Khóa luận Tìm hiểu quy trình nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro

ảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rất rõ rệt. Skoog cố tìm bản chất hiện tượng kích thích sinh trưởng của DNA. DNA mới trích ly từ tinh dịch cá bẹ không có tác dụng nhưng nếu đem hấp trong hơi acid thì mẫu DNA mới cũng có hoạt tính như mẫu DNA cũ. Skoog cho rằng chất có hoạt tính là một sản phẩm phân giải của DNA. Năm 1955, chất này được xác lập là 6-furfurylaminopurine và được Skoog đặt tên là “Kinetin” do tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này, người ta chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hóa học tương tự kinetin điều khiển và gộp chung các chất này vào nhóm cytokinin. Chất cytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô. Nikkell (1956) nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris). Skoog và Miller (1957) công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Bergmanm (1960) công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được một huyền phù không có các tế bào dính cụm mà gồm hầu hết là tế bào đơn. Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, Lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Guha và Maheswari (1966) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược (Dautura inoxia). Một năm sau, nhóm Bourgin và Nitsch (1967) tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật: Điều kiện vô trùng: Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị nhiễm, chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao. Các chất khử trùng thường sử dụng: Bảng 1.2 : Các chất khử trùng Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý(phút) Hiệu quả Canxi hypochloride 9-10 5-30 Rất tốt Natri hypochloride 2 5-30 Rất tốt Hydro peroxit 10-12 5-15 Tốt Nước brôm 1-2 2-10 Rất tốt Clorua thủy ngân 0,1-1 2-10 Trung bình, độc Chất kháng sinh 4-5 mg/l 30-60 Khá tốt Phương tiện khử trùng: nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cấy. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ: Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy. Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 giờ/ngày. Cường độ chiếu sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Cường độ chiếu sáng cao kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy là 1000-7000 lux. Ngoài ra, chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35-40 cm. Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp. Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau. Trong đó, có một số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn. Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. Nguồn cacbon. Các vitamine và amino acid. Các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường. Các chất điều hòa tăng trưởng. a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng: Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe. Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo,… b. Nguồn cacbon: Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào. Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccharose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật. Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng đường hóa, làm môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào. c. Các vitamin và acid amin: Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau thì khác nhau. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol. d. Các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Nước dừa: được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Thông thường nước dừa được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp. Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy. Agar: là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ở nhiệt độ 60-1000C, đặc lại khi nhiệt độ xuống 450C. Vì vậy, agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường. Than hoạt tính: Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởng của mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2iP. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. e. Các chất điều hòa sinh trưởng: Các chất điều hòa sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản xuất với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo. Các chất điều hòa tăng trưởng gồm 2 nhóm chính: auxin và cytokinin. Ngoài ra còn có gibberlin, ethylene, abscisic acid (ABA). Auxin: Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát triển sinh hình thái, đặc biệt khi nó được phối hợp với cytokinin. Đặc tính của auxin: auxin là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA và cùng có vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin (như IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid). Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh). Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tổng hợp được), amino acid (như arginin) và nhất là các chất ortho diphenolic (như cafeic acid, chlorogenic acid). Cytokinin: Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và RNA. Hợp chất Cytokinin đầu tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là zeatin - một hợp chất có trong phần lớn thực vật và vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống Kinetin, nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin, hơn 30 loại cytokinin khác cũng được cô lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống kinetin. Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6 như BA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động lên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy các mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách, sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào lá trưởng thành. Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi. Như cậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp tạo rễ), cytokinin (giúp tạo chồi). Sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển. Các chất kích thích điều hòa tăng trưởng hầu như không tan trong nước cất vì vậy khi pha các chất này cần lưu ý: Nhóm auxin chủ yếu tan trong cồn hoặc bazơ. Nhóm cytokinin chủ yếu tan trong acid hay bazơ. Không nên pha một lượng dung dịch mẹ các chất sinh trưởng quá nhiều vì nó rất dễ biến tính. Gibberellin: Gibberellin là một nhóm trong các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác nhau. Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là có sườn gibbane, được trích ra từ thực vật, vi sinh vật và được đánh số sau chữ GA. Acid gibberellic3 (GA3) và hỗn hợp giữa GA3 với acid gibberellic7 (GA7) là những gibberellin duy nhất có giá trị thương phẩm do chúng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Ảnh hưởng của gibberellin trên sự phát sinh hình thái: khi bổ sung gibberellin vào trong môi trường nuôi cấy mô thực vật thì sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi soma. Ở mô sẹo thuốc lá, GA3 đặc biệt có tác dụng cản sự tạo chồi khi có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng và nó có tác dụng cản mạnh hơn khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện tối so với ngoài sáng. Trong thực vật, gibberellin có ảnh hưởng: Kích thích vươn thân qua kích thích phân bào và kéo dài tế bào. Tạo ra thân cao ngược với tính lùn cây. Kích thích vươn thân trong điều kiện ngày dài. Kích thích nảy mầm ở hạt cần xử lý lạnh hay ánh sáng để phát sinh nảy mầm. Kích thích sản xuất nhiều loại enzyme như - amylase ở các loại hạt ngũ cốc. Gibberellins ngoại sinh kích thích sự hình thành và phát triển trái. Phát sinh tính cái của hoa lưỡng tính. Ethylene: Ethylene được tổng hợp từ methionine ở nhiều loại mô khi phản ứng với stress. Dường như nó không cần thiết cho sinh trưởng sinh dưỡng. Nó chỉ là một hydrocarbon có ảnh hưởng trên thực vật. Đặc biệt nó được tổng hợp ở mô trái qua quá trình lão hóa hay đang chín đột phát. Là một chất khí, ethylene vận chuyển bằng phương thức khuếch tán từ nơi nó được tổng hợp. Có một chất trung gian rất quan trọng 1- aminocyclopropane – 1-carbonxylic acid (ACC) có thể được vận chuyển và có thể giải thích những ảnh hưởng của ethylene ở xa nơi gây ra sự kích thích. Ethylene có ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý của thực vật như: Sinh trưởng và biệt hóa chồi. Hình thành rễ bất định. Rụng lá và trái. Phát sinh ra hoa ở một loài thực vật. Phát sinh tính cái ở hoa lưỡng tính. Nở hoa. Lão hóa hoa và lá. Chín trái. Abscisic acid (ABA): ABA là một phân tử đơn. Tên gọi đầu tiên là abscisin II vì nó kiểm soát quá trình lão hóa ở cây vải. Vào cùng thời điểm đó có một nhóm khác được gọi tên là dormin tác động lên sự nảy mầm. Để trung hòa thì tên gọi mới là abscisic acid. Vì quy luật tác động của ABA trên sự rụng và lão hóa, nên ABA được coi là một chất ức chế. ABA ngoại sinh có tác động ức chế sinh trưởng ở thực vật, nên ABA được xem như là chất bắt đầu (như tổng hợp protein ở hạt) hay như một chất ức chế. ABA được tổng hợp từ mevalonic acid ở lá thuần thục khi phản ứng với stress thiếu nước. Trong hạt cũng giàu ABA do được tích lũy từ lá hay được tổng hợp in situ. Ảnh hưởng của ABA đến các quá trình sinh lý của thực vật: Đóng khí khổng: trong nước có nhiều ABA sẽ làm đóng khí khổng. Gây nên sự vận chuyển sản phẩm quang hợp để phát triển hạt và được hấp thu bởi phôi đang sinh trưởng. Phát sinh tổng hợp protein dự trữ trong hạt. Tác động ngược lại ảnh hưởng của gibberellin đến tổng hợp - amylase ở hạt ngũ cốc đang nảy mầm. Phát sinh và duy trì sự nảy mầm ở hạt và chồi. Quy luật tác động của ABA vẫn chưa xác định rõ, vì nó không chỉ tác động đến sự nảy mầm. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật: Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu. Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, clorua thủy ngân,… Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro. Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh. Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm. Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,… Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh sự thoát hơi nước ở lá. Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. Đây là gian đoạn rất quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật: Cả về mặt lý luận và thực tiễn, nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô có những ưu điểm sau: Hệ số nhân giống cao: từ một tế bào sạch bệnh ban đầu có thể nhân nhanh và cung cấp một lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên qui mô mặt bằng nhỏ. Các cây đồng nhất về mặt di truyền. Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống. Chất lượng giống cao: bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, kết hợp với một số biện pháp xử lý nhiệt, xử lý hóa chất có thể làm sạch bệnh trên giống và tái tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất. Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng. Có thể nhân giống quanh năm, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch sản xuất và cung cấp giống. Các tập đoàn giống và giống sản xuất được lưu giữ trong điều kiện vô trùng, cách li hoàn toàn với các nguồn bệnh. Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. Dễ dàng tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen. Bên cạnh những đặc điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống, phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần khắc phục: Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao. Tiến hành nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô thực vật: Phương pháp nuôi cấy mô thực vật có ý nghĩa vô cùng quan trọng với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Về mặt lý luận sinh học cơ bản: Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô thực vật có thể tiến hành so sánh đặc tính cơ thể với các thành phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra mối tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong việc của mình. Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào có thể tiến hành nghiên cứu mối quan hệ ký sinh và ký chủ. Như vậy, rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó, tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật, giúp cho việc phòng bệnh cho cây tốt hơn, đỡ tốn kém hơn. Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tác giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất sinh khối được tạo ra vẫn giữ nguyên được thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn trong công nghiệp. Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật: Nuôi cấy nốt đơn thân: Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn. Chồi được thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá tiếp tục được cấy chuyền đến khi đạt đủ số lượng chồi cần thiết thì chúng được cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất. Phương pháp này đã được thưc hiện thành công trên một số đối tượng như: cây Măng tây, Khoai tây, Lê, Hoa hồng, Cà chua, Dưa chuột, Cà tím,… Nuôi cấy chồi bên: Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân. Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thường không cần đến cytokinin để phát triển. Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này được tiếp tục được tiếp tục chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh. Phương pháp nhân giống bằng chồi bên được tiến hành lần đầu tiên trên cây Cẩm chướng, Dâu tây, Cúc đồng tiền. Hiện này, phương pháp này được áp dụng cho nhiều loài thực vật và phổ biến là ở một số loài cây ăn trái. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên) sau khi vô trùng mẫu và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Môi trường thích hợp thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy, nhưng cơ bản môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng và được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó, chồi tiếp tục phát triển vươn ra thân, lá, rễ trở thà