Khóa luận Tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu hại và quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng ký sinh sâu hại

tồn tại nữa. Nhờ thành công trong công nghệ nhân nuôi EPN, người ta không những chủ ñộng phòng trừ sâu hại mà cồn bổ sung nguồn thiên ñịch EPN cho ñồng ruộng. 3.2.2. Sự xâm nhập vào côn trùng vật chủ của tuyên trùng Về mặt lý thuyết thì chỉ cần 1 IJs của tuyến trùng xâm nhập vào côn trùng cũng có thể làm chết vật chủ, mặc dù vậy trong thực tế số lượng IJs vào côn trùng vật chủ thường nhiều hơn. Do ñó tỷ lệ xâm nhập cao của IJs vào côn trùng vật chủ vẫn là yếu tố quan trọng nhất ñể ñánh giá khả năng tấn công của một chủng tuyến trùng ñối với 1 loài sâu hại. Mặt khác, ñây cũng là chỉ tiêu ñể ñánh giá sự mẫn cảm của một loài sâu hại ñối với một chủng tuyến trùng. Một trong những nguyên nhân có thể cản trở sự xâm nhập của tuyến trùng vào cơ thể vật chủ là cơ chế bảo vệ của côn trùng . Một số loại côn trùng có khả năng kháng lại một lượng nhỏ tuyến trùng xâm nhập bằng cơ chế miễn dịch, hoặc bằng cơ chế cơ học với màng lưới bao bọc các lỗ thở. Các cơ chế trên ñây có thể ngăn cản tuyến trùng hoặc làm cho tuyến trùng có thể thất Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 19 bại trong nỗ lực xâm nhập và giết chết vật chủ. Mặt khác số chất tiết của côn trùng vật chủ cũng có khả năng hấp dẫn một số tuyến trùng tìm kiếm, xâm nhập vào cơ thể vật chủ. Khả năng xâm nhập của tuyến trùng càng cao cũng có nghĩa là vật chủ càng mẫn cảm với tuyến trùng và trong trường hợp này côn trùng vật chủ bị nhiễm ñộc càng nhanh và bị chết nhanh hơn so với côn trùng ít mẫn cảm hơn. Ngoài sự, xâm nhập của tuyến trùng vào các phần khác nhau của côn trùng vật chủ cũng khác nhau phụ thuộc vào chủng tuyến trùng và côn trùng vật chủ. Vì vậy, ngoài việc ñánh giá về số lượng tuyến trùng xâm nhập, tỷ lệ xâm nhập vào các phần khác nhau của côn trùng cần ñược xem xét ñể hiểu rõ ràng về cơ chế và ñặc trưng xâm nhập của tuyến trùng ñối với côn trùng ñối với côn trùng vật chủ. Về mặt lý thuyết, IJs có khả năng xâm nhập vào cơ thể côn trùng vật chủ qua lỗ miệng, hậu môn, lỗ thở hoặc xuyên qua thành cơ thể tại khớp nối giữa các ñốt. Tuy nhiên, tỷ lệ xâm nhập vào các phần cơ thể khác nhau của côn trùng vật chủ là phân ñầu ngực, phần bụng và phần cuối bụng lại khá khác nhau, phụ thuộc vào loài côn trùng vật chủ và chủng tuyến trùng ký sinh. So sánh tỷ lệ tuyến trùng xâm nhập vào các phần khác nhau của côn trùng vật chủ là ấu trùng BSL cho thấy: Trong tổng số IJs có mặt bên trong cơ thể ấu trùng BSL thì chủng tuyến trùng S-TK10 có tỷ lệ IJs xâm nhiễm vào phần ñầu ngực nhiều nhất (46,3%), sau ñó ñến phần bụng (41,5%) và phần cuối bụng có tỷ lệ thấp nhất (12,2%). Trong thí nghiệm với chủng S-TX1, cũng cho kết quả tương tự với chủng S-TK10: tỷ lệ 43,2% ở phần ñầu + ngực, 41,6% ở phần bụng và 15,2% ở phần cuối bụng. 3.2.3. Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng Việc nghiên cứu xác ñinh thời gian sinh trưởng và phát triển của một chủng tuyến trùng có ý nghĩa quan trọng trong việc xác ñịnh thời gian nhân ủ Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 20 tối ưu trong công nghệ nhân nuôi in vivo và in vitro ñể sản xuất sinh khối tuyến trùng. Thời gian sinh trưởng và phát triển của các chuyển tuyến trùng ñược tác giả Nguyễn Ngọc Châu (2010) cho biết như sau: Bảng.3.1: Thời gian sinh trưởng và phát triển của 4 chủng EPN ( Nhiệt ñộ: 26,2-29,20C ; ñộ ẩm: 70-90% ) Thứ tự Chủng EPN Thời gian sinh trưởng phát triển (ngày) Trưởng thành thế hệ 1 Trưởng thành thế hệ 2 Ấu trùng xâm nhiễm mới 1 H.indica MP11 3,5 6,5 9,0 2 H.indica NT3 4,0 7,0 10 3 S. loci TK10 1,5 3,5 4,0 4 S. sangi TK1 2,5 5,0 6,0 3.3. Quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh Do bản chất tự nhiên của các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh là những tổ hợp cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn, trong ñó các loài tuyến trùng giống Steinernema tổ hợp với các loài vi khuẩn giống Xenorhabdus, còn các loài tuyến trùng Heterorhabditis thì tổ hợp với các loài vi khuẩn giống Photorhabus. Các tổ hợp tuyến trùng của vi khuẩn này có tính chuyển hoá khá cao: Mỗi loài tuyến trùng có thể tổ hợp với một số loài vi khuẩn, nhưng mỗi loại vi khuẩn chỉ tổ hợp với các loài tuyến trùng nhất ñịnh. 3.3.1.Vai trò của tuyến trùng trong tổ hợp Trong tổ hợp cộng sinh tuyến trùng - vi khuẩn, tuyến trùng EPN có vai trò như sau: - Vector vận chuyển VKCS: một khi ñã xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng, tuyến trùng di chuyển thẳng vào xoang máu côn trùng, tại ñó vi Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 21 khuẩn cộng sinh trong cơ thể IJs trở nên hoạt ñộng nhanh chóng ñược giải phóng qua hậu môn tuyến trùng ra xoang máu côn trùng, vi khuẩn sinh sôi nảy nở một cách nhanh chóng, ñồng thời tiết ra chất ñộc gây nhiễm xoang máu và giết chết côn trùng trong vòng 24-48h. - Tuyến trùng bảo vệ vi khuẩn ở 2 mặt : Bảo vệ VKCS ở môi trường ngoài côn trùng vật chủ bằng cách ñể VKCS trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do VKCS không thể tồn tại trong môi trường ñất, nước. Bảo vệ VKCS ở trong cơ thể côn trùng. Khi VKCS ñược giải phóng từ cơ thể tuyến trùng vào xoang máu côn trùng, theo phản ứng tự nhiên côn trùng thường tiết ra một số chất kháng thể (dạng protein) ñể hạn chế hoặc loại bỏ VKCS. Trong khi ñó nhờ tuyến trùng có khả năng tiết ra một số chất làm trung hoà và làm mất tác dụng của chất kháng thể. Nhờ vậy, tuyến trùng bảo vệ cho VKCS phát triển bình thường trong cơ thể côn trùng. Bảng.3.2: Danh sách các loài vi khuẩn cộng sinh với EPN Các loài vi khuẩn cộng sinh Các loài tuyến trùng EPN 1. X. nematophila S. carpocapsae 2. X. bovienlii S. affine, S. Feltiae, S. krausei 3. X poinarii S. cubanum, S. glaseri 4. X beddingii Steinernema sp. 5. X. japonica S. kushudai 6. Xenorhabdus sp S. arenarium, S. Rarum, S. risteri 7. Photorhabus luminescens H. bacteriophora H. brevicaudis 8. P. temperata H. bacteriophora, H. megidis 9. P. asymbiotica Loài này phân lập từ người 10. Photorhabdus sp H. dawnesi, H. Ponari Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 22 3.3.2.Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò rất lớn ñối với tuyến trùng, thể hiện qua các mặt sau: - Sản sinh ñộc tố giết chết côn trùng bị nhiễm : ðộc tố do VKCS tiết ra một số protein ñộc có khả năng nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ và làm côn trùng vật chủ chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48 giờ. Như vậy, thời gian chết côn trùng vật chủ khác nhau tuỳ loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48 giờ. - Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: tuyến trùng sử dụng VKCS vừa ñược giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ ñó mà IJs cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và ñạt ñến tuổi trưởng thành. Từ thế hệ 2 tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng hoạt hoá xác chết côn trùng: Nhờ các enzyme do vi khuẩn sinh ra mà các mô cơ thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Từ ñó thế hệ 2 tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh sôi các thế hệ tiếp theo. Thông thường trong cơ thể côn trùng, tuyến trùng có thể phát triển 2 ñến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng. Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: VKCS có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh ñể ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác côn trùng. Nhờ vậy mà chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của chúng. Như vậy có thể nói ñây là một trong những mô hình cộng sinh tuyệt vời và hoàn hảo giữa hai loài vi sinh vật trong tự nhiên. Mô hình cộng sinh này vừa chuyển hoá cao ñến mức sự tồn tại của loài này bắt buộc phải có sự hiện diện và cộng sinh của loài kia và ngược lại. 3.3.3. Vai trò của tổ hợp chống lại hệ thống bảo vệ của côn trùng Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 23 ðể phá huỷ cấu trúc ngăn trở các tác nhân gây bệnh hiệu quả cần phải chống lại cơ chế miễn dịch của côn trùng vật chủ. Một vài cách thức ñối phó với hệ miễn dịch ñó là: Sự kháng chịu với cơ chế bảo vệ của vật chủ, phá huỷ hệ thống nhận biết và phản ứng của vật chủ.( Akhurst & Dunphy, 1993) Trong trường hợp một số loài tuyến trùng và vi khuẩn không phải là cộng sinh của nhau thì chúng thường mẫn cảm với các cơ chế bảo vệ của côn trùng. Một trong những cơ chế của một số côn trùng hai cách có giai ñoạn ấu trùng sống trong môi trường nước là tao ra thể dịch tức thời bao bọc tuyến trùng trong một nang bọc polyphenol/protein (Dunphy & thurston, 1990). Tuy nhiên phản ứng nang bọc này cũng không bảo vệ ñược sự chết của Aedis spp. Và Culex restuans ngay cả khi tuyến trùng bị mang bọc do VKCS X. nematophilus ñược nhanh chóng giải phóng từ tuyến trùng trước khi bị mang bọc và vi khuẩn ñã kịp thời phát triển mà không ảnh hưởng bởi phản ứng bảo vệ - chúng ñã kịp sản sinh và giết chết vật chủ muỗi này (Welch & Bronkill,1962) Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các ñộc tố giết côn trùng Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và sản xuất các chất ñộc tố (toxin) ñể giết côn trùng bị nhiễm. Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp. Và Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội ñộc tố. Nội ñộc tố do X. poinarii sinh ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào các chất này gây ñộc ñối với huyết cầu (haemocytes) của côn trùng (Dunphy &Webster, 1988). Tuy nhiên hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ một mình nội ñộc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố nào khác nữa. Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép Xenorhabdus nhân nhanh số lượng và sản sinh ra ngoại ñộc tố (exotoxin), các ngoại ñộc tố ñược chứng Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 24 minh trong P. Luminescens (Bowen et,al,.1988,) X. Nematiphilus và X. Bovienii bằng cách tiêm các chất vào phù nổi của dịch nuôi cấy vi khuẩn vảo cơ thể côn trùng thì côn trùng chết nhanh chóng. Mặc dù các vi khuẩn này sản sinh ra các enzyme ngoài tế bào, các chất này ñược xem như proteases, phospholipase và lipases ở các vi khuẩn khác, các enzyme này chưa ñược chứng minh nhưng có tác nhân hoạt hoá trong việc gây ñộc của Xenorhabdus ñối với côn trùng. Tuy nhiên, Eisign et al.(1990) ñã ghi nhận ñược một protein ngoại bào ở X. Luminescens là hoạt ñôc tố cao khi tiêm vào ấu trùng tuổi 5 của Manduca sexta ñã giết chết trong 24 giờ. Bản chất và cơ chế tác dụng của ñộc tố này còn chưa ñược xác ñịnh rõ, nhưng chắc chắn ñộc tố này không phải là proteases cũng không phải là phospholipase. Vi khuẩn cộng sinh kích hoạt sự sinh sản của tuyến trùng Mặc dù các loài Steinernema spp, có thể ñược nhân nuôi ñơn giá thể (axenic - chỉ một mình tuyến trùng) bằng môi trường nhân tạo (in vitro), nhưng chắc chắn chúng không thể sinh sản trong cơ thể côn trùng mà không cần sự có mặt của vi khuẩn cộng sinh. Các thí nghiệm của Ponar & Thomas (1966) và Boemare et al (1983) ñã cho thấy khi cho nhiễm tuyến trùng S. carpocapsae sinh ra bằng sinh sản ñơn giản (axenic) vào cơ thể côn trùng vật chủ BSL thì tuyến trùng vẫn ñạt ñến tuổi trưởng thành nhưng không sinh sản ñược. Tuy nhiên, cũng tuyến trùng này nhưng cho nhiễm vào cơ thể côn trùng vật chủ BSL kết hợp cùng với một số loài vi khuẩn như Enterobacter aglomerans, Serratia liquefaciens, pseudomonas jlurescens hoặc VKCS của chúng, X .nematophilus thì tuyến trùng có thể sinh sản. Kết quả tương tự cũng ñạt ñược ñối với loài Steinernema khác như S. glaseri và S. feltiae. Mặt dù, về thực chất, VKCS không phải là yếu tố cần thiết cho sự sinh sản của tuyến trùng, nhưng nhìn chung chúng rất cần thiết ñối với các loài khác trong sinh Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 25 sản in vivo và in vitro.(boemare et al., 1983: Akhurst, 1983; Dunphy et al 1985; Han et al., 1990). 3.3.4. Cơ chế chống lại các vi sinh vật gây bệnh khác Có một cơ chế bảo vệ khác chống lại vi sinh vật ngoại ña góp phần làm cho hệ huyết tương của vật chủ sẽ không bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác khi tuyến trùng xâm nhập vào côn trùng vật chủ và giải phóng VKCS của chúng. ðiều này cũng có nghĩa là các huyết cầu của côn trùng vật chủ sẵn sàng phá huỷ các vi khuẩn nhiễm bệnh khác, trong ñó có các vi khuẩn bám trên bề mặt của tuyến trùng và theo tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu hoặc chúng cũng có thể xâm nhậm khi tuyến trùng ñâm thủng ruột côn trùng. Một khi huyết cầu bị phá huỷ bằng Xenorhabdus một cơ thể khác chống lại sự nhiễm thứ cấp của vi sinh vật từ ruột hoặc từ môi trường ñất vào xác chết côn trùng. Các loài Xenorhabdus spp. Có 2 cơ chế ñối với hoàn cảnh này: Các chất kháng sinh ngăn cản sự phát triển trên một phổ rộng của vi khuẩn và nấm ngoại biên xâm nhập (Dutky, 1974; Akhurst, 1982) và các chất baterioxin và các thực khuẩn bào (bacteriophages) ngăn cản các loài Xenorhabdus khác. Một số hợp chất kháng khuẩn ñược xác ñịnh từ Xenorhabdus spp. (Paul et al.,1981; Mclnerney et al,. 1990a,b). Mỗi một chủng VKCS sản xuất môt vài thành phần của một nhóm và ít nhất một chủng sản xuất hai nhóm kháng khuẩn này không duy trì trong ñiều kiện monoxenic trong xác chết côn trùng một cách vô hạn ñịnh, nhưng chúng thường giữ ñược hiệu lực trong pha giới hạn của sự sinh sản. Một số tác giả ñưa ra giả thuyết rằng hiện tượng hình quan sinh học do VKCS của tuyến trùng Heterorhabditis spp tạo ra ñã giúp xác chết côn trùng ñược bảo vệ trong môi trường ñất. Phản ứng tạo hình quang sinh học ñạt tới ñỉnh ñiểm trong khi tuyến trùng ñang sinh sản và có thể chống chọi với sự phá vỡ xác chết. Các Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 26 sinh vật hoại sinh sống ẩn trong ñất thường sợ ánh sáng và do ñó bị khước từ bởi xác chết huỳnh quang. 3.4. Sự di chuyển của tuyến trùng EPN Khả năng di chuyển của tuyến trùng ñược coi là chỉ tiêu cơ bản của tuyến trùng trong việc tuyển chọn các chủng có tiềm năng sử dụng trong PTSH sâu hại. Khả năng tồn tại cũng như khả năng tìm diệt côn trùng vật chủ trong môi trường tự nhiên. Một chủng tuyến trùng không có khả năng di chuyển tốt nếu ñược phun rải ñể phòng trừ sâu hại trong ñất thì chúng sẽ nhanh chóng bị khô, có thể bị chết và khả năng diệt các loài sâu hại trong ñất cũng bị hạn chế. Khả năng vận ñộng và di chuyển của tuyến trùng rất khác nhau phụ thuộc các chủng/loài tuyến trùng khác nhau. Trong môi trường tự nhiên, tuyến trùng di chuyển theo nhiều hướng, nhưng chúng thường ñịnh hướng theo phía côn trùng vật chủ. Hàng loạt các thử nghiệm ñã ñược tiến hành ñể nghiên cứu sự di chuyển chủ ñộng cũng như bị ñộng của tuyến trùng (Epsky & Capinera, 1988 ; kaya1990 Nguyen & smart, 1990). Còn sự di chuyển thụ ñông của EPN có thể do các yếu tố tự nhiên như mưa, gió, ñất, do con người hoặc do côn trùng vv…Sự di chuyển chủ ñộng của tuyến trùng chỉ có thể sẩy ra trong khoảng cách rất ngắn, có thể tính ñược 4 – 90cm từ vị trí ban ñầu, trong sự di chuyển thụ ñộng có thể tính ñến ñơn vị km (Smart & Nguyen, 1994). Nhìn chung, bình thường thì chỉ có một phần nhỏ tuyến trùng là di chuyển chủ ñộng, còn hầu hết là di chuyển thụ ñộng nhờ yếu tố môi trường. 3.5. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong côn trùng vật chủ Khả năng sinh sản của tuyến trùng là yếu tố quyết ñịnh ñến sản xuất sinh khối chế phẩm sinh học tuyến trùng. Một trong những ưu thế của tuyến trùng trong phòng trừ sâu hại là khả năng sinh sản của chúng rất cao và chúng có khả năng sản xuất sinh khối lớn bằng vật liệu côn trùng sống (in vivo) hoặc Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 27 bằng môi trường nhân tạo (in vitro). Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng vật chủ từ một vài IJs ban ñầu chúng có thể sinh sản qua một vài thế hệ làm tăng số lượng lên ñến hàng trăm ngàn cá thể. Một số thí nghiệm ở nước ngoài ñã xác ñịnh khă năng sinh sản của tuyến trùng S. feltiae trên một vật chủ BSL là 200 x 103 IJs và các loài H. bacteriophora là 350 x 103 IJs (Wouts, 1991). Tuy nhiên, sản lượng sinh sản trung bình của hầu hết các loài tuyến trùng khác thì lượng nhỏ hơn khá nhiều, khoảng 30 x 103 ñến 50 x 103 IJs của tuyến trùng từ một vật chủ ấu trùng BSL (Wouts, 1991). 3.5.1. Khả năng sinh sản của một chủng EPN trong BSL Sinh sản của Steinernema TK10 và Steinernema TX1 Thí nghiệm xác ñịnh khả năng sinh sản của các chủng tuyến trùng bản ñịa thông qua việc xác ñịnh thời gian phát tán của IJs và số lượng IJs thu ñược qua từng ngày của các chủng tuyến trùng cho thấy sự khác nhau khá lớn giữa 2 chủng tuyến trùng Steinerema và ñặc biệt giữa các chủng Steinernema so với các chủng Heterorhabditis. ðối với chủng tuyến trùng S-TK10, IJs phát tán ra trong khoảng thời gian rất ngắn chỉ trong 4 ngày. Số lượng thu ñược cao nhất trong ngày ñầu tiên là 15,2 x 103 IJs. Số lượng này giảm một nửa chỉ còn 7,4 x 103 IJs ở ngày thứ 2 và 4.4 x 103 ở ngày thứ 3. Cuối cùng kết thúc ở ngày thứ 4 và thu ñược thấp nhất ở ngày thứ 4 và thu ñược thấp nhất chỉ còn 1,9 x 103 IJs. Sự sinh sản của Heterorhabditis MP11 và Heterorhabdtitis NT3 Với chủng tuyến trùng H-MP11 thời gian phát tán ra ngoài xác chết BSL của IJs là 4 ngày, Bằng với thời gian phát tán của chủng tuyến trùng S- TK10. Tuy nhiên, số lượng IJs phát tán và thu ñược là khá lớn 53,3 x 103. ðến ngày thứ 2 tăng lên gấp 2 lần 82,4 x 103 IJs cao nhất trong 4 ngày. Sau ñó số lượng giảm xuống rất nhanh 19,1 x 103 ở ngày thứ 3 và kết thúc ở ngày thứ 4 thu ñược 7,0 x 103 IJs. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 28 Như vậy thời gian phát tán của chủng H-MP11 ngắn hơn và số lượng IJs thu ñược cũng tập trung hơn so với các chủng tuyến trùng Steinernema ở trên. Tính chất phát tán của IJs như vậy ñược coi như một ñặc tính ưu việt của các chủng heterorhabditis nói chung và H-MP11 nói riêng trong việc sản xuất tuyến trùng bằng nhân nuôi in vivo. Sự phát tán của IJs tập trung trong một thời gian ngắn không những tạo ra IJs tập trung trong một thời gian ngắn không những tạo ra IJs ñồng thời ñều về chất lượng mà còn cho phép xử lý bảo quản IJs tốt hơn. 3.5.2. Tương quan giữa số lượng nhiễm và sản lượng IJs Ngoài yếu tố sự mẫn cảm của côn trùng vật chủ ñối với chủng EPN, thì sản lượng IJs của một chủng EPN còn phụ thuộc khá lớn vào nồng ñộ IJs gây nhiễm ban ñầu của chủng ñó ñối với côn trùng vật chủ. Nói cách khác, sản lượng IJs của một chủng tuyến trùng luôn có tương quan chặt chẽ với nồng ñộ gây nhiễm ban ñầu. Số liệu thí nghiệm về sự tương quan giữa số lượng gây nhiễm ban ñầu và sản lượng IJs thu ñược ñối với chủng S- TK10 trên ấu trùng BSL cho thấy: Ở nồng ñộ gây nhiễm 10 IJs có sản lượng IJs thấp nhất là 12,1 x 103 IJs. Khi số lượng IJs gây nhiễm tăng lên thì sản lượng IJs cũng tăng lên và ñạt giá trị trung bình cao nhất là 34.4 x 103 IJs/BSL. Sản lượng cao nhất trong thí nghiệm này là 40.4 x 103 IJs ở công thức gây nhiễm ban ñầu 70 IJs. Vượt qua số lượng gây nhiễm này ở các công thức gây nhiễm cao hơn là 80, 90, 100IJs thì sản lượng IJs lại có xu hướng giảm dần và sản lượng trung bình chỉ ñạt 22.8 x 103 IJs ở số lượng gây nhiễm ban ñầu 100 IJs. Trong thí nghiệm với chủng S-TX1, với 10 công thức nồng ñộ gây nhiễm, thấp nhất 10 ñến cao nhất là 100 IJs cũng cho kết quả tương tự như thí nghiệm trên với chủng S-TK10. Ở công thức gây nhiễm với số lượng 10, 20, Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 29 30 IJs, thì sản lượng IJs chỉ ñạt từ 33.4 x 103 – 37,1 x 103 IJs/BSL. Ở các công thức gây nhiễm cao hơn, từ 40-70 IJs thì sản lượng thu ñược ñều cao hơn 50,0 x 103 IJs. Sản lượng cao nhất trong thí nghiệm này là 66,6 x 103 IJs / BSL. Khi số lượng IJs gây nhiễm ban ñầu tăng lên mức này thì sản lượng thu ñược có xu hướng giảm dần. Rõ ràng trong cùng một ñiều kiện thí nghiệm với các công thức số lượng gây nhiễm giống nhau, nhưng chủng S-TX1 có sản lượng IJs thu ñược từ một BSL cao hơn hẳn (gần gấp ñôi) so với sản lượng IJs của chủng S-TK10 trong thí nghiệm trên ñây, ðiều này cho thấy khả năng sinh sản của tuyến trùng EPN ngoài yếu tố côn trùng vật chủ và số lượng gây nhiễm ban ñầu thì yếu tố nội tại, tức là bản chất di truyền của mỗi EPN có ý nghĩa rất lớn. 3.5.3. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong sâu hại Khả năng sinh sản của một số chủng tuyến trùng bản ñịa Việt Nam còn ñược thí nghiệm trên ñối tượng sâu xanh (Helicopverpa armigera). ðây là ñối tượng hại khá phổ biến ñối với các vùng trồng thuốc là. Ấu trùng tuổi 3 ñến 5 của sâu xanh thuộc loại ñối tượng lớn, với sinh khối bằng hoặc lớn hơn so với ấu trùng BSL. Sinh sản của chủng D-TX1 trên sâu xanh Thí nghiệm ñánh giá khả năng sinh sản của chủng tuyến trùng của S- TX1 trên sâu xanh cho thấy ở số lượng ban ñầu 10 IJs, sản lượng IJs thu ñược chỉ là 28,0 x 103 IJs. Sau ñó sản lượng thu ñược tăng lên 36,7 x 103 IJs và 40,3 x 103 ở số lượng 20 và 30 IJs ban ñầu. Sản lượng thu ñược cao nhất là 83.3 x 103 IJs/sâu xanh ở số lượng 40 IJs ban ñầu. Số lượng IJs ban ñầu ñược tăng lên tiếp tục từ 50 ñến 100 IJs trong khi ñó sản lượng lại giảm dần từ 59,6 x 103 (50 IJs ban ñầu) xuống còn 41,3 x 103 (100 IJs ban ñầu). sinh sản của chủng H-MP11 trên sâu xanh Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 30 ðối với chủng H-MP11, khả năng sinh sản sâu xanh thực nghiệm cho thấy sản lượng IJs thu ñược trung bình 54,0 x 103 IJs ở số lượng gây nhiễm ban ñầu 10 IJs, tăng lên ñến 158,7 x 103 ở số lượng gây nhiễm 50 IJs. Sản lượng cao nhất là 293 x 103 IJs/sâu xanh. Trung bình cao nhất là 213,7 x 103 IJs/sâu xanh ở số lượng 80 IJs ban ñầu. Sau ñó ở số lượng gây nhiễm 100 IJs, sản lượng thu ñược lại giảm còn 168 x 103 IJs. Dựa trên số liệu thực nghiệm, qua phân tích hàm bậc hai, sản lượng của chủng H-MP11 trên sâu xanh se ñạt cao nhất ở số lượng gây nhiễm ban ñầu khoảng 110 IJs, các số lượng IJs khác càng xa giá trị tối ưu này sản lượng IJs sinh ra sẽ càng giảm ñi. Khả năng sinh sản tốt của tuyến trùng trên các loài sâu hại cũng cho biết tuyến trùng có thể nhân nuôi in vivo trên các loài sâu hại khác không phải là côn trùng mồi BSL. Ngoài ra nó còn cho thấy khả năng duy trì sự sinh trưởng phát triển cua tuyến trùng lần ñầu. ðây là một ưu thế của tuyến trùng khi sử dụng phòng trừ sâu hại ngoài thực tế, nó giúp cho hiệu quả phòng trừ sâu hại của tuyến trùng kéo dài có thể ñến 1 năm sau ñó (Mracek & Webster, 1993) Kết quả thử nghiệm ñánh giá khả năng sinh sản của 4 chủng tuyến trùng trên ñây trong cơ thể sâu xanh cũng gần giống với kết quả thử nghiệm về khả năng sinh sản của chủng trên BSL, chỉ khác là ở mức ñộ về sản lượng thu ñược ở ñều lớn hơn một cách tương ứng so với sản lượng thu ñược BSL do sinh khối của sâu xanh lớn hơn sinh khối của BSL. Kết quả này thêm một lần nữa cho thấy khả năng sinh sản của các chủng tuyến trùng bản ñịa là những chủng ñáp ứng về mặt ñộc tố cũng như sinh sản trong cơ thể vật chủ. ðây cũng là những tiêu chí quan trọng khi xem xét việc sử dụng một chủng tuyến trùng cho phòng trừ sâu hại ngoài ñồng ruộng. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 31 CHƯƠNG 4: CÔNG NGHỆ NHÂN NUÔI TUYẾN TRÙNG Ở Việt Nam Ngọc Châu là tác giả của nhiều công trình nghiên cứu và ñã sản xuất thành công chế phẩm EPN trừ sâu hại. Sau ñây là quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN của tác giả (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 4.1. Lựa chọn công nghệ thích hợp Hiện nay trên thế giới ñã phát triển 2 hệ thống công nghệ nhân nuôi sản xuất tuyến trùng là nhân nuôi in vivo và nhân nuôi in vitro hai công nghệ này khác nhau chủ yếu bởi nguồn vật liệu nhân nuôi: vật liệu tự nhiên và vất liệu nhân tạo. Nhân nuôi invivo trên cơ sở sử dụng vật liệu nhân nuôi là côn trùng sống. Một trong những nguồn công nghệ in vivo là ấu trùng tuổi 4 của BSL, một loại vật liệu có sẵn, dễ sản xuất và khá mẫn cảm với các chủng tuyến trùng EPN. Nhân nuôi in vitro trên cơ sở sử dụng nguồn vật liệu nhân nuôi nhân tạo. Trong công nghệ này có thể sử dụng hai loại môi trường, môi trường nhân nuôi ñăc biệt và môi trường lỏng sản xuất bởi vật liệu khác nhau. Môi trường nhân nuôi ñặc biệt sử dụng tạng ñộng vật làm vật liệu. Một số nội tạng như tim, thận, có thể ñể nguyên gây nhiễm không cần xoay nhuyễn chế biến thành bột nhão. Ngoài ra còn tận dụng cả gia cầm ñể chế biến thành dạng bột nhão gọi là chicken offal ñể nhân nuôi tuyến trùng. ðối với môi trường nhân nuôi lỏng thường ở dạng dung dịch ñược phối chế từ các vật liệu dạng lỏng chủ yếu là dầu ăn, dịch men, cholesterol và một số muối khoáng như: Nacl, Mgso4 , Cacl2 và KCl. Mỗi loại môi trường sử dụng các thiết bị nhân nuôi khác nhau: nhân nuôi in vivo chủ yếu sử dụng các ñĩa petri lớn. nhân nuôi in vitro ñược sử dụng các Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 32 thiết bị ño khác nhau: bình tam giác miệng