Khóa luận Tìm hiểu một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm

LBII tiếp tục ủ ở 30oC trong 24 giờ. Quy trình tăng sinh một giai đoạn được thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB (đã được làm ấm ở 45oC nếu mẫu thử là các sản phẩm của sữa và ở 30oC đối với các sản phẩm khác) và tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây. Ủ ở 30oC trong 48 giờ. 2.3.4.2. Phân lập Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, trải sang 1/2 đĩa môi trường Oxford Agar. Từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang 1/2 đĩa còn lại. Ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Trên môi trường này khuẩn lạc Listeria có màu xám hay nâu được bao quanh bởi vòng đen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, đường kính khoảng 1mm. 2.3.4.3. Khẳng định - Thử khả năng tan huyết: chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch Oxford, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường thạch máu, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc L.monocytogenes được bao quanh bởi vòng tan huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng . Trước khi tiến hành thử khẳng định, cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ L.monocytogenes sang một môi trường lỏng không chọn lọc, ủ ở 25oC trong 20 giờ. - Thử nghiệm catalase và oxidase: L.monocytogenes có catalase (+) và oxidase (-). - Nhuộm gram: Listeria nhuộm gram dương. - Khả năng di động phương pháp giọt treo: Listeria spp chuyển động xoay tròn trong canh trùng ủ ở 25oC. Thử tính di động trong ống nghiệm: cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong ống nghiệm, ủ 25oC trong 40 giờ hoặc lâu hơn, kiểm tra sự tăng trưởng của vi khuẩn xung quanh đường cấy, Listeria spp di động tạo hình chiếc dù cách bề mặt thạch vài mm. - Khả năng biến dưỡng đường: ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở 37oC trong 7 ngày. Kết quả (+) (màu vàng) thường quan sát được trong vòng 24 – 48 giờ L.monocytogenes lên men đường rhamnose nhưng không có khả năng lên men đường xylose. - Thử thử nghiệm CAMP: trên đĩa thạch dùng để thử CAMP, cấy S.aureus thành một đường cấy mỏng, tương tự cấy R.equi để tạo thành hai đường cấy song song cách nhau 4cm. Cấy chủng nghi ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai đường cấy song song của S.aureus và R.equi. Có thể cấy một hoặc nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ L.monocytogenes (chủng thử nghiệm) để kiểm tra trên cùng một đĩa. Cấy chủng đối chứng (+) L.monocytogenes và chủng L.innocua. Ủ đĩa ở 37oC trong 20 – 36 giờ. Phản ứng (+) khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết rộng (5 – 10mm) và có hình dạng đầu mũi tên. Phản ứng (+) với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn. L.monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và (-) với R.equi. Ngược lại, L.innocua có phản ứng CAMP (-) với cả hai loài S.aureus và R.equi. 2.3.4.4. Báo cáo kết quả Báo cáo phát hiện hoặc không phát hiện L.monocytogenes trong 25g mẫu. 2.4. Staphylococcus aureus 2.4.1. Tổng quan Thuộc nhóm tụ cầu khuẩn, Gram dương, hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S.aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu. Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc. Sản sinh ra nội độc tố enterotoxin bền nhiệt dẫn đến ngộ độc thực phẩm,các tế bào thường liên kết thành hình các chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả năng sinh coagulase làm đông huyết tương, không phân bố trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu trên da và tóc của người và động vật. Khi phát triển trong môi trường, tạo sắc tố có màu từ trắng tới vàng đậm. Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 2.4.2. Nguyên tắc S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. 2.4.3. Môi trường và hóa chất - Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng để phân tích định tính S.aureus hay trong định lượng bằng phương pháp MPN. - Môi trường thạch máu: Máu được sử dụng là máu cừu hay bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chông đông citrate. Môi trường cần được pha chế ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. - Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA): thành phần lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng và làm nguội đến khoảng 60oC. - Môi trường thạch Tellurite Glycine Agar (TGA). - Môi trường Brain Heart Infusion (BHI). - Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ được cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và được phân phối 0,3ml vào các ống nghiệm nhỏ. 2.4.4. Phân tích định tính Staphylococus aureus: Lấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB, trộn đều và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ ống (+) (môi trường chuyển từ đỏ sang màu vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1 – 1,5mm có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết luận là có S.aureus khi thử nghiệm coagulase này (+) (có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng không có). 2.4.5. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.4.5.1. Đồng nhất mẫu và pha loãng Cân chính xác 10 0,1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc/đĩa. 2.4.5.2. Phân lập trên môi trường chọn lọc Cấy 0,1ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi độ pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 1oC trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu. Sau 24 giờ, khuẩn lạc S.aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính khoảng 0,5 – 1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S.aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S.aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc. Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2mm. Hầu hết S.aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này. 2.4.5.3. Khẳng định Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 1oC trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 1oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. 2.4.5.4. Kết quả Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là S.aureus đã đếm trên các đĩa petri và dựa vào tỷ lệ số ống phản ứng coagulase dương tính trên tổng số ống thử phản ứng, áp dụng công thức dưới đây để tính số lượng S.aureus trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu. Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: F: độ pha loãng. Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng. Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng. Ht: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng. Ha: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng. 2.4.6. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ S.aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với ba độ pha loãng thập phân liên tiếp (ví dụ 10-1,10-2,10-3). Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có thể sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng). Môi trường được sử dụng là canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứa 10% muối NaCl. Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống 10ml môi trường, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker để thực hiện thử nghiệm khẳng định S.aureus tương tự trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc. Các đĩa cho kết quả khẳng định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN để suy ra mật độ S.aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml). 2.5. Bacillus Cereus 2.5.1. Tổng quan B.cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 – 50oC, tối ưu ở 35 – 40oC; pH dao động từ 4,5 – 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…). Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Loài này phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than ở người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng. 2.5.2. Nguyên tắc B.cereus được phát hiện và định lượng bằng môi trường thạch chọn lọc: Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA). Khuẩn lạc B.cereus có hình thái đặc trưng trên các môi trường này. Các khuẩn lạc này có thể tiếp tục khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0,001% lysozyme. Ngoài ra B.cereus cũng đươc định lượng bằng phương pháp MPN. 2.5.3. Môi trường và hóa chất - Nước pepton đệm Buffered Peptone Water (BPW). - Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP). - Thạch Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA). - Môi trường thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL). - Nhũ lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50%. - Canh Trypticase Soy Polymycin (TSP). - Canh Phenol Red Glucose. - Thạch Tyrosine. - Canh Lysozyme. - Môi trường thử nghiệm Voges-Proskauer. - Canh Nitrate Broth. - Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar cho B.cereus. - Thạch máu Trypticase Soy Sheep. - Môi trường kiểm tra sự di động. - Thuốc thử nitrate (dung dịch A, dung dịch B). - Hóa chất nhuộm Gram. 2.5.4. Quy trình phân tích Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường pepton đệm (BPW) đồng nhất để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục được pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp. 2.5.4.1. Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: a. Phát hiện bằng môi trường chọn lọc Trải 0,1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ 24 giờ ở 30oC. Do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ lecithinase được tạo thành. Trường hợp sử dùng môi trường MOSSEL, khuẩn lạc B.cereus to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định B.cereus. b. Các thử nghiệm khẳng định Nhuộm Gram: cấy ria các khuẩn lạc chọn từ môi trường MYP hay MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng. Ủ ở 30oC trong 24 giờ. Sau đó tiến hành nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi. Việc nhuộm Gram có thể được thực hiện bằng phương pháp Jensen hay phương pháp Hucker. Trước tiên, tạo vệt bôi vi sinh vật trên phiến kính. Chọn một phiến kính sạch, dùng bút ghi trên kính vẽ 1 vòng tròn đường kính khoảng 2cm ở mặt dưới của phiến kính. Đặt ở vị trí tương ứng với vòng đánh dấu ở mặt trên của phiến kính vài giọt nước cất thành một giọt lớn. Dùng que cấy vòng chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên phiến kính, khuấy nhẹ bằng đầu que cấy để được huyền phù đồng nhất và bôi đều trong khu vực của vòng tròn. Trường hợp chủng nằm trong dịch nuôi cấy thì dùng que cấy vòng chuyển vài vòng dịch tế bào lên vùng vòng tròn ở trung tâm bề mặt phiến kính, bôi đều trong khu vực của vòng tròn. Để yên cho vệt bôi khô. Dùng tay giữ hai cạnh của một đầu phiến kính, đưa phiến kính (ở vị trí cạnh vệt bôi) qua lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen để cố định vệt bôi trên kính. Tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa. Thực hiện tương tự để tạo một vệt bôi chung hai chủng vi sinh vật đối chứng trong cùng một phiến kính khác. Sử dụng E.coli làm chủng đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+). Theo phương pháp Jensen, nhỏ vài giọt dung dịch methyl violet lên vệt bôi, giữ yên trong 20 giây. Dùng bình xịt nước, bơm nước lên vệt bôi để rửa sạch phẩm nhuộm. Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Dùng bình xịt chứa cồn 95%, bơm cồn lên vệt bôi, rửa phẩm nhuộm đến vừa mất màu. Để yên vài giây sau đó rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dừ bằng giấy lọc. Theo phương pháp của Hucker, bằng thao tác tương tự như ở phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi 1 phút bằng dung dịch crystal violet. Rửa bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch KI/I2 trong 1 phút. Khử màu bằng cách xịt cồn 95% cho đến khi sạch màu. Rửa lại bằng nước và nhuộm bằng dung dịch safranin trong 2 phút. Sau khi thực hiện xong quy trình nhuộm, quan sát màu nhuộm của tế bào bằng vật kính 100X nhúng trong dầu. Tế bào nhuộm Gram (+) có màu tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.coli). B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi. Bào tử hình bầu dục, không có dạng nang bào tử. Dùng que cấy vòng cấy chuyền một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0,5ml BPW vô trùng. Huyền phù hóa dịch này để sử dụng cho các phản ứng sinh hóa. - Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth, ủ ở 35oC, 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông qua độ đục và sự chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose trong điều kiện kỵ khí. - Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml môi trường canh Nitrate Broth, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Kiểm tra sự hiện diện của nitrite bằng cách bổ sung vài giọt dung dịch A và dung dịch B của thuốc thử nitrate. Nếu có màu cam xuất hiện trong vòng 10 phút thì chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrite. - Thử nghiệm VP: Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đã ủ 18 – 24 giờ trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC trong 24 – 48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường, là (-) khi bề mặt môi trường không đổi màu. - Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng Tyrosine, ủ ở 35oC trong 48 giờ. Sự xuất hiện của sinh khối, khuẩn lạc là chỉ thị tyrosine bị phân hủy. - Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2,5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0,001% lysozyme. Thực hiện tương tự với môi trường Nutrient Broth không chứa lysozyme. Ủ ống nghiệm ở 35oC trong 24 giờ. Kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa lysozyme và môi trường đối chứng. Ủ những ống âm tính thêm 24 giờ trước khi kết luận kết quả thử nghiệm. c. Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm 1 Để phân biệt các loài khác nhau trong Bacillus nhóm 1 cần tiến hành bổ sung các thử nghiệm sau: - Thử nghiệm tính di động: dùng que cấy vòng cấy dịch 24 giờ nuôi cấy thẳng vào giữa môi trường kiểm tra di động cho B.cereus. Ủ ở 30oC, từ 18 – 24 giờ và kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc dọc theo đường cấy. Loài di động mọc khuếch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy. Loài không di động chỉ mọc trong và dọc theo đường cấy. Bổ sung 0,2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar. Cấy huyền phù vi khuẩn vào. Ủ thạch nghiêng từ 6 – 8 giở ở 30oC. Nhỏ nước vô trùng lên phiến kính và đặt sinh khối vào. Quan sát ngay dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động. Hầu hết các chủng B.cereus và B.thuringiensis là di động, B.anthracis và hầu hết các chủng B.mycoides không di động. - Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ nuôi cấy lên giữa đĩa Nutrient Agar. Ủ ở 30oC trong 48 – 72 giờ. Kiểm tra sự phát triển của rễ giả, đặc trưng bởi việc tạo những khuẩn lạc có cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy. B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo những nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides. - Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy. Ủ ở 35oC trong 24 giờ. B.cereus làm tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn () 2 – 4mm xung quanh vùng phát triển. B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu . B.anthracis thường không làm tan máu sau 24 giờ. - Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể: cấy huyền phù tế bào 24 giờ lên ống thạch nghiêng Nutrient Agar, ủ 24 giờ ở 30oC, sau đó để ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày. Thực hiện nhuộm bằng phẩm màu fuchsin. Quan sát dưới kính hiển vi những tinh thể độc tố hình tứ giác (dạng kim cương) được nhuộm màu tối nhỏ hơn bào tử. Tinh thể độc tố của B.Thuringiensis xuất hiện nhiều sau 3 – 4 ngày nuôi cấy nhưng không thể phát hiện được bằng kỹ thuật nhuộm cho đến khi bào tử nang vỡ ra. Do đó, nếu không quan sát được bào tử tự do, cần để thêm vài ngày ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không có tinh thể độc. d. Cách tính kết quả Tính số tế bào B.cereus trên 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha loãng và hiệu chỉnh bằng tỷ lệ khẳng định (% khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus). Ví dụ, số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10-4 là 65, và có 4 trong số 5 khuẩn lạc được chọn xác nhận là B.cereus sau khi kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa. Như vậy, số tế bào B.cereus trong 1g thực phẩm là 65 4/5 10.000 10 = 5.200.000 (phải nhân với 10 vì chỉ có 0,1ml mẫu được sử dụng để trải đĩa). 2.5.4.2. Định lượng B.cereus bằng phương pháp MPN Phương pháp MPN được sử dụng để định lượng B.cereus trong những mẫu thực phẩm không được có B.cereus nhiều hơn 10 tế bào/g. Phương pháp này cũng được sử dụng để kiểm tra những mẫu thực phẩm có tinh bột khô mà phương pháp đếm khuẩn lạc không thích hợp. Cấy 1ml mẫu có độ pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 vào ống nghiệm chứa 10ml canh Trypticase Soy-Polymycin. Thực hiện 3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi độ pha loãng (hệ 9 ống nghiệm). Ủ ở 30oC trong 48 2 giờ. Kết quả là (+) khi có sự tăng trưởng của B.cereus. Cấy ria từ các ống (+) lên môi trường thạch MYP. Ủ đĩa ở 30oC trong 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc màu hồng eosin, lecithinase (+), cấy chuyển sang thạch nghiêng Nutrient Agar để tiến hành các phản ứng sinh hóa khẳng định B.cereus. Dựa vào bảng MPN tính trị số MPN/g mẫu dựa vào số ống (+) B.cereus được khẳng định: TSP (+), MYP (+), các thử nghiệm sinh hóa khác. 2.6. Clostridium 2.6.1. Tổng quan Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Những loài thủy giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành acetic acid, butyric và rượu. Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số loài thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài Clostridium hiện diện trong đất, một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite thành sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C.botulinum và C.perfringens. Ngoài ra, loài C.tetani là tác nhân gây bệnh uốn ván, một số loài khác như C.novyi, C.perfringens, C.septicum, C.sordellii… gây hoại tử cho mô bị nhiễm, gây biến chứng tại các vết thương nhưng cho đến nay chưa xác định được các đặc điểm bệnh lý. Đặc điểm quan trọng của một số loài thuộc giống Clostridium thường gặp là như sau: - C. botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được trong môi trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng khác nhau trong loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A, B và F có hoạt tính thủy giải protein tạo nên một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis và Hobbs, trong khi đó kiểu kháng nguyên C, D, E không có các đặc tính này. Kiểu kháng nguyên A thường được tìm thấy trong các mẫu thịt trong khi đó kiểu E chỉ được phân lập từ các mẫu cá. - C.terani là loài kỵ khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với không khí. Loài này có đặc điểm tạo khối kết tụ khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Loài này được tìm thấy trong đất, trong phân các loài động vật và người, là loài gây bệnh uốn ván rất nguy hiểm. - C.perfringens là loại kỵ khí không bắt buộc, rất ít khí tạo bào tử trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trong môi trường Ellner, môi trường co bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline. Loài này có sáu kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm. 2.6.2. Nguyên tắc Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày. Nếu nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphide (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường. 2.6.3. Môi trường và hóa chất - Pepton đệm Buffered Peptone Water (BPW). - Iron Sulphite Agar (ISA). - Perfringens Selective Agar (hay Shahidi Ferguson Perfringens, SFP). 2.6.4. Quy trình phân tích Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 45oC và được phân tích ngay sau khi giải đông. Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Mẫu được tiếp tục pha loãng thập phân tùy mật độ hiện diện của Clostridium trong mẫu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 – 80oC trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác. Cấy vào đĩa vô trùng 1ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô trùng. Đổ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45oC vào đĩa, lắc đều. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP Agar. Một phương pháp khác là cho vào một ống nghiệm vô trùng 1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45oC vào ống, trộn đều mẫu. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt 2 – 3ml ISA hoặc SFP Agar. Đĩa hoặc ống nghiệm đã cấy mẫu được ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ trong các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực hiện ủ song song ở 37oC và 50oC. Thông thường, việc đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm. ISA là môi trường không chọn lọc nên các loài vi khuẩn sinh H2S khác không phải là Clostridium cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường này. Để khẳng định khuẩn lạc là Clostridium cần thực hiện thêm những quy trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết quả. 2.6.5. Báo cáo kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc đen, hoặc có thể bao quanh bởi vòng đen. Mật độ Clostridium trong mẫu được tính t