuyễn thể, côn trùng). Đối với ngành tiết túc Chitin chỉ là một trong những thành phần cấu tạo của bộ xƣơng ngoài. Trong thiên nhiên, dạng Chitin nguyên chất chỉ tồn tại trong nang của loài mực ống Logigo. Ở thủy sản, Chitin tồn tại rất nhiều, đặc biệt là vỏ tôm, cua, ghẹ, nang mực,… hàm lƣợng cao. Vì vậy, phần lớn Chitin đƣợc chiết xuất từ vỏ của các loài giáp xác nhất là vỏ tôm, kế đó là vỏ cua, ghẹ. Ở vỏ tôm cũng nhƣ vỏ cua, Chitin tạo phức hệ với protein và thƣờng chứa thêm một tỉ lệ lớn CaCO3. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể. Trong tự nhiên hiếm thấy Chitin tồn tại ở dạng tự do, nó liên kết dƣới dạng phức hợp Chitin – protein, Chitin với các hợp chất vô cơ,…Khi tồn tại nhƣ thế, Chitin có khả năng đề kháng đối với các chất 17 thủy phân hóa học và Enzyme, gây khó khăn cho việc tinh chế, tách chiết. Tùy thuộc vào đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, ngƣời ta có thể thấy có sự thay đổi về lƣợng và chất Chitin. Mặc dù gặp rất nhiều khó khăn trong việc chiết tách Chitin nhƣng ngƣời ta đã khẳng định về sự hiện diện của Chitin ở thực vật lẫn động vật dựa vào phép đo quang học, phân tích bằng tia X và phân cắt bởi Enzyme hay phản ứng hoá học. Thành phần Chitin của một số phế liệu thủy sản [8] Phế liệu Thành phần Chitin (%) Vỏ hến Vỏ ốc Vỏ cua đồng Vỏ tôm đồng Vỏ tôm biển 0,4 1,24 23,8 30,0 33,1 Cấu tạo Chitin là một trong những polisaccharide đƣợc tìm thấy nhiều trong tự nhiên, nhiều thứ hai chỉ sau cellulose. Chitin đƣợc cấu tạo bởi các đơn vị 2 acetamido-2 deoxy-D glucose nối với nhau bằng liên kết - 1, 4 glycoside. Chitin đƣợc xem là dẫn xuất từ cellulose, trong đó gốc – OH ở vị trí C2 đƣợc thay thế bởi gốc acetamide NHCOCH3. Điểm giống nhau của liên kết glucoside ở Chitin và cellulose đƣợc thể hiện qua nhiệt lƣợng toả ra tƣơng đƣơng nhau vào khoảng 29 Kcal/mol.  Công thức hoá học của Chitin (C8H13NO5)n, trong đó: C = 47.29 %. H = 6.45 %. N = 6.89 %. O = 39.37 %. 18  Công thức cấu tạo của Chitin Chitin đƣợc tách ra từ nấm, giáp xác, côn trùng có cấu tạo tƣơng tự nhau. Đặc tính lý hoá học - Chitin có cấu tạo tinh thể bền vững, hiếm thấy ở trạng thái tự do mà thƣờng liên kết với protein bởi nối cộng hoá trị dƣới dạng Chitin - protein phức hợp. - Chitin không tan trong alcol, trong dung dịch acide và kiềm loãng hay đậm đặc, và các dung môi thông thƣờng. - Chitin có thể tan trong H2SO4 đậm đặc, H3PO4 78–97% và acide formide khan. - Trong dung dịch HCl, Chitin có độ triền quang thay đổi từ -140 đến +560. Sự thay đổi này chứng tỏ có sự thủy giải Chitin. - Độ phân tán của dung dịch keo Chitin trong các dung dịch muối trung tính ngậm nƣớc tƣơng đối cao. - Chitin hấp thụ tia hồng ngoại ở bƣớc sóng = 884-990 cm-1. - Trong môi trƣờng kiềm đun nóng Chitin sẽ bị khử một số nhóm Acetyl ra khỏi mạch polymer tạo thành dẫn xuất Chitosan. Một vài tính chất quan trọng của Chitin thƣơng phẩm [8] Các chỉ tiêu kỹ thuật Chitin Kích thƣớc 2 – 5 mm Độ ẩm < 10% Tro < 2% Protein < 3% Mùi Không mùi Màu Trắng 2.3.3. Sự tổng hợp Chitin ở loài giáp xác Billard quan sát trên loài giáp xác Decapoda cho biết sự tổng hợp của Chitin theo sau giai đoạn lột xác. Glycogen đƣợc sử dụng hoàn toàn và tích tụ khi lớp vỏ 19 mới đƣợc hình thành. Sự tổng hợp Chitin ở giáp xác liên quan đến việc sử dụng glycogen và nó phải chuyển sang dạng đơn giản hơn là D-glucose. Sự tổng hợp và phân hủy Chitin ở giáp xác rất tích cực vì phần lớn lớp vỏ bị tiêu hủy chỉ đƣợc hình thành lại sau mỗi lần lột xác. Trong giai đoạn này sự thiếu thức ăn làm vỏ mỏng hơn cho thấy khả năng sử dụng Chitin nhƣ một chất biến dƣỡng và dự trữ. 2.3.4. Ứng dụng của Chitin Từ những năm 30 của thế kỷ này, việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất hoá lý và ứng dụng của Chitin đã đƣợc công bố. Cho đến nay, Chitin đƣợc đƣa vào ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, cả lĩnh vực công nghệ sinh học và đạt hiệu quả cao. Trong công nghiệp nhẹ - Trong công nghệ làm giấy, Chitin là một thành phần phụ gia rất tốt, đặc biệt cho giấy cao cấp. - Chitin đƣợc dùng để sản xuất vải, bao, dây điện và dụng cụ bảo hộ lao động do có khả năng chống nƣớc, lửa và chịu nắng. Trong công nghệ làm sạch môi trƣờng Chitin dùng để xử lý nƣớc thải công nghiệp, có khả năng tạo phức chất với những kim loại nặng, độc hại; dùng để lọc nƣớc sạch cho tiêu dùng. Trong công nghiệp thực phẩm - Chitin dùng để bảo quản thực phẩm, rau quả, ngăn cản sự phá huỷ của nấm mốc và vi sinh vật. - Khi sử dụng Chitin chất lƣợng nƣớc quả tốt hơn so với khi sử dụng các chất khác nhƣ: silicasol, gelatin,… - Chitin đƣợc sử dụng trong thực phẩm chế biến để thu hồi lƣợng protein hao hụt. - Chitin đƣợc dùng làm phụ gia thực phẩm với tác dụng làm đặc và chuyển thành sữa. Trong y tế +Ngành dƣợc Chitin có tác dụng ngăn chặn khả năng sinh sản và sự tồn tại đặc trƣng của loài Anophelles stephensi. Hợp chất Chitin-protein có khả năng diệt đƣợc giun sán mà không độc đối với cơ thể. 20 +Ngành y - Từ Chitin sản xuất ra Chitosan có thể dùng sản xuất chỉ khâu phẩu thuật mà không cần phải cắt chỉ. - Vì đƣợc chiết xuất từ phế liệu tôm, từ Chitin tạo Chitosan là nguồn nguyên liệu thiên nhiên sơ cấp để tạo ra glucosamine. Glucosamine, thƣờng kết hợp với chondroitin sulfate để điều trị bệnh viêm khớp xƣơng mãn tính, một bệnh phổ biến trên thế giới. - Chitosan đƣợc phát hiện có tác dụng tăng cƣờng vận chuyển thuốc qua các bề mặt biểu mô và vì vậy có thể sử dụng Chitosan kết hợp với thuốc để giúp chúng thu hút về các vị trí nhƣ niêm mạc mũi. Chitosan có thể mở các liên kết tế bào biểu mô nhờ đó cho phép thuốc đi qua. Tác dụng này có thể đƣợc sử dụng để đƣa thuốc vào cơ thể bằng cách xông qua mũi thay vì phải tiêm. - Kết hợp với máu, Chitosan có tác dụng làm đông máu. Vì vậy, sử dụng Chitosan để băng bó vết thƣơng. Chitosan còn có đặc tính kháng khuẩn, ngƣời ta hi vọng dùng băng chứa Chitosan để băng vết thƣơng giảm tỷ lệ nhiễm trùng. - Chitosan có tác dụng vận chuyển gen không có virut. Các dẫn xuất của Chitosan không độc và có hiệu quả tạo ra gen, nhất là các tế bào ung thƣ vú. Những đặc tính này rất đáng quan tâm, vì một ngày nào đó các dẫn xuất Chitosan có thể đƣợc dùng để tạo ra gen trong điều trị chống ung thƣ, cũng nhƣ các dạng thuốc khác. Trong mỹ phẩm Chitin dùng làm các chất phụ gia, kem bôi mặt, thuốc mềm da, tăng khả năng hoà tan sinh học giữa kem thuốc và da, chế tạo thuốc định hình tóc, kem bôi da, lột mặt. Trong nông nghiệp +Trong trồng trọt - Làm phân bón cho cây trồng, là chất kiểm soát sự phân li hơi chất hoá học nông nghiệp. - Chitin là thành phần chính trong thuốc phòng trừ sâu bệnh, dùng làm thuốc kích thích tăng trƣởng cho cây trồng. - Làm tăng độ nảy mầm hạt và tạo diệp lục tố trên lá, tăng khả năng tăng rễ, thúc đẩy quá trình ra hoa kết quả. +Trong chăn nuôi 21 Chitin dùng làm thức ăn tăng trọng cho gia súc, gia cầm, kìm hãm bệnh tiêu chảy ở gà thịt. Trong công nghiệp chế biến gỗ: làm tăng độ bền của gỗ. Trong công nghệ điện tử và bán dẫn: làm màng bọc lót các linh kiện. Trong công nghệ sinh học: dùng để cố định Enzyme và các tế bào sinh vật. Một số ứng dụng khác: Chitin bị sulfate hoá hoàn toàn, đƣợc dùng làm chất kết dính trong kem đánh răng, keo… 2.3.5. Tình hình nghiên cứu Chitin trên thế giới và ở Việt Nam [2] 2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ Chitin trên thế giới Năm 1971, Allan và cộng sự đã dùng Chitosan để kết tủa agaropectin trong agar và chiết agarose. Somchai đã báo cáo kết quả dùng Chitosan để làm giảm phần tử điện tích âm trong agaropectin và có thể nhận đƣợc agar tinh khiết hoặc agarose. Năm 1972, hãng Kyowa Oid and Fat của Nhật lần đầu tiên đƣa vào sản xuất công nghiệp Chitin. Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của Chitin và protein trong vỏ tôm, cua, đã cho thấy việc thu hồi các chất này rất có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần Chitin thu đƣợc, đƣợc dùng sản xuất ra các dẫn xuất có nhiều ứng dụng khác nhau. Sản lƣợng Chitin 1990 trên thế giới là 1200 tấn. Nƣớc sử dụng hàng đầu là Nhật (600 tấn/năm) và Mỹ (400 tấn/năm). Ngoài ra nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp cũng đang triển khai thêm các cơ sở sản xuất ở qui mô 50 kg Chitin/ngày với giá bán ra là 200-300 France/kg. Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị về các chế phẩm Chitin-Chitosan sử dụng là 355 triệu USD, trong đó 190 triệu thuộc ngành y tế, sau đó nông nghiệp (54 triệu) và mỹ phẩm (50 triệu). Theo FAO, nhu cầu Chitin-Chitosan có thể lên tới 36700 tấn/năm trong thập kỷ tới. (Nguyễn Văn Khoa, 1994) Các phòng thí nghiệm của Malaysia và công nghiệp làm ngọt nƣớc biển đã thành lập công ty liên doanh Seafresh Chitosan để khai thác khả năng cung cấp thƣơng phẩm các chất thƣơng phẩm các chất dẫn xuất của tôm. Công ty này đặc biệt quan tâm với Chitin và polisaccharide từ vỏ tôm thải bỏ và hƣớng hoạt động chính vào các thị trƣờng xuất khẩu. 22 Theo tiến sĩ Arisol Alimuniar - giám đốc kỹ thuật, ông hy vọng sản xuất khoảng 150-180 triệu sản phẩm Chitin-Chitosan /năm góp phần cùng các nƣớc sản xuất chính khác nhƣ Nhật Bản, Mỹ, Na Uy, Canada và Nga. Giá cả của các loại sản phẩm Chitin-Chitosan biến động từ 30 USD đến 400 USD/kg tuỳ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm, lƣợng bán Chitin và Chitosan đạt khoảng 2 tỷ USD. (Nguyễn Đổng, 1994) Nhiều nƣớc nhƣ Nhật, Mỹ, Anh, Hội Chitin thuộc cộng đồng Châu Âu “ECCHIS” đã và đang nghiên cứu một cách có hệ thống và đề cập nhiều nội dung khoa học trong đó có việc ứng dụng Chitin nhƣ một chất hấp phụ trao đổi ion để tinh chế nƣớc giải khát. Hiện nay, có khoảng 10 công ty lớn, hầu hết ở Nhật, sản xuất Chitin – chitosan trên thế giới. Công ty Protan biopolymer, một trong những công ty lớn trên thế giới sản xuất Chitin – Chitosan đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc Chitin sử dụng để xử lý nƣớc, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và nhiều ứng dụng khác trong nông nghiệp. Ngày nay, ngƣời ta tập trung vào các dẫn xuất của Chitin và khả năng ứng dụng của những dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của R.A.A. Muzzarelli (Đại Học Y Khoa Ancona – Ý) tập trung vào Chitin và dẫn xuất của nó. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất Chitin – Chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, nhƣng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ. 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam Việc nghiên cứu, sản xuất Chitin – Chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất, phục vụ đời sống là một vấn đề tƣơng đối mới ở nƣớc ta. Năm 1978, trƣờng Đại Học Thủy Sản bắt đầu nghiên cứu chiết tách Chitin – Chitosan. Trƣớc yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản ngày càng cấp bách, trƣớc những thông tin khoa học, kỹ thuật mới về Chitin – Chitosan, cũng nhƣ tiềm năng thị trƣờng của chúng, đã thúc đẩy các nhà khoa học nƣớc ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin – Chitosan ở bƣớc cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng ở các lĩnh vức khác nhau. Gần đây, khi Chitin – Chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có gía trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu nhƣ: trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. 23 HCM, Đại Học Tổng Hợp TP. HCM, Đại Học Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ,… đã tập trung vào nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng công nghệ này. Tuy nhiên, chất lƣợng sản xuất và những ứng dụng của nó chƣa đƣợc đánh giá đầy đủ. Ở phía Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí Nghiệp Thủy Đặc Sản Hà Nội sản xuất Chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và có hiệu quả bƣớc đầu. Ở phía Nam, Trung Tâm Công Nghệ và Sinh Học Thủy Sản phối hợp với một số cơ quan khác nhƣ: Đại Học Y Dƣợc TP. HCM, Phân Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam đã và đang nghiêu cứu, sản xuất và ứng dụng Chitin – Chitosan trong các lĩnh vực: nông nghiệp, y dƣợc và mỹ phẩm. 2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin Sơ đồ chung cho quá trình sản xuất Chitin Nguyên liệu Khử khoáng Khử protein Tẩy màu Chitin Nguyên liệu dùng trong sản xuất Chitin có thể sử dụng vỏ tôm, cua, ghẹ, nang mực,… Nguyên liệu có thể sử dụng nguyên liệu khô hoặc tƣơi. Tuy nhiên, việc sử dụng nguyên liệu khác nhau sẽ xử lý ở chế độ khác nhau. Chitin đã đƣợc tách chiết từ vỏ tôm từ hơn một thế kỉ nay, nhƣng cho đến nay việc tách chiết này vẫn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp hóa học là chính. 2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học Quy tắc chung: loại bỏ tạp chất (protein, khoáng, lipid) từ vỏ tôm. Ưu điểm: nhanh, dễ thực hiện Nhược điểm: - Tốn nhiều hóa chất - Gây ô nhiễm môi trƣờng - Ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời lao động 24 - Chất lƣợng sản phẩm lại không cao. Chế phẩm Chitin nhận đƣợc thƣờng có màu vàng do tác động của các hóa chất đƣợc sử dụng trong quy trình tách chiết (đều ở nồng độ cao). Bên cạnh đó, trong phƣơng pháp này, quá trình khử protein đƣợc thực hiện bằng NaOH: + NaOH ảnh hƣởng đến độ nhớt của Chitosan, cụ thể hơn là NaOH cắt mạch polysaccharide của Chitin, làm giảm độ nhớt của Chitosan xảy ra trong quá trình deacetyl hoá. + Dịch thủy phân protein sẽ loại bỏ do lẫn kiềm đồng thời acid amin của thủy phân không còn giá trị đích thực của chúng. Phƣơng pháp của Heckman Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch Sấy khô ở 1000C Nghiền thành bột Ngâm trong HCl 2N trong 48 giờ (có lắc hoặc khuấy liên tục) Ly tâm Trung hòa bằng dung dịch NaOH ở 1000C trong 12 giờ Tách cặn Rửa, ly tâm theo thứ tự: nƣớc, ethanol, ether Làm khô Nghiền tinh Bột Chitin có màu kem 25 Phƣơng pháp của Samuer P. Meyers và Keuns. Lee Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch và làm khô Xay nhuyễn, sàng Tách protein: NaOH 3,5%, 2 giờ, 650C Lọc, rửa sạch Tách vô cơ: HCl 1N, 30 phút, nhiệt độ phòng Lọc, rửa sạch Tẩy màu bằng Aceton Rửa sạch, làm khô ở 600C, 6 giờ Chitin Phƣơng pháp của Trƣờng Đại học Thủy sản (Nha Trang) Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch Phơi khô Ngâm vỏ tôm trong HCl 5% ở nhiệt độ phòng, 48 giờ Rửa sạch Thủy phân bằng NaOH 8% ở 1000C trong 48 giờ Rửa sạch Tẩy màu với KMnO4 1%, H2SO4 10% trong 1 giờ Rửa sạch 26 Khử màu lần 2 bằng Na2S2O3 trong 15 phút Rửa sạch Sấy khô Chitin Phƣơng pháp của Nguyễn Thị Anh Đào và Nguyễn Thị Thu Thủy (LVTN, 1993) Phế liệu tôm Rửa sạch, tách thịt Vỏ tôm Rửa sạch, làm khô Tách protein bằng NaOH 3.5%, W:V= 1:15, 80 – 1000C 75 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng) Rửa sạch Tách vô cơ bằng HCl 1N, W:V= 1:10 ( Tôm thẻ) = 1:15 (Tôm choáng) Ở nhiệt độ phòng, 60 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng) Rửa sạch, làm khô Chitin thô Tẩy màu bằng Javel W:V=1:20-1:30, 10 phút hoặc H2O2 3% / NaOH 5%, W:V= 1:20-1:30, 3 giờ (Tôm thẻ), 4 giờ (Tôm choáng) Chitin 27 2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học Trong thời gian gần đây, phƣơng pháp chế biến sinh học, sử dụng các Enzyme protease để khử protein trong nguyên liệu để thay thế cho NaOH, Enzyme này có thể có nguồn gốc từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu áp dụng để thay thế phƣơng pháp hóa học nhằm hạn chế những khiếm khuyết do phƣơng pháp hóa học gây ra. Trong các loại protease thì chimotripsin papain và protease của vi sinh vật đƣợc sử dụng hiệu quả. * Trần Thị Luyến và cộng tác viên trƣờng Đại học Thủy Sản đã nghiên cứu thành công sử dụng Enzyme papain làm tác nhân thủy phân protein của vỏ tôm trong công nghệ sản xuất Chitin theo quy trình sau: Vỏ tôm khô Vỏ tôm tƣơi Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/10V, Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/5V, nhiệt độ phòng trong 5 giờ nhiệt độ phòng trong 5 giờ Rửa sạch Khử protein bằng papain 13%, tỉ lệ 1W/5V, pH=5 ÷ 5.5, 70-800C, 4 giờ Rửa sạch Tẩy màu Làm khô ở 600C Chitin Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao, đặc biệt độ deacetyl cao. Nhƣ vậy, để nâng cao chất lƣợng của Chitosan có thể sử dụng Enzyme papain thay thế cho NaOH khử vỏ tôm. 28 Ngoài ra, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam còn tách chiết Chitin nhờ sử dụng Enzyme bromelin từ dịch ép vỏ dứa – Enzyme với hoạt tính thủy phân protein mạnh theo quy trình sau [5]: Vỏ dứa Vỏ + đầu tôm tƣơi Nghiền nhỏ Phơi khô Chiết rút Enzyme protease Sấy lại cho khô giòn ở 400C bằng nƣớc máy từ 2-3 lần Nghiền nhỏ Xử lý bột đầu - vỏ tôm với dịch ép vỏ dứa đến khi toàn bộ lƣợng khoáng trong nguyên liệu bị loại bỏ hết (thử với dung dịch HCl) Rửa sạch Lƣợng protein còn lại đƣợc loại bỏ tiếp bằng dung dịch NaOH 1% hoặc 2% Rửa sạch Tẩy màu với KMnO4 0.1%, C2H2O4 1% Sấy khô Chitin Ưu điểm của phương pháp: - Sử dụng nguồn protease từ nƣớc ép vỏ dứa, hoàn toàn không cần đến HCl, một thành phần quan trọng hàng đầu không thể thiếu trong phƣơng pháp hóa học để loại bỏ chất khoáng. - Tốn ít NaOH - Hiệu suất thu hồi Chitin cao hơn - Chất lƣợng chế phẩm Chitin cũng tốt hơn phƣơng pháp hóa học thông thƣờng. Nhược điểm: Mất nhiều thời gian hơn phƣơng pháp hóa học. 29 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của phòng Các chất có hoạt tính sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới. 3.2. Nguyên liệu Nội tạng và vỏ tôm dùng trong thí nghiệm đƣợc thu về từ các công ty chế biến thủy sản trong thành phố. Nội tạng đƣợc thu trực tiếp tại bàn xử lý của phân xƣởng chế biến các công ty trên, sau đó cho vào các túi PE, cấp đông và bảo quản ở - 200C. Hình 3.1: Nội tạng tôm Vỏ tôm tƣơi rửa sạch. Một phần để ráo trên rổ thƣa trong 30 phút, đem xay nhỏ. Một phần đem phơi khô, sau đó sấy lại cho khô giòn ở 400C rồi xay nhỏ. Đây là 2 nguồn nguyên liệu vỏ tôm khô và tƣơi để thu nhận Chitin. 3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng  Hoá chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm.  Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng: - Cân điện tử 2200g độ chính xác 10-6(g) SATORIUS – CHLB Đức - Máy đo quang phổ UV - Vis - Máy ly tâm lạnh ROTINA - CHLB Đức - Máy đo pH – PHM 83 Autical pH meter – Đan Mạch - Bể ổn nhiệt 30 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu [4] 3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford Ưu điểm - Dễ sử dụng, hoá chất đơn giản (chỉ cần một loại thuốc thử) - Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở hàm lƣợng 1-20 g) - Ít tốn thời gian - Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định. - Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, n