Khóa luận Tìm hiểu quy trình vi nhân giống cây khoai lang nhật từ đốt thân

hất hữu cơ khác. 1.2.3.2. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. 1.2.3.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Ở giai đoạn này cây non được tạo ra hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một thước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. 1.2.3.4. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro nuôi cấy trong điều kiện ône định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm... Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng vcó cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệ độ không khí mát, ẩm độ cao... cây non thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá( thường 7 – 10 ngày kể từ ngày cấy). rễ được tạo ra trong quá trình cấy mô sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ. 1.2.4. Vai trò các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ. Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bào nên chúng được khảo sát hoặc đào thải khá nhanh. Ngược lại, các chất điều hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng thực tế. Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuối cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberillin, abscisic acid và etylen. 1.2.4.1. Auxin Auxin là hợp chất có nhân indole, gồm có 2 loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra ( IAA) và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, …) Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và tác động hỗ trợ của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác. Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sự căng của thành tế bào giảm đi và tế bài kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là sự tổng hơp ARN ribosome. Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo. Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do các hoạt động của các enzyme auxin-oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. 1.2.4.2. Cytokinin Cytokinin (gồm Kinetin, IBA, Zeatin và 2-iP) được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là Zeatin và IBA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP. Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, ngược lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác dụng của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ phát triển và cạnh tranh với các chồi ngọn. Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong quá trình phân hóa, tạo điều kiện nuôi cấy in vitro . 1.2.4.3. Gibberellin Gibberellin cũng như auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3. đây là các chất có cấu trúc nội sinh. Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí các chất thế trên nhân. Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt thân. Tác động này cũng có thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hơn hoặc những phát hoa phát triển hơn( trên các loài nho có chùm nhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thoáng hơn). Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt, chằng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác. Một hoạt động cũng phức tạp trong hiện tượng làm thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống. Hiệu quả này sẽ làm thuận lợi cho sự nảy mầm hoặc là để thay thế sự lạnh và để thu được một sự tăng trưởng tốt. 1.2.4.4. Etylen Gia tăng quá trình rụng lá và trái được sử dụng cho phép thu hoạch cơ giới trái (ví dụ: trái olive, cerise,...) Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa. Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ. Tất cả các bộ phận của cây đều có khả năng tổng hợp etylen, nơi sản xuất quan trọng nhất là trái cây, kế đến ở mức độ kém hơn là hoa, cũng như chúng có ở các cơ quan thực vật bị chấn thương. 1.2.4.5. Abscisic acid Abscisic acid (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuôi cấy phôi. Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium ( K+), do tác động này nó đã ảnh hưởng trên sự đóng các lỗ khí khổng của lá. Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nó có thể hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago). Áp dụng trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi chẳng hạn như cây Equinard , Lolium tenmulentum). Trong nuôi cấy mô, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây và phần khác tùy các điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khó khăn. Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog: ü Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinh tạo rễ. Nếu tỉ lệ auxin/cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân. ü Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mô sẹo. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình hình thành và phát triển của cây nuôi cấy in vitro Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của cây bao gồm các yếu tố hóa học lẫn vật lý. 1.2.5.1. Carbon Carbon là một nguồn dinh dưỡng quan trọng có ảnh hưởng đến sự phát triển, phân chia và tăng sinh khối của mô, tế bào thực vật. Trong tự nhiên, nguồn carbon này được cây lấy từ không khí (CO2) thông qua quá trình quang tự dưỡng nhờ ánh sáng mặt trời và tổng hợp nên các thành phần của tế bào. Trong điều kiện in vitro, ban đầu các mô, tế bào thực vật không có khả năng tự tổng hợp hoặc khả năng tổng hợp tế bào kém nên ta phải bổ sung các loại đường để cung cấp carbon cho cây in vitro. Thông thường, đường saccharose tạo nên nguồn carbon tốt nhất. Việc trải qua quá trình khử trùng trong nồi hấp autoclave gây ra việc phân hủy đường do sự thủy phân, nhưng điều này không thể hiện điều bất lợi nào đến sự phát triển của thực vật. 1.2.5.2. Vitamin Việc sử dụng các vitamin khác nhau thường làm thuận lợi cho sự phát triển của cây nuôi cấy in vitro. Các vitamin vẫn thường được sử dụng trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật thuộc nhóm B như: ü B1 hoặc Thiamin: Phân hủy trong autoclave, nhưng các chất bị phân hủy này cũng có tác động lên sinh trưởng của mô như chưa phân hủy ü B6 hoặc Pyridoxine ü Biotin ü Pantotheate Canxi ü Myo – inositol 1.2.5.3. Ánh sáng Ánh sáng mang ý nghĩa là yếu tố năng lượng. Quá trình tổng hợp các hợp phần Carbon của một cơ thể tự dưỡng như thực vật thông qua quá trình quang hợp, thế nhưng trong điều kiện nuôi cấy in vitro, mức độ quang hợp của cây tương đối thấp và các cấu phần của cây được tạo thành chủ yếu nhờ sự bổ sung dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy. Người ta cũng đã nghiên cứu và nhận thấy khả năng kéo dài thân cây thông qua tác động của ánh sáng trong quá trình nuôi cấy nhờ hệ thống phytochrome của thực vật (Jabben, 1980). 1.2.5.4. Nhiệt độ Mỗi một loài cây có một khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển. Thậm chí, sự chênh lệch nhiệt độ giữa các chu kỳ sáng tối cũng có những ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của cây. Những nghiên cứu về ảnh hưởng của sự chênh lệch này đã được Kozai và cộng sự tiến hành và đưa ra kết quả vào năm 1992 trên đối tượng là cây khoai tây in vitro. 1.2.5.5. Độ ẩm Trong môi trường nuôi cấy in vitro, độ ẩm luôn duy trì ở mức cao, độ ẩm tương đối khoảng 90-95%. Áp suất hơi bên trong mặt lá gần cân bằng với môi trường xung quanh dẫn đến tình trạng cây con in vitro bị thiểu năng khí khổng, nhiều khi bị tiêu biến lông sừng và cây dễ bị mất nước khi đưa ra vườn ươm. Đây cũng là một hạn chế trong nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro. Hiện nay nhiều hệ thống thoáng khí đã được nghiên cứu, một phần cũng để giảm bớt hiện tượng bất lợi trên. 1.2.5.6. Không khí Thực vật có khả năng quang hợp, thế nên trong bình nuôi cấy luôn có sự thay đổi nồng độ CO2 và O2 theo chu kì sáng, tối là do hoạt động quang hợp và hô hấp của mô thực vật. Trong bình, còn có sự phóng thích ethylene từ mẫu cấy. Chính sự hình thành ethylene cũng đã gây ra những ảnh hưởng xấu lên sự phát triển bình thường của cây như làm giảm sự mở lá, làm ngắn chồi, cây hướng ngang đất,… 1.3. Môi trường khoáng đối với sự phát triển của thực vật 1.3.1. Các nguyên tố trong cơ thể thực vật Thưc vật là sinh vật tự dưỡng, chúng có thể sống trong môi trường vô cơ hoàn toàn, lấy CO2 từ khí quyển (qua lá), nước và các chất khoáng từ đất (qua rễ). C, O và H là thành phần của mọi chất hữu cơ, chiếm trên 90% trọng lượng khô: ü C, 40 – 50% chất khô; ü O, 42 – 45% chất khô; ü H, 6 -7 % chất khô. Các nguyên tố khác, gọi là nguyên tố khoáng (vì có nguồn gốc từ đất), được sắp xếp thành hai nhóm ( gồm 13 nguyên tố): ü Các nguyên tố đa lượng (S, P, Mg, Ca, K, N, O, C, H) có tỉ lệ vài %o – vài %; ü Các nguyên tố vi lượng (Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, B, Cl) có tỉ lệ dưới 1 %o. Các nguyên tố được cho vào các môi trường dinh dưỡng nhân tạo ở dạng ion và tỉ lệ thích hợp. 1.3.2. Vai trò của các nguyên tố thiết yếu Ø Các nguyên tố đa lượng Các chất dinh dưỡng đa lượng được dùng làm thành phần của các chất hữu cơ, tạo thể thẩm thấu cho tế bào. Các cation hóa trị 2 như Ca²+ hay Mg²+ có khả năng làm biến đổi tính thẩm thấu của màng. Vài chất dinh dưỡng đa lượng cũng hoạt hóa enzyme. Ø Các nguyên tố vi lượng Các chất dinh dưỡng vi lượng là thành phần của coenzyme hay enzyme, hoạt hóa enzyme. 1.3.3. Các hiện tượng của thực vật thiếu yếu tố thiết yếu Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng đều có vai trò vi lượng (điều hòa hoạt động enzyme). Thực vật chỉ cần một lượng nhỏ chất khoáng, tuy nhiên việc thiếu một nguyên tố thiết yếu sẽ gây những rối loạn biến dưỡng, dẫn tới hiện tượng thiếu dinh dưỡng đặc trưng. Trong thiên nhiên thực vật có thể thiếu đồng thời vài nguyên tố. Một số bệnh do virus hay vi sinh vật cũng gây những hiện tượng tương tự. Ø N (nitrogen) N là thành phần của acid amin, nucleotid, hormon, coenzyme,... Thiếu N, sườn carbon không được dùng cho sự tổng hợp các hợp chất nitrogen (tỉ lệ C/N cao), khiến lá bị hóa vàng (đặc biệt là các lá già ở gốc cây) hay có mày đỏ, cây chậm phát triển, thân mảnh và thường hóa gỗ. Ø P (phosphor) P là thành phần của ATP, phospholipid, acid nucleic, coenzyme. Thiếu P, cây non giảm sinh trưởng (thân mảnh, nhưng không hóa gỗ), chậm phát triển, lá hóa vàng (thường ở ngọn, phần này trở nên vàng và khô, trong khi ở gốc hầu như còn màu xanh lục đậm). Ø K (potassium) K có vai trò trong sự cân bằng ion (điều hòa thế thẩm thấu), cử động khí khổng, hoạt hóa vài kinase (chuyển nhóm phosphat từ chất này sang chất khác), tổng hợp polyholosid và protein. Thiếu K, cây thường tích tụ các acid amin, lá hóa vàng (các đốm vàng xuất hiện ở ngọn và mép lá, giữa các gân, sau đó phát triển thành hoại mô), lá có thể xoắn và nhăn, thân mảnh và yếu ớt với những lóng ngắn bất thường. Vì K rất linh động và được huy động mạnh bởi các lá non, nên triệu chứng xuất hiện trước ở các lá già ở gốc. Ø S (sulfur) S là thành phần của cystein, cystin, methionin, acid lipoic, coenzyme A, thiamin pyrophosphat, glutathion, biotin,... Thiếu S, cây có nhiều hiện tượng giống sự thiếu nitrogen: lá hóa vàng, chậm phát triển và tích tụ anthocyanin. Tuy nhiên, sự hóa vàng của lá là do thiếu sulfur thường xảy ra trước ở các lá non, vì sulfur khó được huy động tới các lá non. Ø Ca (calcium) Ca có trong vách tế bào, thoi phân chia, là yếu tố phụ của vài enzyme thủy giải ATP và phospholipid, cần cho hoạt động bình thường của màng và đặc biệt là thông tin thứ cấp cho nhiều phản ứng đáp lại các dấu hiệu của môi trường và hormon. Ngược với K, Ca ít linh động. Thiếu Ca, cây biểu hiện sự thiếu sắt (úa vàng), mô bị mền nhũn, lá non hẹp và cong xuống. Ø Mg (magnesium) Mg là thành phần của porphyrin diệp lục tố, có vai trò hoạt hóa các enzyme trong sự hô hấp, quang hợp và sinh tổng hợp acid nucleic. Thiếu Mg, hiện tượng vàng lá xảy ra trước ở các lá già (do tính di động cao của Mg), sự rụng lá non có thể xảy ra. Ø Fe (sắt) Fe là thành phần của nhiều enzyme (trong porphyrin của cytochrome, catalaze, peroxidaze, leghemoglobin và trong ferrendoxin, nitrogenase), có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp diệp lục tố. Thiếu Fe, hiện tượng vàng lá bắt đầu ở các lá non. Sắt ít di động, do trầm hiện trong các lá già ở dạng oxide hay phosphat, hay do tạo phức với phytoferritin, một protein dính với sắt. Ø Cu (đồng) Giống với sắt, Cu liên kết với các enzyme liên quan trong sự chuyển điện tử (như plastocyanin). Thiếu Cu, lá có màu lục sẫm và có thể bị xoắn hay biến dạng . Lá non có các vết hoại mô (bắt đầu từ chót lá, sau đó kéo dài xuống, dọc theo mép lá), và có thể rụng (nếu sự thiếu trở nên nghiêm trọng). Ø B (bor) B liên quan trong sự tổng hợp acid nucleic, các phản ứng hormon và các chức năng của màng, trong sự vận chuyển carbohydrat (borat thành lập các phức hợp với vài carbohydrat), và trong sự dùng calcium cho quá trình thành lập vách. Thiếu B, sự phân chia tế bào bị cản, sự hoại mô đen xảy ra ở lá non (chủ yếu ở gốc lá), nụ hay củ; trái và rễ phù to; cây có thể mất ưu tính ngọn và phân nhánh nhiều (tuy nhiên ngọn nhánh bị hoại mô ngay sau đó). Ø Mn (mangan) Mn cần cho sự quang hợp và hoạt động của nhiều enzyme, đặc biệt là các dehydrogenase và decarboxylase trong chu trình acid tricaboxylic. Thiếu Mn, có hiện tượng vàng lá (trên lá già hay non, tùy loài) và sự phát triển của các vết hoại mô nhỏ. Ø Zn (kẽm) Zn cần cho hoạt động của nhiều enzyme (như alcol dehydrogenaze) tổng hợp auxin và diệp lục tố. Thiếu Zn, sự tăng trưởng lóng giảm (cây có dạng hoa hồng) vì sự tổng hợp auxin bị xáo trộn. Lá nhỏ và vặn vẹo, bìa lá nhăn; hiện tượng vàng lá xảy ra ở lá già (bắp , lúa miến, đậu) dẫn tới sự phát triển của các vết hoại mô trắng. Ø Mo (molypden) Mo là thành phần của nitrat reductase. Thiếu Mo, có hiện tượng vàng lá và hoại mô ở các lá già; hoa rụng sớm hay không thành lập được. Ở vài loài thực vật (bông cải), lá không bị hoại mô nhưng xoắn và chết sau đó. Hiện tượng thiếu nitrogen xảy ra nếu nguồn nitrogen là nitrat. Ø Cl (chlor) Cl cần cho sự quang hợp (như Mn) và sự phân chia tế bào của lá và rễ. Thiếu Cl, hiện tượng vàng lá và hoại mô xảy ra, dẫn tới sự héo của ngọn lá, lá có màu đồng và phát triển chậm, rễ dày lên ở vùng gần ngọn. Cl dễ hòa tan và thường sẵn sàng trong đất, nên sự thiếu Cl ít xảy ta trong tự nhiên. Tóm lại, sự thiếu các chất khoáng làm thực vật giảm sinh trưởng. Các hiện tượng thiếu dinh dưỡng thấy được bằng mắt là những chỉ dẫn khác chính xác cho nông nghiệp, giúp ta biết nhu cầu sinh dưỡng cần bổ sung cho cây trồng. Mặt khác, các hiện tượng thiếu còn giúp ta biết tính linh động của nguyên tố. Khi nguyên tố di chuyển dễ dàng (N, P, K), các hiện tượng thiếu xảy ra ở các lá già trước ; ngược lại, khi nguyên tố bất động (B, Fe, Ca) các hiện tượng thiếu được thấy ở các lá non trước. Các hormon thực vật, đặc biệt là cytokinin liên quan tới tính linh động của các nguyên tố. Giới thiệu các bước trong nhân giống cây khoai lang in vitro từ đốt thân 2.1.1. Quy trình Mẫu cấy â Khử trùng mẫu â Tạo thể nhân giống â Nhân giống in vitro Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro â Chuyển cây ra vườn ươm â 2.1.2. Thuyết minh quy trình 2.1.2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu Ø Chọn lựa mẫu Đoạn thân có mang chồi nách kích thước khoảng 2 cm được sử dụng làm mẫu cấy ban đầu. Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro. Khi lựa chọn mẫu cần lưu ý đến tuổi sinh lý của đốt thân, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu. Ø Khử trùng mẫu - Bên ngoài tủ cấy: Các mẫu cấy đoạn thân khoai lang sau khi thu nhận được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút để loại bớt bụi bẩn bám trên thân cây, dùng xà phòng loãng rửa sơ bề mặt lá sau đó ngâm trong cồn 70o (30 giây) rồi rửa lại 3 – 4 lần bằng nước cất vô trùng. - Bên trong tủ cấy: Mẫu sau khi khử trùng sơ bộ được chuyển vào tủ cấy và lắc khử trùng với dung dịch Javel có bổ sung 2 – 3 giọt Tween-20 trong 10 phút, sau đó được rửa lại bằng nước cất vô trùng (4 – 5 lần). 2.1.2.2. Tạo thể nhân giống Trong giai đoạn này, mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những cây khoai lang, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi. Mẫu cấy đoạn thân sau khi khử trùng được chuyển vào môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 0.5 mg/l IAA, NAA hoặc GA3 trong 1 tuần để cảm ứng bật chồi. 2.1.2.3. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu là thể chồi, môi trường nuôi cấy giống với môi trường tạo thể chồi. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Trong giai đoạn này, nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hệ số nhân in vitro như thành phần khoáng trong môi trường, loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng,... Mẫu cấy ban đầu được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 20 hoặc 60 g/l đường sucrose có hoặc không có kết hợp với 0.1 mg/l BA để kéo dài chồi. Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh việc tìm hiểu quy trình nhân giống in vitro cây Khoai lang từ đốt thân, em còn trực tiếp tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số môi trường khoáng lên sự phát triển của chồi Khoai lang Nhật in vitro (được trình bày cụ thể trong phần 2.2). 2.1.2.3. Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Trong quy trình này, chồi in vitro được cảm ứng ra rễ trên môi trường MS chứa 20 g/l đường sucrose không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật. 2.1.2.4. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiều sáng thấp,... Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Để tránh tình trạng cây con bị stress, mất nước hay mau héo và chết, vườn ươm cần mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con được chuyển ra vườn ươm đạt tỉ lệ sống sót 95%. Theo quy trình này, từ một mẫu cấy ban đầu, sau 9 lần cấy chuyền có thể tạo ra được từ 2 – 8 triệu cây con sạch bệnh (Mervat, 2007). 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật 2.2.1. Vật liệu 2.2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các cây khoai lang in vitro HL518 giống β sạch virus được lấy từ phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới . 2.2.1.2. Mẫu thí nghiệm Mẫu nuôi cấy là các đốt khoai lang in vitro có kích thước 1 ± 0,3 cm. Các đốt này lấy từ đốt thứ 2 hoặc 3 tính từ ngọn xuống. Hình 2.1. Cây khoai lang in vitro Hình 2.2. Mẫu đốt thân dùng cho thí nghiệm 2.2.1.3. Môi trường nuôi cấy Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật được thực hiện trên 6 môi trường : MS1/2 ( là môi trường MS có thành phần đa lượng giảm đi một nửa) MS1/8 ( là môi trường MS có thành phần đa lượng giảm đi 8 lần) MS White B5 Vacin & Went Bổ sung đường 20g/l và agar 8g/l môi trường, trước khi hấp khử trùng điều chỉnh pH = 5,7 – 5,8. Hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121ºC, 1 atm trong 20 phút. 2.2.1.4. Điều kiện nuôi cấy Ø Địa điểm, thời gian thí nghiệm Thời gian thực hiện thí nghiệm: 4 tuần (3/5 - 3/6/2011) tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh. Ø Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ü Trang thiết bị - Tủ cấy SANYO (Sanyo Electric Co. Ltd., Nhật Bản) - Nồi hấp Hirayama, model HV-85 (Hirayama Manufacturing Co., Nhật Bản) - Máy đo pH Presia pH 900 - Cân phân tích model TE1502S (d = 10 mg) và TE214S (d = 0,1 mg) (công ty Satorius, AG Göttingen, Đức).. - Bóng đèn huỳnh quang (1,2 m) - Kệ đặt bình - Máy đo diện tích lá ü Dụng cụ Pince, kéo, dao cấy, ống đong (1000 ml, 100 ml, 25 ml, 10 ml), chai nước biển 500 ml, bình tam giác 370 ml. Hình 2.3. Máy đo diện tích lá Hình 2.4. Một số trang thiết bị sử dụng trong thí nghiệm a. Nồi hấp Hirayama, model HV-85 b. Tủ cấy Sanyo c. Cân phân tích d. Máy đo pH Thermo 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 6 nghiệm thức , mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 4 mẫu. Hình 2.5. Mẫu bố trí thí nghiệm Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khoáng Nghiệm thức Môi trường 1 MS 20 2 MS ½ 3 MS 1/8 4 B5 5 White 6 Went 2.3. Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ : tính số rễ cái hình thành trên 1 cây (chỉ tính các rễ có chiều dài hơn 1cm vào ngày kết thúc thí nghiệm) Số lá : số lá hình thành sau thời gian nuôi cấy đếm được Chiều dài rễ: chiều dài rễ được tính từ gốc cây đến đầu rễ dài nhất trên cây. Đơn vị tính (cm) Chiều dài thân: chiều dài thân được tính từ gốc tới ngọn cây. Đơn vị tính (cm) Diện tích lá: diện tích lá ở 4 lá đầu tiên từ đỉnh xuống. Đơn vị (mm2) Gia tăng trọng lượng tươi thân Gia tăng trọng lượng tươi rễ Gia tăng trọng lượng khô thân Gia tăng trọng lượng khô rễ 2.4. Phương pháp phân tích thống kê Số liệu thí nghiệm đươc phân tích thô bằng Microsoft Office Excel và phân tích thống kê ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0. Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật HL518 giống β sạch virus. Hình 3.1. Cây khoai