Khóa luận Tìm hiểu quy trình phát hiện enterobacter sakazakii trong sữa bột

ác chủng thành 1 chi mới Cronobacter. Cronobacter spp được xem như là một chi mới của E. sakazakii. bằng các phương pháp nêu trên nhiều loài đã được tìm ra như Cronobacter sakazakii; C. turicensis; C. malonaticus; C. muytjensii; and C. dublinensis. 2.3.3 Đặc điểm Hình 2.4: E. sakazakii dưới kính hiển vi 2.2.3.1 Đặc điểm chung - Đặc điểm 15 E. sakazakii là một vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaciae và đủ tiêu chuẩn là một vi khuẩn Coliform, chiều dài khoảng 3 µm và chiều rộng hình que, kị khí tùy nghi, các tế bào di chuyển bằng tiên mao Peritrichous và không hình thành bào tử, có khả năng tạo màng sinh học. - Môi trường sống E. sakazakii không phải là dạng sinh vật cư trú trong đường ruột của con người. Ta có thể phân lập hàng loạt từ các mẫu môi trường (đất, nước), các loài gây hại như (ruồi, chuột), từ thực phẩm và từ môi trường bệnh viện. E. sakazakii cũng có thể được tìm thấy trong sữa bột, ngũ cốc, chocolate, bột mì và các khu vực sản xuất. - Nhiệt độ tăng trưởng Enterobacter sakazakii có khoảng nhiệt độ rộng cho sự phát triển: nhiệt độ tối thiểu là 5,5 - 8°C, tối đa là 45 - 46°C và nhiệt độ tối ưu để phát triển là 37-43°C . Ở nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu như thế sẽ giúp E. sakazakii phát triển trong tủ lạnh nhà từ 7 đến 10°C nếu có trong sữa bột dành cho trẻ em. Còn khi E. sakazakii phát triển ở nhiệt độ lên tới 45-46°C có thể còn sống sót trong các thiết bị sấy và máy trộn được sử dụng sản xuất sữa bột cho trẻ em Thời gian cho một lần chu kì nhân đôi ở 10oC là khoảng từ 4-6 giờ. Giảm còn 40 phút nếu ở nhiệt độ phòng - pH Tối thiểu 3,89 Tối ưu 5 - 9. - Khả năng chịu khô. E. sakazakii được cho là có khả năng chống thẩm thấu, chịu được khô hạn hơn so với các vi khuẩn khác như : Escherichia coli, Salmonella và các chủng khác của Enterobacteriaceae, Phân tích chỉ ra rằng khả năng chịu khô hạn rất có thể là liên quan đến tích tụ trehalose trong các tế bào. Một chất có khả năng giữ nước cao, và được sử dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm - Môi trường nuôi cấy 16 Vi khuẩn có thể được nuôi trên môi trường lỏng có bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn và đạt được mật độ tế bào cần thiết (tế bào/ml) hoặc môi trường rắn có argar trong các đĩa petri để từng tế bào mọc thành khuẩn lạc để dễ quan sát . 2.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa  E. sakazakii có khả năng kháng kháng sinh macrolide, lincomycin, clindamcin, steptogramins, rifampicin.  E. sakazakii tham gia vào quá trình khử nitrate thành nitrite trong điều kiện không có oxy phân tử, bên cạnh đó còn có vai trò súc tác sự thủy phân lactose nhờ β-galactosidase, chúng sử dụng glucose và lactose như một nguồn cacbon.  Thử nghiệm catalase : cho kết quả dương tính . Nhằm xác định xem VSV có enzyme catalase để phân hủy H2O2  Thử nghiệm oxidase : Cho kết quả âm tính . Là một thử nghiệm được sử dụng trong vi sinh để xác định một loại vi khuẩn sản xuất nhất định cytochromec oxidases  Lên men các loại đường sản phẩm phụ là acid và sinh khí  Voges-Proskauer : cho phản ứng dương tính  Không lên men đường sorbitol  Thử nghiệm decarboxylase : nhằm xác định khả năng của một vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các aminoacid. Cho kết quả lysine – âm tính , arginine – dương tính , ornithine - dương tính 2.3.4 Cấu trúc 17 Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn E. sakazakii 2.3.4.1 Thành tế bào Thành tế bào (cell wall) giúp duy trì hình thái của tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao (flagellum), giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể (bacteriophage). Cấu tạo gram âm : Vách tế bào Gram âm có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm 3 thành phần + Lipid A. + Polysaccharide lõi. + Kháng nguyên O. Màng ngoài còn có thêm các protein: + Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ… + Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt 18 và đưa qua màng ngoài như: nucleotide, vitamin B12,… + Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài. Hình 2.6.Cấu trúc tế bào Gram – 2.3.4.2 Màng sinh học Màng sinh học là tập hợp của các vi sinh vật. Trong đó các tế bào dính lại với nhau trên một bề mặt. Những tế bào này dính lại với nhau tạo ra một chất nền extracellular polymeric substance (EPS) là một chất dính cao phân tử bao gồm DNA, protein, polysaccharides, màng sinh học có thể hình thành trên bề mặt có thể lan truyền trong tự nhiên, Màng sinh học được hình thành bắt đầu bằng các tế bào tự do trên một bề mặt nào đó, các tế bào bám vào nhau thông qua lực hút van der waals. Nếu những tế bào này không tách rời ra chúng sẽ bám dính vĩnh viễn bằng kết dính tế bào hay cấu trúc tiêm mao và phát triển thành một khối trên bề mặt gọi là màng sinh học Cuối cùng các màng sinh học sẽ phân tán. Sự phân tán của các tế bào từ các màng sinh học là một giai đoạn cần thiết của vòng đời màng sinh học. Cho phép phát tán màng sinh học để lây lan và xâm chiếm các bề mặt mới - Có 5 bước phát triển màng sinh học Bước 1: Các tế bào bắt đầu tham gia tạo màng 19 Bước 2: Các tế bào kết dính kho thể tách ra được Bước 3: Giai đoạn trưởng thành thứ nhất Bước 4: Giai đoạn trưởng thành thứ hai Bước 5 : Sự phân tán Hình 2.7 : Năm bước phát triển của màng sinh học 2.3.4.3 Tiên mao Tiên mao (flagella) quyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn. Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rất rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao. Sợi tiên mao cấu tạo bởi loại protein có tên là flagellin, có trọng lượng phân tử là 30 000-60 000 Da. Và có cấu tạo xoắn ,dài khoảng 20 nm. Tiên mao có thể gốc (basal body), gồm 1 trụ nhỏ được gắn với 4 đĩa tròn (vi khuẩn G- ) có dạng vòng nhẫn (ring), ký hiệu là các vòng L,P,S và M. Vòng L nằm ngoài cùng, tương ứng với lớp liposaccarid của màng ngoài ; vòng P tương ứng với lớp peptidoglycan, vòng S tương ứng với lớp không gian chu chất ; vòng M được nhúng vào trong màng tế bào 20 Hình 2.8: Cấu trúc tiên mao 2.3.5 Yếu tố độc lực[2]. Khả năng sinh độc tố của E. sakazakii ít được biết đến. Một thí nghiệm cho thấy khả năng sinh các hợp chất giống enterotoxin thí nghiệm trên 18 chủng E. sakazakii nhưng chỉ 4 trong số đó có khả năng sinh độc tố trên. Độc tố enterotoxin sau khi vào ruột nó có thể làm tăng tính thấm của biểu mô đường ruột ở trẻ sơ sinh, tồn tại trong ruột và gây ra viêm ruột dẫn đến hoại tử ruột hay có thể gây viêm màng não. Khả năng gây độc của các chủng E. sakazakii (cronobacter spp ) một chi mới của E. sakazakii đã được tìm hiểu dựa trên sự nhiễm trùng do nhiễm khuẩn là di căn thông qua các bộ phận khác gây viêm màng não, viêm ruột hoại tử Sự khác nhau về yếu tố độc lực của E. sakazakii (cronobacter spp ) , đã được nêu ra tại cuộc họp giữa các chuyên gia của các tổ chức FAO vào năm 2006. Từ đó các nghiên cứu được tiến hành . Tiêm tế bào não chứa E. sakazakii vào chuột mới sinh ở các mao mạch của não trong của chuột đã được thực hiện. Công việc chỉ ra rằng E. sakazakii (Cronobacter spp.) tồn tại và nhân rộng trong các đại thực bào và cho thấy sự tham gia và di căn tại tế bào nội mô của người Thí nghiệm được tiến hành với từng chủng E. sakazakkii (cronobacter spp) cho thấy sự đa dạng của các đặc tính độc lực giữa các E. sakazakii phân lập, và (Cronobacter spp.) 21 2.3.6 Cơ chế gây bệnh[3] Cho đến nay cơ chế gây bệnh cụ thể của E. sakazakii chưa được xác định. Do đó có thể hiểu E. sakazakii như một tác nhân cơ hội gây nhiễm trùng. Nghiên cứu cho rằng E. sakazakii có một sự nhiễm bệnh giống nhau giữa độc tố của E.coli và coliform. Có một khả năng là các độc tố được truyền qua các sinh vật trong ruột người thông qua thể plasmid. 2.2.6.1 Các nguồn nhiễm bệnh  Người: lây nhiễm từ các mẫu của bệnh nhân như dịch não tủy, máu, đờm, họng, mũi, phân, ruột, vết thương, tủy xương, mắt, tai, dạ dày, bệnh phẩm qua đường hậu môn  Động vật: Ruồi và động vật gặm nhấm được xem như các nguồn gây bênh mặc dù ở một tỷ lệ thấp (0,2%)  Môi trường: từ nước, bụi, đất, vật liệu thực vật, bùn, máy hút bụi  Thực phẩm : trong các loại sữa bột , rau củ quả, Pho mát, sản phẩm sấy khô các loại thảo mộc, gia vị, hạt giống lúa, rau diếp, thịt bò băm nhỏ, xúc xích thịt và rau quả, lên men tinh bột sắn, đậu xanh và mầm cỏ linh lăng, và thịt  Các nguồn khác từ môi trường, các dụng cụ chế biến, các quy trình đóng gói … 2.2.6.2 Triệu chứng  Ủ bệnh : hầu như không có triệu chứng nhất định, các triệu trứng như ăn không ngon, khó chịu, vàng da, sốt cao, tiêu chảy, động kinh  Gây bệnh: trường hợp trẻ sơ sinh, nhiễm trùng tiến triển đến viêm màng não (tình trạng viêm cấp tính của các màng của não và tủy sống), và phát triển cuối của là não úng thủy (bất thường gia tăng số lượng dịch não tủy trong khoang sọ) đặc trưng của bệnh nhiễm trùng hệ thống thần kinh trung ương  Liều lượng: theo các nghiên cứu thì khả năng gây bệnh khi bị nhiễm khoảng 1000 tế bào sẽ gây ra nhiễm trùng, và trong sữa bột cho trẻ em có khoảng < 3 cfu/100g sẽ gây nhiễm trùng 22  Độ tuổi gây bệnh: ở mọi lứa tuổi đều có nguy cơ Nhiễm khuẩn E. sakazakii. Nhưng nguy cơ cao nhất là ở các trẻ sơ sinh, trẻ sinh non có cân nặng nhỏ hơn 2,5kg  Di chứng: Gây ra các bệnh nhiễm trùng, viêm màng não, để lại những di chứng thần kinh, chậm phát triển,… hoặc có thể gây tử vong. 2.2.7 Các biện pháp phòng và xử lí bệnh 2.2.7.1 Các biện pháp phòng bệnh Enterobacter sakazakii được tìm thấy chủ yếu trong sữa vì vậy phải đọc kĩ hướng dẫn trước khi sử dụng sữa, không nên đễ sữa quá lâu sau khi chế biến (không quá 4 giờ), rửa tay sạch trước khi pha sữa. Nước dùng đễ pha sữa phải là nước nước đun sôi thật kĩ trước khi cho giảm nhiệt độ đến 72oC. Làm sạch bình hay ly sữa bằng nước sôi. Quậy thật đều hỗn hợp bột và nước. Thường xuyên tiêm phòng vaccine cho trẻ để tăng đề kháng. Người mẹ nên được hướng dẫn và tìm hiểu thông tin đầy đủ về cách pha chế và bảo quản các sản phẩm sữa bột cho trẻ. 2.2.7.2 Xử lí bệnh Hầu hết các loại nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra thuốc đặc trị là các loại thuốc kháng sinh. Riêng E. sakazakii có khả năng kháng một số loại kháng sinh. Vì vậy uống thuốc đúng liều và đúng cách là cách trị bệnh hiệu quả và bảo vệ sức khỏe. Một số loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh do E. sakazakii như chloramphenicol, gentamicin-ampicilin hoặc ampicilin. 2.2.8Tình hình nhiễm E. sakazakii trong sữa bột 2.2.8.1 Việt Nam Tình hình sữa nhiễm khuẩn E. sakazakii tại Việt nam hiện nay chưa có trường hợp nào được công bố. Tuy nhiên các sản phẩm sữa bột nhập khẩu vẫn là mối đe dọa hiện nay. 23 Để phát hiện trong sữa có vi khuẩn nhóm E. sakazakii hay không thì phải thực hiện thêm nhiều công đoạn xét nghiệm. Vì vậy, đến thời điểm này, theo Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) vi khuẩn E. sakazakii chưa được định danh để đưa vào danh mục các vi khuẩn cần giám sát. Theo các chuyên gia dịch tễ - vi khuẩn E. sakazakii nói trên thuộc nhóm Ecoli (gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em). Đây là một loại khuẩn hiếm gặp, có khả năng làm suy giảm hệ thống thần kinh trung ương, gây bệnh tiêu chảy và hạn chế khả năng lưu thông máu đối với tất cả trẻ em. Vi khuẩn này cũng có thể gây bệnh viêm màng não ở trẻ em và tỷ lệ tử vong khoảng 50%. 2.2.8.2 Thế giới Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) đã có thông báo liên quan đến nhiễm khuẩn Enterobacter sakazakii ở trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa bột dinh dưỡng . Các cụm nhiễm E. sakazakii đã được báo cáo một loạt các địa điểm trong vài năm qua của các trẻ sơ sinh ăn sữa bột do các nhà sản xuất khác nhau sản xuất. Một nghiên cứu kiểm tra sữa bột trẻ sơ sinh dựa trên công thức sản phẩm thu được từ một số quốc gia khác nhau và thấy rằng E. sakazakii có thể được thu hồi từ 20 (14%) trong 141 mẫu. Tổng Cục Kiểm tra Chất lượng và Kiểm dịch Trung Quốc đã công bố danh sách 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm bán ra thị trường do có chứa vi khuẩn E. sakazakii trong đó có cả rượu, thịt cá đông lạnh, nước và bánh quy của Mỹ, Nhật, Tây Ban Nha và sữa bột Đài Loan. Ngoài sữa bột Đài Loan thì nhãn hiệu sữa Pauls do công ty Parmalat Australia sản xuất, một chi nhánh của tập đoàn thực phẩm của Ý cũng nằm trong 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm lưu hành vì có chứa vi khuẩn độc hại. Các cán bộ kiểm dịch đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm trên 9.624 tấn sữa bột của công ty Đài Loan Wei Quan và phát hiện có Enterobacter sakazakii, một 24 loại vi khuẩn có thể gây bệnh viêm màng não cho trẻ nhỏ. Đây là căn bệnh rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cho tới 50% số trẻ mắc bệnh. Ngoài sữa bột Đài Loan thì nhãn hiệu sữa Pauls do công ty Parmalat Australia sản xuất, một chi nhánh của tập đoàn thực phẩm của Ý cũng nằm trong 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm lưu hành vì có chứa Enterobacter sakazakii Hình 2.9 : Hai loại sữa điển hình nhiễm E. sakazakii 25 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII 3.1 Phương pháp truyền thống 3.1.1 Nguyên tắc Mẫu sữa nghi ngờ có sự hiện diện của Enterobacter sakazakii đễ phát hiện ta thông qua các bước + Tiền tăng sinh + Tăng sinh chọn lọc trên môi trường nuôi cấy đặc trưng + Khẳng định vi khuẩn bằng các thử nghiệm sinh hóa 3.1.2 Môi trường nuôi cấy - Nước đệm pepton (BPW) - Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin - Thạch phân lập Enterobacter Sakazakii (ESIATM) - Thạch đậu tương trypton (TSA) 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ  Thiết bị khử trùng khô ( tủ sấy) , thiết bị khử trùng ướt (Autoclave)  Pipet  Bể điều nhiệt  Đĩa petri  Tủ ấm  Vòng cấy  Ống nghiệm  Máy đo pH 3.1.4 Lấy mẩu (TCVN 6400) - Dụng cụ Dụng cụ lấy mẫu: ống xăm, môi, thìa hoặc dao trộn 26 Dụng cụ chứa mẫu phải đủ lớn để chưa ¾ thể tích và cho phép trộn mẫu trước khi dùng phương pháp lắc, các vật chứa phải có nắp đậy Các dụng cụ phải là các hợp kim chịu nhiệt ở 180oC hoặc các dụng cụ bằng chất dẻo sử dụng 1 lần. Có thể khử trùng theo các phương pháp sau  Phương pháp A : giữ trong không khí nóng từ 170-175oC kho dưới 2 giờ  Phương pháp B : giữ trong luồng hơi nóng từ 121oC không dưới 20 phút (Autoclave)  Phương pháp C : hơ trên ngọn lửa sao cho các dụng cụ tiếp súc trực tiếp với lửa  Phương pháp D : nhúng các dụng cụ vào ethanol nồng độ ít nhất là 70% Các dụng cụ sau khi khử trùng sẽ được bảo quản trong điều kiện vô trùng trước khi sử dụng - Cách lấy Lấy tối thiểu 100g sau khi lấy bảo quản trong điều kiện vô trùng ở 30oC Luôn luôn lấy mẫu ở điều kiện vô trùng vì đây là lấy mẫu để kiểm tra vi sinh nên điều kiện vô trùng là cần thiết Dùng dao hoặc thìa trộn vô trùng. Loại bỏ lớp sản phẩm trên bề mặt của vùng lấy mẫu, lấy mẫu bằng ống xăm vô trùng. Cắm ống xăm khô sạch vào sản phẩm nếu cần với những vật chứa nằm trên cạnh nó, cho khe cắm hướng xuống phía dưới với tốc độ xuyên đều khi ống xăm chạm tới đáy thùng xoay ống xăm 180o rút ra và đổ sản phẩm vào vật chứa mẫu và đậy ngay nắp lại. Nếu thấy có dấu hiệu không tốt về điều kiện của lớp bột phía trên thì có thể lấy riêng từng lớp khác nhau Mẫu là các sản phẩm đóng gói chưa mở, có thể dùng các vật chứa thích hợp để lấy mẫu sao cho mẫu không dưới 100g 27 3.1.5 Chuẩn bị mẩu thử (TCVN 6263) - Nguyên tắc Chuẩn bị mẫu thử bằng cách pha loãng các mẫu sản phẩm. Bằng các dung dịch pha loãng ban đầu phù hợp với sản phẩm, nếu cần có có thể chuẩn bị pha loãng thập phân tiếp theo. Để giảm bớt số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích để thuận tiện cho việc kiểm tra vi sinh - Cách làm Các thao tác được thực hiện trong môi trường vô trùng, các dụng cụ thực hiện là các dụng cụ và thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh Trộn kỹ lượng sữa bột trong hộp kính bằng cách lắc đều và đảo liên tục, nếu hộp quá đầy thì có thể chuyển qua hộp có kích thước to hơn để trộn đều. Mở nắp, dùng thìa xúc phần mẫu thử theo yêu cầu. Hâm nóng lọ chứa 90ml dung dịch pha loãng thích hợp tới 45oC ± 1 trong nồi cách thủy Cân 10g mẫu thử cho vào bình thủy tinh thích hợp và rót dần dung dịch pha loãng vào Để hòa tan, xoay tròn từ từ lọ này cho ướt bột sau đó lắc lọ 25 lần với khoảng di động là 300mm trong khoảng 7 giây , có thể dùng máy trộn để thay cho việc lắc Đặt lọ vào nồi cách thủy 5 phút và thỉnh thoảng lắc 28 3.1.6 Qui trình phân tích (TCVN 7850:2008) Chuẩn bị mẫu thử/tiền tăng sinh: cân x g phần mẫu thử cho vào 9 lần x ml BPW Ủ ở 37oC trong 18 giờ ± 2 giờ Ủ ở 44oC trong 24 giờ ± 2 giờ Ủ ở 44oC trong 24 giờ ± 2 giờ Ủ ở 25oC trong 48 giờ Tăng sinh chọn lọc trong môi trường vancomyxin/mLST Chuyển 0.1 ml từ BPW đã cấy vào 10 ml môi trường vancomyxin/mLST Phân lập thạch sinh màu chọn lọc Cấy vạch một vòng đầy dịch cấy từ môi trường vancomyxin/mLST lên Thạch sinh màu (ESIATM) trong đĩa petri Khẳng định: sinh màu vàng chọn năm khuẩn lạc điển hình cấy vạch lên đĩa chứa môi trường TSA Khẳng định:sinh hóa Chọn một khuẩn lạc màu vàng từ đĩa TSA để thử sinh hóa Diễn giải kết quả 29 3.1.7 Cách tiến hành 3.1.7.1 Phần mẫu thử Để chuẩn bị cho dung dịch pha loãng ban đầu, lấy một lượng x gam phần mẫu thử cho vào môi trường tiền tăng sinh BPW với thể tích lớn gấp 9 lần. Sao cho thu được tỷ lệ phần mẫu thử với môi trường tiền tăng sinh được qui định trong phương pháp này. Để yên cho các mẫu khô tan trong môi trong dịch lỏng mà không cần khuấy trộn nếu sau 30 phút không tan hết thì có thể trộn nhẹ nhàng 3.1.7.2 Tiền tăng sinh Ủ mẫu đã cấy trong môi trường PBW tiền tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ. E. sakazakii trong môi trường ban đầu ít hay bị tổn thương. Môi trường này giúp các vi sinh vật phục hồi và tăng số lượng trước khi đi cấy 3.1.7.3 Tăng sinh chọn lọc Sau khi ủ trong môi trường tiền tăng sinh, dùng pipetman chuyển 0,1 ml dịch cấy thu được từ môi trường BPW vào 10ml môi trường vancomyxin/mLST là môi trường tăng sinh E. sakazakii nó .ủ ở 44 oC trong 24 giờ Nên sử dụng nồi cách thủy hoặc tủ ấm để đảm bảo rằng nhiệt độ tối đa 44,5oC 3.1.7.4 Phân lập Enterobacter sakazakii giả định Sau khi ủ ở môi trường vancomyxin/mLST, tiếp tục cấy ria một vòng đầy khoảng 0,1µl lên bề mặt đĩa thạch môi “trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định (ESIATM)” ủ ở 44oC trong 24 giờ Sau khi ủ kiểm tra đỉa thạch sinh màu về sự có mặt hay không có mặt của các khuẩn lạc điển hình của Enterobacter sakazakii giả định Các khuẩn lạc điển hình có màu xanh cây đến xanh lục, cỡ nhỏ từ 1 – 3 mm các khuẩn lạc không điển hình thường hơi trong suốt và có màu tím 30 Hình 3.1 : E. sakazakii trong môi trường ESIA 3.1.7.5 Khẳng định Chọn từ 1 đến 5 khuẩn lạc E. sakazakii giả định điển hình đã được kiểm tra trên đĩa thạch ủ. Cấy vạch các khuẩn lạc đã chọn trong môi trường ESIATM lên môi trường TSA sao cho khi ủ quan sát được các khuẩn lạc tách biệt. Ủ đĩa này ở 25oC từ 44 giờ đến 48 giờ sau khi ủ quan sát các khuẩn lạc sinh màu vàng. Một vài chủng đặc biệt của E. sakazakii có thể không sinh màu vàng trong các điều kiện thử nghiệm qui định. Hoặc mất sắc tố do cấy truyền. Trong trường hợp này thì các khuẩn lạc như thế sẽ bị bỏ sót Hình 3.2 : E. sakazakii trên môi trương thạch TSA 31 3.1.8 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar[7]. - Nguyên tắc Brilliance™ Enterobacter sakazakii Agar (công thức chuẩn Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar) là môi trường sử dụng cho việc phân lập và đếm Enterobacter sakazakii từ mẫu thực phẩm Brilliance Enterobacter sakazakii Agar dựa trên phản ứng anpha- glucosidase, phản ứng này dựa trên sự kết hợp chặt chẽ giữa cơ chất chromogenic 5-bromo-4-chloro-3indolyl-anpha-D-glucopyranoside có mặt trong môi trường. Enzyme anpha-glucosidase, hiện diện trong Enterobacter sakazakii, cơ chất hydrolyses sinh ra khuẩn lạc màu xanh trên đĩa môi trường màu vàng xám. Proteus vulgaris cũng có hoạt tính anpha-glucosidase dương tính yếu và cũng có thể phát triển để sinh ra những khuẩn lạc có màu tương tự như E. sakazakii. Tuy nhiên trên môi trường này, Proteus spp mọc lên những khuẩn lạc màu xám: chúng sản sinh ra hydrogen sulphide trong sự hiện diện của ferric ions hình thành nên ferrous sulphide. Desoxycholate có tác dụng làm ẩn đi sự phát triển của hầu hết vi sinh vật Gram dương . - Môi trường  EE broth  Brilliance Enterobacter sakazakii Agar -Cách tiến hành Các mẫu được giữ ấm trong nước qua đêm, sau đó được làm giàu trong môi trường EE broth Dùng một que cấy vòng lấy 10µl từ canh thang đã được giữ ấm EE broth và trải đều lên bề mặt của thạch Brilliance Enterobacter sakazakii Agar pleate. Giữ ấm đĩa thạch ở 35-37°C trong 24 giờ, và quan sát khuẩn lạc màu xanh lá cây Xác định số khuẩn lạc bằng phương pháp đếm hoặc bằng phương pháp sinh hóa 32 Kết quả : Dương tính các khuẩn lạc có màu xanh lá cây Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance Enterobacter sakazakii Agar 3.1.9 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey - Nguyên tắc Thạch MacConkey là môi trường chọn lọc cho các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột và các trực khuẩn gram âm khác có trong một quần thể hỗn tạp và phân biệt chúng có lên men lactose hay không men lactose. Muối mật và tinh thể màu tím ức chế hầu hết các vi khuẩn gram dương nhưng cho phép các thực khuẩn gram âm mọc được. Đường lactose như là nguồn carbonhydrat duy nhất. Trực khuẩn gram âm, nếu lên men sẽ sinh ra khuẩn lạc màu hồng hoặc màu đỏ. Ngược lại, nếu không lên men lactose thì khuẩn lạc không có màu hoặc khuẩn lạc có màu trong. - Phương pháp thực hiện Sử dụng môi trường MacConkey, và các vi khuẩn được cấy lên môi trường này. Đặt vào tủ ấm 35oC từ 18-24 giờ. Vi khuẩn có thể lên men lactose mạnh hay yếu trong 24 giờ nuôi cấy sinh ra các khuẩn lạc có màu hoặc xuất hiện màu hồng nhẹ 24-48 giờ không nuôi cấy quá 48 giờ như thế sẽ làm đảo lộn kết quả. - Đọc kết quả E. sakazakii có màu xanh 33 Hình 3.4: E. sakazakii trên môi trường Macconkey sau 24 giờ ở 36oC, khuẩn lạc có màu hồng 3.1.10 Khẳng định sinh hóa 3.1.10.1 Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa - Thuốc thử phát hiện oxidase - Môi trường Lysine decarboxylase - Môi trường Ornithin decarboxylase - Môi trường Arginin dehydrolase - Môi trường để lên men hydrat carbon (Nước peptone có phenol, D- sorbitol, L-rhamnose, D- sucrose và amygdalin) - Môi trường lên men carbohyrat hoàn chỉnh + Môi trường cơ bản + Dung dịch hydrat carbon ( D- sorbitol, L- rhamnose, D-sucrose, D- melibiose và amygdalin ) 80 mg/ml + Môi trường carbohyrat hoàn chỉnh - Môi trường simmons citrate - Môi trường ONPG borth - Môi trường MR-VP 34 3.1.10.2 Phép thử Oxydase Dùng kim cấy sử dụng một lần hoặc que cấy bằng thủy tinh lấy 1 phần của mỗi khuẩn lạc đặc trưng đã chọn Ria cấy lên giấy lọc được làm ẩm bằng thuốc thử oxydase. Không sử dụng vòng cấy hoặc que cấy bằng niken/crom Nếu màu của giấy lọc không đổi sang màu tím hoa cà màu tím hoặc màu xanh đậm thì phản ứng được coi là âm tính 3.1.10.3 Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase Dùng que cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng Lysine decarboxylase và Ornithin decarboxylase ủ các ống này ở 30o C từ 24 giờ Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính màu vàng chứng tỏ âm tính 3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng Arginin dehydrolase ủ các ống này ở 30o C từ 24 giờ Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính màu vàng chứng tỏ âm tính 3.1.10.5 Phép thử lên men các loại đường khác nhau Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng lên men Hydrat carbon ủ các ống này ở 30oC từ 24 giờ Sau khi ủ có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính màu đỏ chứng tỏ âm tính 3.1.10.6 Phép thử chỉ sử dụng Citrate Dùng vòng cấ