Khóa luận Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa

0** 35 500*** * : Tính từ phương pháp sa lắng – khuếch tán. ** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong. *** : Tính bằng phương pháp Archibald. 2.3.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain 2.3.3.1. Cấu tạo hoá học Bromelain là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose ( Nguyễn Đức Lượng 2004). Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu – NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelin quả, acid amin đầu – NH2 là alanine ( Nguyễn Đức Lượng 2004). 2.3.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau: Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp – - Gly – Cys – Lys - Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- (disulfur). Tâm hoạt động –Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Å. Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu. Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử bromelain thân còn có sự hiện diện của các ion Zn2+ với hàm lượng 2 mg/g enzyme có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 13 2.3.4. Hoạt tính của enzyme bromelain Một số nghiên cứu cho thấy bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ chất khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này tương đương nhau. Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của Bromelain yếu hơn papain. Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain và ficin ( Nguyễn Đức Lượng 2004). 2.3.4.1. Cơ chế tác động Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain. Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất ( nơi các liên kết peptide bị cắt ). Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác. Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain. Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất. Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amin. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide. Ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…) Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+ Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 14 2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch. ™ Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Bromelain ở dạng tinh khiết thì nhạy với nhiệt: ở 5o C, pH = 4-10, bromelain có hoạt tính tối đa trên Casein trong 24h; ở 55oC, pH=6 trong 20 phút, hoạt tính giảm 50%. Quá trình sấy thăng hoa ( đông khô ) mất hoạt tính 27% ( Nguyễn Đức Lượng, 2004 ). ™ Ảnh hưởng của pH pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. pH thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt. Biên độ pH khá rộng từ 3-10 nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-8 tùy cơ chất: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). ™ Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Chất kìm hãm là những ion, phân tử vô cơ, hữu cơ,...làm giảm hoạt mất hoạt tính của enzyme, có 2 loại chất kìm hãm: - Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc tương tự như cấu trúc cơ chất, nên có khả năng cạnh tranh kìm hãm với cơ chất ở trung tâm hoạt động của enzyme. - Chất kìm hãm không cạnh tranh: làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt tính xúc tác của enzyme. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 15 ™ Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa Là những chất anion, các ion kim loại, chất hữu cơ,...có tác dụng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme trong giới hạn nồng độ xác định. ™ Ảnh hưởng bởi các ion kim loại Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain. Ví dụ: Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit… Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm – SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate, clo acetophenol, H2O2, methyl bromur. Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain ( Nguyễn Đức Lượng ). ™ Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản. Hoạt tính (UI/mg protein) Điều kiện bảo quản Dịch chiết Đông khô Nguyên liệu tươi 1600 1150 Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày 830 630 Sấy khô ở 4oC 1880 1360 2.3.5. Ứng dụng của enzyme bromelain 2.3.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm Chỉ cần một phần enzyme bromelain là có khả năng thuỷ phân 1000 phần thịt. Enzyme bromelain được rãi lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch enzyme hoặc tiêm dung dịch enzyme vào thịt để làm mềm thịt. Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta dùng renin. Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế. Gần Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 16 đây sử dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelain vỏ dứa đang được quan tâm vào mục đích này. 2.3.5.2. Trong y dược học Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 – 300 mg/kg thể trọng kết hợp với hoá trị hay xạ trị. Trong công nghiệp dược phẩm, nhiều hãng dược phẩm ở Châu Âu đã đưa bromelain vào thành phần thuốc. Ở Mỹ và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế. Chữa bệnh đau tim ( làm tan máu tụ gây đau tim ). Điều trị các bệnh nhiễm trùng ( Jayaran và ctv, 1991 ). Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con ( Chandler và Mynott, 1998 ). Chữa rối loạn tiêu hóa, giúp tiêu hóa chất đạm tốt, tăng khả năng đề kháng. Phối hợp với kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiễm trùng. Điều trị bong gân, căng cơ, đau và nhức cơ. Bromelain trong dứa là hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế protease HIV. Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên ( Nielsel và ctv, 2001 ). Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật...Đó là thành quả nghiên cứu của các nhà khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ ( Viện Hóa học, Viện Khoa học - công nghệ VN ) năm 2006. Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ. 2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 2.3.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước Ở nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch và khả năng ứng dụng của enzyme này. Một số công trình nghiên cứu về enzyme bromelain như: Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 17 Lê Thị Thanh Mai ( 1997 ) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tinh sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao. Nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng ( 2002 ) nghiên cứu điều kiện nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm thô cho thấy có thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột SP-Streamline với hiệu suất cao. Dương Thị Hương Giang và ctv ( 2005 ) nghiên cứu tinh sạch bromelain từ phụ phẩm vỏ dứa cho thấy có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp sắc ký gel mở rộng với hệ thống cột Stream line 50 và gel trao đổi ion âm SP-Streamline XL với hiệu suất cao. 2.3.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, tripsin ,ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark ). Kết quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi ( sardine ) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 18 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu và hóa chất 3.1.1. Nguyên liệu Vỏ quả dứa 3.1.2. Hóa chất Hóa chất để tủa: Cồn 96o, muối ammonium sulphate và aceton. Dung dịch đệm phosphate : NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4. Hóa chất xác định hàm lượng protein: thuốc thử Bradford. Hóa chất xác định hoạt tính enzyme. Hóa chất để cố định enzyme: - Đệm phosphate 0.1 M pH 7 - CaCl2 0.02 M - Acid acetic 1% 3.1.3. Thiết bị Máy quang phổ UV-Vis Máy ly tâm. Máy xay vỏ dứa. Máy đo PH. Bể ổn nhiệt. Cân phân tích. Ống nghiệm Bình tam giác. Giấy lọc. Pipet thủy tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml. Pipet man các loại. Đầu típ các loại. Cốc thủy tinh 100ml, 250ml. Giá đựng ống nghiệm Ống đong 50ml, 100ml, 500ml Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 19 3.2. Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain Vỏ dứa Nghiền Lọc Dịch lọc Li tâm Thu dịch Tuả Ly tâm Enzyme thô Chạy sắc ký Cồn 960 Ammonium sulfate Aceton Enzyme Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 20 3.2.1. Thuyết minh quy trình Vỏ dứa sau khi thu nhận từ các cơ sở đưa đươc về phòng thí nghiệm. Tại đây, vỏ dứa được xay hoặc nghiền nát. Sau đó, đem đi lọc thu được dịch lọc và mang dịch lọc này ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ cặn và thu lấy dịch. Sau đó, tạo tủa cho dịch này bằng cồn 960 , muối ammonium sulfate, và aceton.. Li tâm các hỗn hộp dịch trên và thu được enzyme thô , chạy sắc ký enzyme thô và thu được enzyme. 3.2.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 960, muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton (CH3COCH3) 3.2.2.1 Nguyên tắc Các điều kiện thí nghiệm được tiến hành trong môi trường lạnh nhằm tránh làm mất hoạt tính enzyme và kết tủa thu được tốt hơn. Cho tác nhân tủa đã làm lạnh vào dung dịch enzyme cần tủa giữ ở nhiệt độ lạnh vào bình tam giác. Lắc đều hỗn hợp, để yên trong tủ lạnh 40 phút. Sau đó đem ly tâm lạnh, lấy cặn hòa lại trong dung dịch đệm, bảo quản lạnh. 3.2.2.2. Tủa enzyme bằng cồn 960 Cho dịch lọc là vỏ dứa tủa bằng cồn 960 đã được làm lạnh. Bảng 3.1. Tỉ lệ tủa bằng cồn 960 đối với dịch enzyme từ vỏ dứa Dịch enzyme từ vỏ (ml) 40 40 40 40 40 40 Cồn lạnh 960 (ml) 40 80 120 160 200 240 Dịch enzyme :Cồn 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 ¾ Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng cồn 960 đã được làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và cồn 960 tương ứng với mỗi tỉ lệ như bảng trên. Khuấy đều. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 21 Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.2.3. Tủa enzyme bằng muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 Cho dịch lọc là vỏ dứa tủa bằng muối theo các nồng độ % khác nhau. Bảng 3.2. Nồng độ tủa bằng muối (NH4)2SO4 đối với dịch enzyme từ vỏ dứa Dịch enzyme từ vỏ (ml) 40 40 40 40 40 40 40 Nồng độ muối (%) 50 55 60 65 70 75 80 ¾ Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng muối đã cân vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và nồng độ muối ammonium sulfate ((NH4)2SO4) tương ứng như bảng trên. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.2.4. Tủa enzyme bằng aceton (CH3COCH3) Cho dịch lọc vỏ dứa tủa bằng aceton đã được làm lạnh trước theo các tỷ lệ khác nhau. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 22 Bảng 3.3. Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa Dịch enzyme từ vỏ(ml) 40 40 40 40 40 40 Aceton lạnh (ml) 40 80 120 160 200 240 Dịch enzyme : Aceton 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 ™ Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng aceton đã được làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và aceton tương ứng với mỗi tỉ lệ như bảng trên. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme 3.2.3.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford Bradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có một số ưu điểm như sau: − Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử). − Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20μg). − Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định. − Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein. ™ Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 23 Trong dung dịch manh tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bước sóng cực đại ở 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu xanh. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. ™ Hóa chất và thiết bị ¾ Hóa chất Dung dịch mẫu protein cụ thể trong bài này là mẫu enzyme bromelain cần xác định. Dung dịch albumin chuẩn (0.1 mg/ml): cân chính xác 10mg albumin, thêm 50ml nước cất khuấy tan albumin. Cho toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức 100 dẫn nước tới vạch → dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml. Giữ ở –200C. Dung dịch thuốc thử Bradford: có thành phần trong 100ml như sau: − Coomasie Brilliant Blue (CBB) 0.001g − Ethanol tuyệt đối 4.7g − Acid phosphoric 85%: 8.5g Phẩm màu CBB được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp. Bổ sung acid phosphoric và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc đều. Bảo quản ở 40C. ¾ Thiết bị Máy đo quang phổ UV – Vis. ™ Các bước tiến hành ¾ Xây dựng đường chuẩn albumin Chuẩn bị các ống đánh số từ 0 đến 10. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 24 Bảng 3.4. Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch albumin (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Lắc đều các ống nghiệm, tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy đo quang phổ UV-Vis. Trị số mật độ quang phổ (OD) của các ống từ 1 đến 10 sau khi trừ đi trị số ống đối chứng (ống 0) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang phổ (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). ¾ Xác định nồng độ protein của mẫu Dịch chiết enzyme từ vỏ dứa cũng được tiến hành tương tự như trên. Thay dung dịch albumin bằng mẫu enzyme cần định lượng, mẫu được pha sao cho trị số mật độ quang đo được nằm trong khoảng của đường chuẩn. Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml). ¾ Tính kết quả Tổng hàm lượng protein trong M ( g ) chế phẩm thô được tính theo công thức: mg protein = b*10-3*m*M Với: b: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (μg/ml). Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 25 m: hệ số pha loãng. M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g). 3.2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano ™ Nguyên tắc: Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme được biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme. ™ Hoá chất và thiết bị ¾ Hóa chất: HCl 0.1 M Na2CO3 0.4 M Dung dịch TCA 0.4 M Tyrosin tinh khiết Thuốc thử Folin Đệm phosphate pH 7 0.1 M Dung dịch casein 1% : Cân 1g casein thêm vào 100ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7 ¾ Thiết bị và dụng cụ: Ống nghiệm Pipette Bình định mức Giấy lọc Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV – Vis Máy đo pH ™ Các bước tiến hành ¾ Xây dựng đường chuẩn Tyrosin Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 26 Bảng 3.5 . Bảng số liệu dựng đường chuẩn Tyrosin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch Tyrosin chuẩn (μl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch HCl (μl) 1000 99 0 980 97 0 96 0 95 0 94 0 93 0 920 910 900 Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μgTyrosin/ml như bảng. Thêm 5ml dung dịch Na2CO3 0.4 M vào dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trôn đều, để yên dung dịch ở 370C trong 20 phút . Đo độ hấp thụ của dung dịch này ờ bước sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90, As100 . Đối với ống đối chứng: dùng 1ml acid HCl 0.1 M thay cho Tyrosin. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 660nm, ghi nhận kết quả là Aso . Trị số mật độ quang của các ống từ 1 – 10 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị ∆OD1 - ∆OD10 . Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên ∆OD theo nồng độ protease. Đồ thị này gọi là đường chuẩn Tyrosin. ¾ Xác định hoạt tính enzyme bromelain Cho 1ml dung dịch casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 370 C trong 10 – 15 phút Sau đó, cho 1ml dịch chiết enzyme vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 370 C trong 60 phút. Cho vào 2ml dung dịch TCA 0.4 M để ngừng phản ứng enzyme. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 27 Để yên dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Sau đó cho 5ml dung dich Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Thêm 1ml thuốc thử Folin. Trộn đều để yên trong 20 phút. Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm ( ghi nhận kết quả này là Am) Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như với mẫu thì nghiệm với cùng điều kiện.Ghi nhận kết quả này là A0 Hàm lượng Tyrosin được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy (Am – A0) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn Tyrosin để xác định hoạt độ protease. Một đơn vị hoạt tính ( ĐVHT ) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 μg Tyrosin trong 1 μl dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme Bromelain ( ĐVHT/ml ) 100 n*F*) A- (A 0m= Hoạt tính enzyme Bromelain ( ĐVHT/mg ) M*100 V*n*F*) A- (A 0m= Trong đó: F: lượng Tyrosin có trong đường chuẩn(μg). n: hệ số pha loãng của enzyme. M: khối lượng chế phẩm enzyme thô. 1/100: hệ số chuyển pha. A0 : Độ hấp thụ của ống đối chứng. Am : Độ hấp thụ của mẫu. ¾ Tính hoạt tính riêng ( HTR ) của enzyme bromelain Từ kết quả hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain tính hoạt tính riêng enzyme bromelain. HTR = Số đơn vị hoạt tính/ mg protein enzyme (ml/mg) Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 28 3.3. Enzyme cố định 3.3.1. Định nghĩa enzyme cố định Enzyme cố định ( hay enzyme không tan) là enzyme có sự tham gia hoặt động trong một không gian bị giới hạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoặt của enzyme bằng cách gắn nó vào một pha cách ly tách rời khởi pha lỏng tự do và ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với các phần tử cơ chất, effector hay inhibutor ( chất ức chế ). Pha gắn enzyme thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polyme ưa nước. Enzyme không tan được nghiên cứu và ứng dựng từ những năm 1950. Để chế tạo enzyme cố định có thể dùng phương pháp hấp phụ, liên kết hóa trị để gắn kết enzyme. Chất dùng để gắn kết enzyme gọi là chất mang ( enzyme ), hiện nay người ta thường dùng xenluloza, tinh bột, rephadex, agaroza, alghinat canxi, gel polyacylamit, bột thủy tinh, nylon,…Chế phẩm enzyme không tan có thể ở dạng bột, hạt, phiến, màng mỏng. Trong một số trường hợp không cần thiết phải gắn enzyme vào chất mang mà có thể giữ nó ở bên trong mạng lưới polymer bao quanh lấy phân tử enzyme. Mạng lưới đó có mặt nhờ không cho phép enzyme thoát ra khỏi mạng nhưng vẫn lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra qua lại dễ dàng. Theo thống kê, đầu năm 1995 người ta đã chế tạo được trên 100 chế phẩm enzyme cố định. Lợi ích của việc sử dụng enzyme cố định. Giảm giá thành do enzyme được sử dụng lặp lại nhiều lần với cùng một kiểu phản ứng xúc tác, chế phẩm bền hơn trong điều kiện pH, nhiệt độ áp suất thẩm thấu tối uư, tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản suất ở mức đô tự động hóa cao. Chế tạo enzyme tương đối dễ, đầu tư xây dựng và sản xuất tương đối ít, sản phẩm phản ứng không lẫn lộn với enzyme( chỉ một số ít bị rửa trôi theo dòng chảy của tác nhân), có thể dễ dàng tổ chức sản xuất các sản phẩm lên men bằng enzyme ngoại bào như: rượu etylic, axit hữu cơ, axit amin, vitamin. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 29 3.3.2. Tính chất ưu và nhược điểm của enzyme cố định 3.2.2.1. Ưu điểm Enzyme cố định ngày càng sử dụng rộng rãi là nhờ vào những đặc điểm nổi