Khóa luận Tìm hiểu quy trình phát hiện vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

, bao gồm tiểu phần A và B. Hai tiểu đơn vị A và B liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. Tiểu phần B được kết hợp bởi 5 chuỗi polypeptide giống nhau và liên kết ở điểm thụ quan Ganglioside GM1 trên bề mặt tế bào eukaryote. Khi xâm nhập được vào tế bào, tiểu đơn vị A sẽ xúc tác quá trình chuyển đường ribose từ NAD đến protein có tên gọi Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 16 Gs hoặc Ns. Protein này sẽ điều khiển hệ thống adenylate cyclase có mặt ở phía trong màng tế bào. Adenylate cyclase là một enzyme liên kết với màng tế bào và có khả năng chuyển ATP (adenosine triphosphate) thành dạng AMP vòng (cyclic adenosine monophosphate). Hình thành cAMP là một trong những bước đầu tiên để bất cứ một tín hiệu hoá học nào tác động kích thích hay ức chế adenylate cyclase. Độc tố zonula occludens (ZOT) là một enterotoxin do vi khuẩn Vibrio cholera tiết ra, nó làm tăng tính thấm của tế bào niêm mạc ruột bằng cách gắn vào các thụ thể nằm trên tế bào cùa thành ruột. Một yếu tố độc hại chính thứ 2 của vi khuẩn tả giúp chúng sinh sôi nẩy nở trong ruột của chúng ta là toxin coregulated pilus (TCP). Một mảnh di truyền (operon) TCP có chứa một số nhân di truyền, gồm tcpA là nhân di truyền mã hóa cơ cấu chính (main structural gene) liên quan đến việc cấu tạo pilus. TCP không những liên quan tới khả năng giúp cho vi khuẩn tả sinh sôi nảy nở trong ruột con người nhưng nó cũng là nơi tiếp nhận (receptor) cho CTXφ. Độc tố đường ruột của vi khuẩn là sản phẩn của ctx gene. ctxA mã hoá cấu phần A, ctxB mã hoá cấu phần B. Thông tin của các gene này được chuyển về cùng một mRNA sau khi sao mã (chúng là thành phần của một operon). mRNA này có hai vị trí kết hợp với ribosome ở phía đầu 5' các đoạn gene tương ứng. Vị trí kết hợp ribosome của cấu phần B có khả năng hoạt động mạnh hơn ít nhất 7 lần so với vị trí kết hợp ribosom của A chính vì thế mà lượng sản phẩm của quá trình dịch mã (các protein) của B sẽ gấp vài lần potein của A. Tỷ lệ protein A và B đảm bảo độc lực của vi khuẩn là 1A:5B. Sau khi được tổng hợp, protein A và B kết hợp với nhau tại vị trí giữa màng tế bào và màng ngoài của ribosom. Lượng protein B còn dư sẽ được tiết ra khỏi tế bào. Tuy nhiên thành phần A phải được kết hợp với 5B để được vận chuyển ra ngoài tế bào. Thành phần A nguyên vẹn (chưa kết hợp với B) sẽ ở trạng thái bất hoạt và được giữ lại bằng cách hình thành hai phần A1 và A2 nối với nhau bằng liên kết disulfide. Khi độc tố vi khuẩn kết hợp với GM1 receptor của tế bào vật chủ, thành phần A1 được giải phóng (bằng cách cắt liên kết disulfide) và xâm nhập vào tế bào. Cơ chế xâm nhập của A1 chưa được biết rõ. Có giả thiết cho Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 17 rằng 5 đơn vị cấu phần B (5B) tạo thành một khe trên màng tế bào để giúp A1 xâm nhập. Quá trình sao mã của ctxAB được điều hoà bởi nhiểu yếu tố bao gồm cả các tín hiệu môi trường trong đó vi khuẩn đang tồn tại như nhiệt độ, pH, tính thẩm thấu, các amino acid. Một số gene khác của phẩy khuẩn cũng được điều hoàtheo cơ chế tương tự như các gene trong tcp operon. tcp được cho là quyết định quá trình tổng hợp "roi" hay "lông" của vi khuẩn. Chính vì vậy mà cả ctx và tcp đều chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. Các protein đã được xác định liên quan đến quá trình điều hoà các gene nói trên bao gồm ToxR, ToxS và ToxT. ToxR là một protein màng với 2/3 amino acid nằm trong tế bào chất. Tổ hợp hai protein ToxR (ToxR dimer) kết hợp với vùng khởi sự của ctxAB và hoạt hoá quá trình sao mã. ToxS protein được cho là có chức năng đáp ứng với các tín hiệu môi trường, làm thay đổi hình thái và có thể thay đổi quá trình bắt cặp của ToxR qua đó xúc tiến sao mã. ToxS đóng vai tró như bộ phận cảm biến, phosphoryl hoá và chuyển ToxR sang trạng thái kết hợp với DNA. ToxT là protein trong tế bào chất có chức năng hoạt hoá tcp opeon dẫn đến tổng hợ thành phần của tcp pili. Biểu hiện của ToxT chịu ảnh hưởng của ToxR. Vì vậy, ToxR là một protein điều hoà thực hiện chức năng "khơi mào" hệ thống điều khiển. ToxR cũng được cho là tương tác với ToxS để thực hiện chức năng nhận biết các thay đổi của yếu tố môi trường và chuyển các tín hiệu (ở mức phân tử) đến nhiễm sắc thể dẫn đến quá trình sao mã của các gene giúp vi khuẩn gắn kết với màng tế bào và sản xuất độc tố. Hoàn toàn có lý do để cho rằng môi trường dạ dày- ruột (nhiệt độ 37 độ, pH thấp, tính thấm cao v.v.) không tương tự như các điều kiện trong môi trường tồn tại tự nhiên của phẩy khuẩn (môi trường nước) có thể trở thành yếu tố tác động, kích kích sản sinh độc tố và gây nhiễm. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 18 2.2.6. Cơ chế gây bệnh Trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tả chỉ gây bệnh cho người. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường ăn uống. Để xuống được ruột non, vi khuẩn phải vượt qua dạ dày, vi khuẩn chịu tác động của dịch dạ dày có độ pH thấp (môi trường acid). Bình thường, pH của dạ dày đủ để gây chết cho vi khuẩn. Những vi khuẩn sống sót sẽ tiếp tục xuống ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn có khả năng tồn tại rất lâu. Phẩy khuẩn có khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp màng nhầy trên niêm mạc ruột. Tuy nhiên, ở những người giảm tiết dịch vị acid hoặc uống NaHCO3 (hoặc các chất kiềm tính có khả năng trung hòa dịch vị) thì có thể mắc tả nếu trong thức ăn, nước uống có vi khuẩn tả. Quá trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan nhầy và các men phân cắt protein thành các peptide. Do khả năng “tự bơi”, vi khuẩn có thể chuyển động ngược chiều với nhu động ruột để tiếp cận với niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hoá hướng động của chúng. Tại ruột non, chúng tiết ra nội độc tố “choleraetoxin” có trọng lượng phân tử khoảng 84.000 gồm 2 tiểu đơn vị là A và B (do gen có sẵn nằm trong DNA của vi khuẩn tổng hợp). Tiểu đơn vị B sẽ gắn vào thụ quan Ganglioside GM1. Việc gắn kết này sẽ hỗ trợ tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào ruột non. Chúng không xâm nhập vào biểu mô ruột mà bám vào niêm mạc ruột. Tiểu đơn vị A có chức năng enzyme chuyên biệt và hoạt động khi vào bên trong tế bào. Khi tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào, chúng sẽ kích hoạt adenylate cyclase liên tục để gia tăng sản sinh hàm lượng cAMP (Adenosine monophosphate vòng) nội bào bên trong tế bào, khiến cho ruột non không còn chức năng hấp thu mà chuyển sang chức năng thải tiết dịch – làm phóng thích hàng loạt ion, chất điện giải từ trong tế bào ra ngoài dịch ruột. Chính vì thế, tế bào sẽ mất rất nhiều điện giải ( K+, Cl-, Na+. . . ). Ngoài ra, chúng cũng tạo thành môi trường ưu trương trong lòng ruột dẫn đến việc nước trong tế bào sẽ ra ồ ạt, gây tiêu chảy trầm trọng. Phẩy khuẩn còn có thể sở hữu protein bề mặt gây ngưng kết hồng cầu và nhóm protein do gen acf mã hoá. Nhóm gen này quy định yếu tố hỗ trợ gắn kết của vi Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 19 khuẩn (accessory colonization factor). Đột biến gen acf dẫn đến giảm khả năng cố định của vi khuẩn vào niêm mạc ruột. Người nhiễm có thể bị tiêu chảy ồ ạt, gây mất dịch nặng, người bệnh bị sốc do thể tích tuần hoàn giảm, khả năng tử vong cao nếu không được xử lý kịp thời và đúng mức . Chúng chỉ xâm nhập vào đường ruột, không truyền nhiễm qua đường máu. Để phát bệnh, hàm lượng tế bào vi khuẩn tả trong ruột phải đạt nồng độ cao khoảng 108-1010 tb/ml. Trong khi đó bệnh do khuẩn Samonella hay Shigella chỉ cần nồng độ thấp cỡ 105-106 tb/ml là đã phát bệnh. Do đó, nếu người nào bị rối loạn tiêu hóa, pH acid ở dạ dày không đủ kiềm hãm số lượng tế bào vi khuẩn thì chúng sẽ sống sót để di chuyển đến ruột non để gây bệnh. Sau khi xâm nhập được qua dạ dày và xuống ruột non, vi khuẩn tả bám vào niêm mạc nhưng không xâm nhập sâu vào mô ruột, không gây tổn thương niêm mạc ruột. Chúng tiết độc tố ruột LT (thermolabile toxin) gắn vào niêm mạc ruột làm tế bào niêm mạc ruột giảm hấp thu Na+, tăng tiết nước và Cl- gây tiêu chảy cấp tính. Nếu không điều kịp thời trị, bệnh nhân sẽ tử vong vì mất nước và điện giải. Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae. Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhóm vi khuẩn tả. Nhóm vi khuẩn tả Khả năng gây bệnh V.cholerae serotype 01 Gây bệnh tiêu chảy nghiêm trọng, có thể thành đại dịch V.cholerae serotype non-01 Gây tiêu chảy nhẹ, chỉ xâm nhiễm ngoài ruột non. V. parahaemolyticus Nhẹ, xâm nhiễm ngoài ruột no Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 20 Một số loài khác: V. mimicus, V. vulnificus, V. hollisae, V. damsela… Không phổ biến, thường xâm nhiễm vết thương, mô mềm Bảng 2.4: Các loài Vibrio bị cho là gây bệnh ở người Bệnh Lâm Sàng Các loài Vibrio Hệ tiêu hóa Vết thương/Tai Nhiễm trùng máu V. cholerae V. cholerae O1 ++ (+) V. cholerae O139 ++ (+) V. cholerae non-O1, non-O139 ++ + (+) V. parahaemolyticus ++ + (+) V. fluvialis ++ ? V. mimicus ++ + V. hollisae ++ (+) V. furnissii ++ V. vulnificus + ++ ++ V. alginolyticus ? ++ ? V. damsela ++ ? V. cincinnatiensis + Hệ Tiêu Hóa: ++, thường xãy ra nhất; +. Những thể lâm sàng khác: (+), hiếm Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 21 Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người. 2.2.7. Triệu chứng gây bệnh 2.2.7.1. Trên người - Thời kỳ đầu: Người bị bệnh sẽ thấy sôi bụng, đầy bụng, tiêu chảy vài lần. - Thời kỳ toàn phát: triệu chứng lâm sàng. Người bệnh tiêu chảy liên tục rất nhiều lần với khối lượng lớn, có khi hàng chục lít một ngày (đi ngoài >3 lần/ngày). Phân tả điển hình toàn nước, màu trắng lờ đục như nước vo gạo, không có nhầy máu, bệnh nhân nôn rất dễ dàng, lúc đầu ra thức ăn, sau toàn nước, ít khi đau bụng. Bệnh nhân không sốt. Mệt mỏi, khát, nhịp tim nhanh, huyết áp tụt, hạ thân nhiệt, mất nước nghiêm trọng. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 22 Phân ra liên miên chứa rất nhiều các chất muối sodium, potassium, chloride và bicarbonate; tình trạng mất những chất điện giải quan trọng này có thể đưa đến các biến chứng nguy hiểm như tim loạn nhịp, kinh giật, đường trong máu cũng có thể xuống thấp, và khi đường máu thấp quá, óc chúng ta sẽ mất sáng suốt, rồi chúng ta có thể lên cơn kinh giật, vào hôn mê. Không chữa trị, tử vong bệnh lên đến 50-70%, nhất là ở trẻ em và phụ nữ mang thai; phụ nữ mang thai cũng rất dễ hư thai khi bị tả. Người bệnh có thể chết trong vòng 2-3 tiếng đồng hồ sau khi bệnh phát ra. Hiện bệnh tả có 4 thể: • Thể không có triệu chứng; • Thể nhẹ giống tiêu chảy thường; • Điển hình nhất là thể cấp tính như miêu tả ở trên; • Thể tối cấp (diễn biến nhanh chóng, bí tiểu, suy kiệt nhanh chóng sau vài giờ và tử vong). Cận lâm sàng: Hematocrit tăng ở bệnh nhân không bị thiếu máu (do cô đặc máu), pH máu động mạch giảm nhẹ, giảm mạnh mức bicarbonate, tăng urea máu, tăng nhẹ số lượng bạch cầu đa nhân trung tính. - Thời kỳ hồi phục: Bệnh diễn biến từ 1-3 ngày nếu được bù đủ nước và điều trị kháng sinh. Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 23 2.2.7.2 Trên động vật • Trên tôm Tôm bị nhiễm Vibrio spp ở trạng thái không bình thường, hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm có thể nổi lên mặt ao, dạt bờ hay kéo đang bơi lòng vòng. Vỏ tôm bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ. Hình 2.8: Đuôi tôm sú bị mòn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio. Khi vi khuẩn này cảm nhiễm trên vỏ kitin và mang có thể gây ra các vết thương tổn màu nâu đen do kitin đã bị ăn mòn và viêm nhiễm. Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh nhiễm nâu. Vỏ tôm có sự biến đổi thành màu đỏ hay màu xanh. Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tôm mềm và có màu xanh. • Trên cá Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và trên các vết thương tổn; da, vây có thể sưng lên và bị lở loét. Cơ nổi hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục. Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 24 nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên. Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen. 2.2.8. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới 2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam Tại Việt Nam, tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản là rất đáng báo động. Dịch tiêu chảy cấp năm 2007 xảy ra với diễn biến phức tạp và tốc độ lây lan nhanh chóng: Đợt 1 (từ 23/10/2007-6/12/2007): xảy ra tại 14 tỉnh với 259 trường hợp (+) với phẩy khuẩn tả, đợt 2 (24/12/2007-5/2/2008): tại thành phố Hà Nội với 32 trường hợp (+). Dịch tiêu chảy cấp xuất hiện do yếu tố môi trường bị ô nhiễm, nguồn nước bị nhiễm khuẩn, bên cạnh đó còn một yếu tố nguy cơ gây gia tăng tỷ lệ nhanh đó chính là việc nhiễm các lọai vi sinh: E.coli, V.chloera, Clostridium perfringens…của một số loại thức phẩm nguy cơ: các loại mắm, rau sống, thức ăn đường phố ăn liền, các loại thực phẩm hải sản tươi sống đông lạnh. Trong năm 2009, cả nước đã xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5.026 người mắc, 3.938 người đi viện, 33 người tử vong. Vào năm 2010 các vụ ngộ độc thực phẩm thường xuyên xảy ra ở tập thể như: trong quý III/2010 cả nước đã có 48 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 1.627 người mắc, 12 người tử vong, 75 công nhân của Xí nghiệp may Global (KCN Tiền Hải, huyện Tiền Hải) bị ngộ độc thực phẩm, Bình thuận 11/6/2010 có 127 du khách bị ngộ độc thực phẩm. 2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh trên thế giới Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Tại các nước châu Á Vibrio spp là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc và các vụ nhiễm Vibrio spp chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và trong khu vực Đông Nam Á. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 25 Theo thống kê ở Nhật Bản năm 1997 có 1.960 vụ ngộ độc thực phẩm với 39.989 người mắc, ở Úc mỗi ngày có 11.500 người mắc các bệnh cấp tính do ăn uống gây ra, ở Mỹ hàng năm có đến con số hàng triệu trường hợp ngộ độc thực phẩm. Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Quốc Tế (WHO) cho biết có 184.311 trường hợp bệnh tả được báo cáo từ 58 quốc gia (95% các quốc gia này thuộc Phi Châu) và có 2.728 người chết do tiêu thụ thức ăn nhiễm Vibrio spp. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 26 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 3.1. Phương pháp truyền thống 3.1.1. Phương pháp định tính 3.1.1.1. Nguyên tắc. Một lượng mẫu xác định (10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng đỉnh bằng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học. Môi trường tăng sinh chọn lọc cho V. cholerae, V. alginolytycus và V. vulnificus là nước peptone kiềm. Trong khi đó môi trường Colistine Polymicine Borth thường được dùng để tăng sinh V. parahaemolyticus. Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật len men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không len men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ • Tủ ấm 37oC • Bể điều nhiệt 42oC • Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g • Mấy nghiền đồng thể • Mấy lắc ống nghiệm • Đĩa petri • Ống nghiệm với các kích cỡ 13, 16, 18mm • Một số thiết bị thông thường khác như: máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh. 3.1.1.3. Môi trường và hóa chất • Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water (APW). Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 27 • Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine). • Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar). • Canh Tryptone. • Thạch Kligler Iron (KI). • Canh Hugh Leifson Glucose (HLG). • Canh Carbohydrate tím. • Môi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller). • Dung dịch oxidase. • Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%). • Kháng huyết thanh polyvalent O dùng cho V.cholerae. • Kháng huyết thanh O. • Dung dịch NaOH 1N. • Dung dịch HCl 1N. • Dung dịch dầu phủ vô trùng. • Dung dịch Bromocresol tím. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 28 3.1.1.4. Quy trình phân tích. Dùng que cấy vòng lấy mẫu, cấy ria lên mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn. Ủ trong 18 – 22 giờ.  Khuẩn lạc đặc trưng của Vibrio có hình dạng: KL V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm,láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương. 25g mẫu + 225ml canh tăng sinh chọn lọc (APW) € đồng nhất trong 30 giây € độ pha loãng 10-1 Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang môi trường không chọn lọc T1N1 (3% NaCl) hoặc TSA bổ sung 3% NaCl. Đem ủ 37 oC trong 18- 24h.  Thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh. Kết luận. Phát hiện hay không phát hiện Vibrio trong 25g (10g) mẫu. Ủ ở 37oC trong 6 – 8 giờ. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 29 3.1.1.5. Thuyết minh quy trình Ö Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm 225ml (90ml) dung dịch pha loãng mẫu APW. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu là 30 giây. Tất cả các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Ö Tăng sinh chọn lọc Dùng nước peptone kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V.cholerae và V. alginolyticus, V. vulnificus. Dùng canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Ö Phân lập Sau 24 giờ, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối trên môi trường APW và cấy lên bề mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18 – 22 giờ. Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trên môi trường này như sau: khuẩn lạc V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm, láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương. Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 30 Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên môi trường MacConkey Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS Tiếp theo, cấy chuyền sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập TCBS thạch sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl, ủ 37 oC trong 18- 24h để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa. Ö Thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm sinh hóa quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài Vibrio là: quan sát tính di dộng trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch mềm và các thử nghiệm khác. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 31 Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus Thử nghiệm sinh hóa Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerea ONPG (-) (+) Lactose (-) (-) ADH (-) (-) LDC (+) (+) TDA (-) (-) Indol (+) (+) Manose (+) (+) Sucrose (-) (+) Oxidase (+) (+) NaCl 0% (-) (+) NaCl 3% (+) (+) NaCl 6% (+) (-) NaCl 8% (+) / (-) (-) NaCl 10% (-) (-) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 32 + Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA Nhằm xác định vi sinh vật sử dụng các nguồn carbohydrate nào, có sinh ga hay không, có sinh H2S hay không. Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA + Thử nghiệm với các canh thang trypton muối Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường. + Thử nghiệm lên men - oxy hoá Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống, ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC trong 1 - 2 ngày. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 33 V. cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng. + Thử nghiệm oxidaza Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây . Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này. + Nhuộm gram Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu. Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, không có vỏ, không sinh nha bào, khi nuôi cấy lâu ngày sẽ có sự thay đổi về hình thể so với ban đầu. V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy. Hình 3.5: Vibrio cholerae Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 34 + Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl. Ủ ở nhiệt độ 42oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42oC làm môi trường bị đục. + Thử nghiệm lên men các nguồn cacbonhydrat Nguyên tắc: - Thử khả năng lên men carbohydrate của các chủng vi sinh vật khác nhau. - Những vi sinh vật khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Carbohydrate chia làm 3 nhóm: - Nhóm 1: Monosaccharide, polyhydroxylic, aldehyde hoặc ketone. - Nhóm 2: polysaccharide và oligosaccharide. - Nhóm 3: polyhydric alcohol và các cycitol. Lên men: Là quá trình trao đổi chất oxy hóa khử, mà chất nhận điện tử cuối cùng không phải là oxy mà là các cơ chất hữu cơ khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men phụ thuộc vào: - Dòng VSV khác nhau. - Cơ chất tự nhiên dùng để lên men. - Thời gian, nhiệt độ, pH của môi trường. Phát hiện vi sinh vật có lên men carbohydrate: - Sản phẩm tạo thành Æ pH môi trường giảm Æ sử dụng chất chỉ thị để phát hiện - Có sinh hơi Phát hiện hơi sinh ra như thế nào? - Môi trường lỏng (VSV hiếu khí) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 35 Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate - Môi trường đặc (VSV kỵ khí) Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate Cách thực hiện: - Môi trường sử dụng: phenol red broth base đối với VSV hiếu khí và phenol red agar đối với VSV kỵ khí - Nguồn carbon: tùy vi sinh vật - Đọc kết quả: (+): môi trường chuyển sang vàng (-): không đổi màu Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai cac