Khóa luận Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

tƣơng tự nhƣ 1 trình tự chèn. Các gene có thêm nằm ở giữa, 2 đầu là các trình tự lặp lại. Trong một số trƣờng hợp (các transposon ghép) các trình tự lặp lại ở hai đầu chính là các trình tự chèn. Tầm quan trọng: nhiều gene kháng kháng sinh nằm trên transposon. Vì transposon có thể nhảy từ phân tử DNA này tới phân tử DNA khác nên các transposon này là 1 yếu tố chính trong sự phát tán plasmid, đem đến tính kháng nhiều loại thuốc cho các vi khuẩn có chứa plasmid nhƣ vậy. Những plasmid kháng nhiều loại thuốc đang là 1 vấn đề y học lớn vì việc sử dụng bừa bãi thuốc kháng 13 sinh có thể đem đến 1 sự chọn lọc thuận lợi cho các loài vi khuẩn có chứa những plasmid này. Các transposon vi khuẩn phân biệt với nhau bằng mức độ hội nhập (intergration). Các phần tử Tn7, Tn9, IS4, IS5 có mức độ hội nhập cao. Các phần tử Tn10, IS1, IS2 có mức độ hội nhập trung bình. Các phần tử Tn2, Tn4, Tn5 và DNA phage Mu nói chung gắn vào các chỗ ngẫu nhiên của bộ gen. Tần số chuyển vị của các transposon vi khuẩn cũng biến đổi trong phạm vi rộng từ 10-7 – 10-4, ở các điều kiện khác nhau thì nó phụ thuộc vào độ dài của transposon. 2.2 Plasmid Plasmid là những phân tử DNA dạng vòng có khả năng sao chép và tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn. Hầu hết plasmid có chứa 1 hoặc nhiều gene mà những gene này thƣờng không thiết yếu cho sự sống của tế bào chủ nhƣng quy định cho những đặc điểm hữu ích, ví dụ nhƣ khả năng kháng kháng sinh. Ngƣời ta thƣờng dựa vào khả năng kháng kháng sinh nhƣ một marker chọn lọc để chắc rằng vi khuẩn nuôi cấy có chứa một plasmid cụ thể nào đó (Brown, 1995). Tất cả plasmid đều có chứa ít nhất một trình tự DNA đóng vai trò nhƣ một điểm khởi đầu sao chép, cho phép plasmid nhân lên độc lập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Về kích thƣớc, plasmid thay đổi từ nhỏ nhất là 1 kb đến lớn nhất là 250 kb, nhƣng chỉ những plasmid có kích thƣớc nhỏ hơn 10 kb mới thích hợp để sử dụng trong cloning. Về số bản sao, plasmid đƣợc chia thành nhóm plasmid có nhiều bản sao và nhóm có ít bản sao. Đối với plasmid có nhiều bản sao, có thể tìm thấy 20 đến 50 plasmid trong 1 tế bào. Loại plasmid này có 1 đặc điểm hữu ích là vẫn có thể nhân lên khi sự tổng hợp protein của tế bào ngừng lại. Đặc tính này đƣợc ứng dụng để tăng số lƣợng plasmid mà không cần tăng lƣợng tế bào chủ tạo thuận lợi cho quá trình ly trích plasmid. Khi canh khuẩn đạt đến nồng độ tế bào thích hợp, một tác nhân ức chế tổng hợp protein (ví dụ nhƣ chloramphenicol) đƣợc thêm vào, và canh khuẩn đƣợc ủ tiếp khoảng 12 tiếng nữa. Trong thời gian này, plasmid tiếp tục nhân 14 lên trong khi sự sao chép nhiễm sắc thể của tế bào chủ và sự phân chia tế bào bị khóa lại. Kết quả là số bản sao của plasmid có thể đạt đến hàng ngàn bản sao. Đối với plasmid có ít bản sao, sự sao chép xảy ra cùng lúc với sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Trong tế bào vi khuẩn có từ 1 – 3 bản sao plasmid nhƣ vậy. Kích thƣớc tối thiểu của nó 20 – 30 kb, còn tối đa thì lớn hơn một bậc. Khi ly trích plasmid có ít bản sao, muốn gia tăng lƣợng plasmid thì phải gia tăng lƣợng tế bào chủ. Plasmid đƣợc chia thành 2 nhóm: tiếp hợp và không tiếp hợp. Plasmid tiếp hợp có khả năng phát động sự tiếp hợp giới tính giữa các tế bào vi khuẩn, quá trình này dẫn đến kết quả là plasmid tiếp hợp đƣợc lan truyền từ 1 tế bào tới tất cả các tế bào khác trong canh khuẩn. Sự tiếp hợp và chuyển plasmid đƣợc kiểm soát bởi hệ thống chuyển hay các gene tra, mà chỉ có trong những plasmid tiếp hợp. Tuy nhiên, 1 plasmid không tiếp hợp, dƣới một số điều kiện thích hợp, có thể đƣợc truyền đi cùng với plasmid tiếp hợp khi cả hai cùng hiện diện trong 1 tế bào. Nhiều loại plasmid có thể đƣợc tìm thấy trong cùng 1 tế bào. Trên thực tế, những tế bào E.coli đƣợc biết là có thể chứa đến 7 loại plasmid khác nhau cùng lúc. Theo Mølbak (2003) để có thể cùng tồn tại trong 1 tế bào, những plasmid khác nhau phải liên kết với nhau. Nếu 2 plasmid không có khả năng liên kết với nhau thì khi đó 1 trong 2 sẽ nhanh chóng bị mất đi khỏi tế bào. Việc phân loại plasmid thông thƣờng dựa trên những đặc điểm chính đƣợc quy định bởi các gene của plasmid (Brown, 1995). Theo cách này, plasmid đƣợc chia thành 5 loại: (i) Fertility hay “F” plasmid: chỉ chứa các gene tra và không có đặc điểm gì ngoại trừ khả năng phát động sự truyền tiếp hợp của plasmid. Ví dụ nhƣ F plasmid của E.coli. (ii) Resistance hay “R” plasmid: có chứa những gene đem đến cho tế bào chủ tính kháng với 1 hoặc nhiều tác nhân kháng khuẩn, nhƣ là chloramphenicol, ampicillin và thủy ngân. R plasmid rất quan trọng trong vi sinh vật học lâm sàng bởi vì sự phát tán của chúng ra các quần thể tự nhiên có thể dẫn đến hậu quả nghiêm trọng trong việc chữa trị các bệnh nhiễm vi khuẩn. Ví dụ: RP4, thông thƣờng tìm thấy ở Pseudomonas, nhƣng cũng có thể xuất hiện ở nhiều loài vi 15 Hình 2.8: Cơ chế phƣơng pháp tiếp hợp 3 thành phần (Cameron, 2007). khuẩn khác. (iii) Col plasmid: mã hóa cho các colicin_là những protein có thể gây độc cho vi khuẩn khác. Ví dụ: ColE1 ở E.coli. (iv) Degradative plasmid: cho phép tế bào chủ tổng hợp những phân tử đặc biệt nhƣ toluene và acid salicylic. Ví dụ: TOL ở Pseudomonas putida. Và cuối cùng là Virulence plasmid: đem đến đặc tính gây bệnh cho tế bào chủ. Ví dụ: Ti plasmid ở Agrobacterium tumefaciens, gây bƣớu ở cây 2 lá mầm. 2.3 Các phƣơng pháp thƣờng dùng để chuyển DNA plasmid 2.3.1 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) Là phƣơng pháp chuyển gene từ thể cho sang thể nhận qua sự tiếp xúc trực tiếp giữa các tế bào và có sự trợ giúp của dòng vi khuẩn có plasmid hỗ trợ. 16 So với phƣơng pháp tiếp hợp thông thƣờng ở vi khuẩn thì phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần có thêm sự hiện diện của dòng vi khuẩn trợ giúp có chứa plasmid hỗ trợ. Vậy tại sao plasmid hỗ trợ lại cần thiết cho việc tiếp hợp? Theo Cameron (2007) hiệu quả chuyển gene sẽ tăng lên đáng kể khi có sự hiện diện của plasmid hỗ trợ vì nó có gene chuyển tra gene. Tra gene cung cấp nhiều chức năng tạo thuận lợi cho việc tiếp hợp nhƣ hình thành pili, duy trì sự tiếp xúc giữa các tế bào, làm duỗi DNA và làm đứt oriT (mob) để khởi đầu việc chuyển DNA mạch đơn vào thể nhận. Cameron (2007) còn cho rằng tiếp hợp ba thành phần là con đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng để đƣa DNA từ E.coli vào vi khuẩn vùng rễ. 2.3.2 Phƣơng pháp điện biến nạp Điện biến nạp là một phƣơng pháp hóa học sử dụng để đƣa những phân tử phân cực vào tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phƣơng pháp này, một xung điện lớn làm xáo trộn tạm thời lớp đôi phospholipid, cho phép những phân tử phân cực nhƣ DNA đi vào tế bào. Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử đòi hỏi các gene lạ hoặc vật liệu protein đƣợc chèn vào 1 tế bào chủ. Nhƣng thực hiện điều này không đơn giản vì lớp đôi phospholipid của màng nguyên sinh chất ngăn cản các phân tử phân cực nhƣ DNA và protein đi xuyên qua màng một cách tùy ý. Nhiều phƣơng pháp cho phép vƣợt qua rào cản này đã đƣợc nghiên cứu và phát triển. Điện biến nạp là một phƣơng pháp nhƣ vậy. Điện biến nạp lợi dụng những tƣơng tác ƣa nƣớc – kị nƣớc tƣơng đối yếu và khả năng tự liền lại của màng sau khi bị xáo trộn. Nhờ vậy, một shock điện áp nhanh có thể làm xáo trộn các vùng của màng một cách tạm thời, cho phép những phân tử phân cực đi qua, nhƣng sau đó màng có thể nhanh chóng đóng lại, tế bào vẫn còn nguyên vẹn. 2.3.2.1 Phƣơng pháp Trộn tế bào chủ và các phân tử muốn chèn vào trong dung dịch, cơ chế hoạt động của thiết bị điện biến nạp đƣợc trình bày dƣới dạng sơ đồ sau đây: 17 Khi công tắc đầu tiên đóng lại, tụ điện nạp điện và giữ một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng lại, điện áp này phóng điện qua dịch huyền phù tế bào. Điển hình nhƣ, cần một xung điện từ 10000 đến 100000 V/cm (thay đổi theo kích thƣớc tế bào) kéo dài từ một vài phần triệu giây tới một phần nghìn giây để thực hiện điện biến nạp. Xung điện này xáo trộn lớp đôi phospholipid của màng và hình thành nhiều lỗ trong một thời gian ngắn. Điện thế qua màng tế bào đồng thời tăng lên khoảng 0.5 - 1.0 V để những phân tử đƣợc tích điện (nhƣ DNA) băng qua màng qua các lỗ theo cách thức tƣơng tự nhƣ điện di. Khi các ion và phân tử tích điện chui qua lỗ, màng tế bào trung hòa điện tích, các lỗ nhanh chóng đóng lại, và lớp đôi phospholipid liền lại. Những phân tử mong muốn lúc này ở bên trong tế bào và có thể sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. Theo Smith (1989) điện biến nạp là phƣơng pháp rất phổ biến và có hiệu quả cao trong việc chuyển các phân tử DNA mục tiêu vào tế bào vi khuẩn. Hình 2.9: Cơ chế hoạt động của thiết bị điện biến nạp. 18 2.3.3 Phƣơng pháp Calcium chloride Phƣơng pháp này đƣợc phát triển từ hơn 30 năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5.106 đến 2.107 khuẩn lạc/μg plasmid DNA. Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp calcium chloride đƣợc trình bày dƣới dạng sơ đồ sau: 2.4 Thông thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hóa trị II nhƣ CaCl2, MgCl2, RbCl2. Việc biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0 – 4 0 C). Ion Ca 2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập vào dễ dàng hơn. Giai đoạn shock nhiệt kế tiếp sẽ kích thích sự chuyển DNA vào tế bào. Môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để tạo ra các protein tƣơng ứng. So với điện biến nạp, phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian hơn, hệ số biến nạp của tế bào sau khi xử lý thấp nhƣng đơn giản và dễ thực hiện (Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, 2005). Hình 2.10: Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp CaCl2. 19 2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học Theo Cook và Baker (1983), phòng trừ sinh học bệnh cây là sử dụng một hoặc nhiều loài sinh vật (ngoại trừ con ngƣời) để khống chế mầm bệnh hay làm giảm sự sinh trƣởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó. Đến năm 1988, Cook đã đƣa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh học. Theo ông, phòng trừ sinh học bệnh cây là sử dụng sinh vật, gene và các sản phẩm của gene để điều khiển tác nhân gây bệnh. Cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (i) duy trì nguồn bệnh ở mức thấp dƣới ngƣỡng gây hại, (ii) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (iii) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây. Các công trình nghiên cứu về tác nhân phòng trừ sinh học đƣợc công bố vào đầu thế kỉ 20 cho thấy vi khuẩn là một trong những tác nhân phòng trừ sinh học phổ biến và hiệu quả. Đây là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp. và Streptomyces (Burr và cộng sự, 1978; Weller và Cook, 1983). Vi khuẩn đóng vai trò là tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên quan hệ đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh cây. Tác động đối kháng có thể xảy ra bằng nhiều cơ chế nhƣ: cạnh tranh chỗ cƣ trú; cạnh tranh dinh dƣỡng, đặc biệt là việc cạnh tranh chất Fe bằng cách tạo ra các hợp chất siderophore. Trong môi trƣờng tự nhiên khi thiếu một chất dinh dƣỡng nào đó hay hàm lƣợng chất đó không đủ cung cấp vi sinh vật thì loại vi sinh vật nào có khả năng đồng hóa mạnh sẽ lấy đƣợc nhiều thức ăn và phát triển, còn loại yếu bị đói và có thể bị tiêu diệt. Cơ chế thứ ba là tiết chất kháng sinh và phân hóa tố: trong quá trình hoạt động sống, nhiều vi sinh vật có thể tiết ra bên ngoài các chất có tác dụng ức chế một hoặc nhiều loại vi sinh vật khác. Các chất này có thể là kháng sinh hay các phân hóa tố để phân giải tế bào vi sinh vật khác. Tác động đối kháng cũng có thể do cơ chế siêu kí sinh trên mầm bệnh hoặc kích thích sự tăng trƣởng của cây trồng: nhiều vi khuẩn đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cây trồng một cách gián tiếp bằng cách kích thích sự tăng trƣởng của cây nhờ đó cây kháng đƣợc mầm bệnh. 20 2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Trong số các loài Pseudomonas spp., P. fluorescens là đƣợc chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004). Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram (-), có đơn hoặc tùng mao, sống hiếu khí bắt buộc nhƣng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào. Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kì linh hoạt giúp chúng sống đƣợc cả trong đất và trong nƣớc. Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-300C. Chúng có trắc nghiệm dƣơng tính với oxidase. Một số dòng Pseudomonas fluorescens (chẳng hạn nhƣ CHAO hay Pf-5) có những đặc tính kiểm soát sinh học, giúp bảo vệ vùng rễ một số loài thực vật chống lại nấm kí sinh nhƣ Fusarium hay Pythium, cũng nhƣ một số loài nematode ăn thực vật. Đến nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết đƣợc chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết đƣợc đƣa ra nhƣ sau: thứ nhất ngƣời ta cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự. Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dƣỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ nhƣ tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe. Và cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn nhƣ các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide. 2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Pseudomonas 21 Loài: Pseudomonas fluorescens 2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Năm 1935, các nhà khoa học Liên Xô đã dùng một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas bón vào đất để chống lại nấm Sclerotonia và Botrylis bảo vệ nhiều loại cây trồng. Những chủng vi khuẩn vùng rễ trong đó có Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với Rhizoctonia solani, Sclerotium (corticium) rolfsii. Nguồn vi khuẩn này cũng đƣợc sử dụng trong phòng trừ sinh học hiệu quả đối với bệnh thối bẹ lá, bệnh thối thân đậu phộng, nâng cao sự phát triển cây trồng và tăng năng suất (Sakthivel và ctv, 1986). Mew và Rosales (1984) đã phân lập từ ngoài đồng hai loài vi khuẩn phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang trên môi trƣờng KB đối kháng với nấm Rhizoctonia solani. Gutter Son và ctv (1986) đã sử dụng dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong phòng trừ bệnh héo cây con trên cây bông. Sivamani và Gnanamanickam (1988) đã xử lý cây chuối con Musa balbisiana bằng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens trên bệnh héo rũ. Kết quả bệnh ít hơn, rễ cây phát triển tốt hơn và tăng chiều cao. Nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens có huỳnh quang và không có huỳnh quang phân lập từ rễ lúa ở miền Nam Ấn Độ đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani đƣợc thực hiện bởi Devi và ctv (1989). Voisard và ctv (1989) cho biết cyanide sản xuất bởi Pseudomonas fluorescens giúp ngăn chặn bệnh thối đen rễ thuốc lá. Lambert và ctv (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Serratia liquefacien và Bacillus sp. có hoạt tính chống nấm phổ rộng từ cây bắp, lúa mạch, và xà lách xoong. 22 Jee và Kim (1987) nghiên cứu sự đối kháng giữa vi khuẩn và nấm đối với mầm bệnh héo rũ dƣa leo. Những chủng chính đã đƣợc chọn lọc là P.fluorescens, P.putida và Seratia sp., nấm đối kháng thì có Giocladium sp., Trichoderma harzianum và Trichoderma viridae. Trong môi trƣờng agar lỏng, vi khuẩn đối kháng ức chế sự nảy mầm của bào tử Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium từ 26% - 45%, P.fluorescens là vi khuẩn có tính kìm hãm mạnh nhất. Theo Gnanamanickam và ctv (1992), những nhóm vi khuẩn đối kháng phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang đƣợc quan sát trong ống nghiệm có khả năng kìm hãm nấm Rhizoctonia solani vì chúng có gene chitinase làm phân hủy chitin trong vách tế bào sợi nấm. Nhiều dòng vi khuẩn có hiệu quả kìm hãm sự phát triển khuẩn ty, ảnh hƣởng đến sự sống của hạch nấm và bảo vệ cây lúa tránh đƣợc sự xâm nhiễm của nấm bệnh. Gogoi và Roy (1996) cho biết những dòng vi khuẩn phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang phân lập ở Philippine đƣợc đánh giá là kháng với mầm bệnh đốm vằn Rhizoctonia solani. Giữa 9 dòng có hiệu quả thì 5 dòng đƣợc biết là Pseudomonas fluorescens, 1 dòng là Enterobacter. Theo Rindran và Vidhyaekaran (1996) những nòi vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phát huỳnh quang phân lập từ vùng rễ cũng kìm hãm sự phát triển của Rhizoctonia solani. Một trong những dòng có hiệu quả nhất là PfAIR2, phân lập trên than bùn đƣợc dùng để xử lý hạt, xử lý rễ, rải vào đất và phun lên lá. Mukhopadhyay và ctv (1996) cho biết khi phân lập từ mạ lúa đƣợc trồng từ hạt giống có khử trùng bề mặt, ngƣời ta tìm thấy 3 nòi hiện diện trên vỏ trấu hạt lúa là Bacillus spp., Pseudomonas fluorescens và Enterobacter. Sử dụng P.cepacia làm giảm bệnh mốc xanh sau thu hoạch do Penicillium digitatum trên trái chanh tới 80% so với không chủng (Smilanick và Ricardodenis- arrue, 1992). Tác động đối kháng của vi khuẩn đƣợc xác nhận do chất kháng khuẩn pyrrolnitrin. 23 Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vải do nấm P.carolinianum ở Ai Cập đƣợc kiểm soát bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng P.fluorescens. Vi khuẩn đối kháng cao với nấm trong thí nghiệm trên đĩa petri và hạn chế đƣợc bệnh khi áp dụng trong đất. Hiệu quả kiểm soát khi trộn vi khuẩn vào đất cao hơn khi chủng vi khuẩn vào vùng rễ cây con trƣớc khi đem trồng. Tác động đối kháng là do cạnh tranh về dinh dƣỡng, siderophores, những chất có khả năng kháng khuẩn-HCN. Theo Notz và ctv (2001), sự hình thành 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4- DAPG) là quan trọng cho tính đối kháng của Pseudomonas fluorescens. Giống cây kí chủ có ảnh hƣởng nhất định tới mức độ tạo thành 2,4-DAPG. Pseudomonas fluorescens tạo ra 2,4-DAPG chống lại bệnh chết cây con do nấm trong đất và hạn chế bệnh chết cây do nấm Gaeumannomyces graminis var. tritici (Mavrodi và ctv, 2001). Hợp chất này đƣợc kiểm soát bởi gene phlD, một gene rất biến đổi về cấu trúc hóa học. Những nghiên cứu ở mức độ phân tử chỉ ra rằng phlD là một marker phân tử quan trọng để nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn tạo ra 2,4-DAPG. Hợp chất DAPG đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh chết cây con và bệnh hại rễ của nhiều loại cây trồng. Ví dụ, dòng CHAO hạn chế bệnh thối đen rễ thuốc lá, chết cây lúa mì, thối rễ cà chua, dòng f113 hạn chế bệnh chết cây con củ cải đƣờng. Kell (1992) chia vi khuẩn Pseudomonas thành hai nhóm dựa trên số hợp chất kháng khuẩn tạo ra. Nhóm 1 gồm những dòng vi khuẩn phân lập từ thuốc lá, cà chua, dƣa chuột, bông vải tạo ra DAPG, HCN, pyoluteprin. Nhóm thứ 2 gồm vi khuẩn tạo DAPG, HCN. Theo Gardener và ctv (2000) gene phlD mã hóa polyketide synthase tạo monacetylphloroglucinol và chuyển hóa tiếp thành 2,4-DAPG. Một phần lớn ORF của gene này đƣợc phân lập và phân tích cấu trúc. Sử dụng primer B2BF và BPR4 có thể xác định chính xác vi khuẩn đối kháng sản sinh ra hợp chất 2,4-DAPG. 24 Năm 1997, Bloemberg và ctv đã sử dụng green fluorescent protein nhƣ một marker để nghiên cứu sự phân bố, hình thành tập đoàn và hoạt tính trao đổi chất của vi khuẩn Pseudomonas. 2.6 Protein GFP 2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm GFP (Green Fluoescent Protein): là loại protein lần đầu tiên đƣợc tìm thấy vào năm 1974 nhƣ một hợp chất phát sáng – aequorin – có ở loài sứa jellyish Aequorea victoria sống ở vùng nƣớc lạnh biển bắc Thái Bình Dƣơng . Là một hexapeptide có trọng lƣợng phân tử 27 kDa, cấu tạo từ 238 aa, với đặc tính đặc biệt là tại trung tâm hoạt động của nó có sự tự động đóng vòng của 3 aa Serine 65 – Tyrosine66 – Glycine67 (Serine có thể thay thế bằng Threonine). Khi chuỗi protein gấp lại đoạn nhỏ Ser – Tyr – Gly này đƣợc chôn sâu vào bên trong lúc này có nhiều phản ứng hóa học xẩy ra. Glycine hình thành liên kết với Serine xảy ra phản ứng khử hydro tạo liên kết đôi hình thành một vòng mới với Tyrosine, nhƣng tại sao Glycine lại hình thành liên kết với Serine tạo vòng 5 cạnh là điều mà chƣa ai biết. Hydro đƣợc phóng thích kết hợp với oxy trong môi trƣờng tạo phân tử nƣớc (do đó vi sinh vật chuyển gene gfp phải nuôi cấy trong môi trƣờng hiếu khí). Chính sự chen lấn của phân tử nƣớc đã hấp thu năng lƣợng của protein ngay khi nó hấp thụ photon ánh sáng, do đó phát lại cũng dƣới dạng ánh sáng ở mức năng lƣợng Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP (Đỗ Thị Ngọc Hân, 2006). 25 thấp hơn. Chuỗi protein có cấu trúc hình trụ mà bộ 3 Ser – Tyr – Gly nằm ở phần lõi bên trong làm cho đặc tính này của protein rất bền. Với đặc tính nổi bật nhƣ trên, gần đây gene gfp rất đƣợc quan tâm sử dụng nhƣ hệ thống marker gene, reporter gene cho những vi sinh vật biến đổi gene. Vì tính dễ phát hiện chỉ cần quan sát dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang (epifluorescence microscopy), kính hiển vi tiêu cự laze (laser confocal microscopy), máy đếm tế bào (flow cytometry) và máy quang phổ đo huỳnh quang (spectrofluorimetry); tính ổn định cao, tồn tại lâu trong vi sinh vật không dễ mất đi nhƣ gene kháng kháng sinh; không cần co-enzyme nhƣ các hệ thống phát màu, phát ánh sáng hay phát huỳnh quang khác (Thí dụ nhƣ gene lux ở prokaryote hay gene luc ở eukaryote mã hóa cho sự hoạt động của enzyme luciferase cần các co-enzyme NADH cho luc hoặc FMNH2 cho lux mà các co-enzyme này thì phụ thuộc nhiều vào năng lƣợng dự trữ của tế bào vi sinh vật), gene gfp xuất phát từ loài cá nên không có sẵn trong hê thống gene của vi sinh vật nhƣ gene kháng kháng sinh, hay gene lux … nên không xẩy ra phản ứng dƣơng tính giả khi kiểm tra. Ngoài ra với đặc tính dễ quan sát, độ chính xác cao, không phá hủy tế bào, không gây độc cho tế bào và có thể kiểm tra từng tế bào chỉ có 1 bản sao, ngƣời ta dùng marker gfp để quan sát quá trình hoạt động bên trong khi vi sinh vật xâm nhập vào kí chủ. Thí dụ nhƣ quan sát Agrobacterium, Rhizobium khi chúng kí sinh vào rễ cây, quan sát sự hình thành khuẩn lạc, mật độ tế bào qua các phase cũng nhƣ cƣờng độ phát sáng. 2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp Sử dụng gene gfp nhƣ một loại marker dùng kiểm tra sự sống sót của vi khuẩn Pseudomonas sp. UG14Gr có khả năng khoáng hóa phenanthrene trong đất nhiễm creosote (Deena Errampalli, 1998), gene gfp nhƣ một lọai marker dễ nhìn thấy để kiểm soát vi khuẩn tổng hợp acid lactic trong hệ sinh thái phức tạp (Karen P. Scott, 1998), gene gfp nhƣ hệ thống marker và reporter trong vi khuẩn Helicobacter sp. (Christine Josenhans, 1998), gene gfp nhƣ một reporter biểu hiện 26 gene, một marker sống nghiên cứu nấm Phytophthora parasitica kháng nicotianae gây bệnh trên cây thuốc lá (Arnaud Bottin, 1998) Yeoung-Seuk Bae và Guy R. Knudsen (1999) sử dụng Polyethylene-glycol đồng biến nạp gene tổng hợp β-Glucuronidase (GUS) và gene tổng hợp GFP (Fluorescent Protein Genes ) vào nấm Trichoderma harzianum đế kiểm soát sự tăng trƣởng và họat động của nấm trong đất. Còn Pieter van West và cộng sự (1999) sử dụng phƣơng pháp biến nạp dựa trên CaCl2 và PEG (Polyethylene-glycol) chuyển gene gfp và gene gus nhƣ một reporter gene nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên thực vật. Ảnh hƣởng của tình trạng thiếu dinh dƣỡng (Starvation), tình trạng sống nhƣng không có khả năng tăng sinh (Viable-but-Nonculturable State ) đến khả năng phát sáng của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens A506 đánh dấu bởi gene gfp đã đƣợc M. Lowder và cộng sự (2000) nghiên cứu. Janus A.J. và cộng sự (2002) kiểm tra tại chổ (In situ detection ) việc chuyển gene theo chiều ngang của các yếu tố di truyền di động bằng cách xây dựng tổ hợp gene reporter gfp và promoter lac chuyển vào vi khuẩn. GFP phát ra những bƣớc sóng màu khác nhau cho phép xác định hoạt động tăng trƣởng, vị trí tế bào cho, tế bào nhận. Còn R. Bhatia (2002) thì xây dựng marker gfp vào vi khuẩn Bradyrhizobium cho những nghiên cứu sinh thái về sự cạnh tranh, sống sót trên đất, trên môi trƣờng chứa than đá. Năm 2003, Johan Goris đã nghiên cứu sự đa dạng của những vi khuẩn hoạt động ở cống rãnh dựa trên plasmid pC1-gfp làm giảm khả năng sản xuất 3-chloroaniline. Năm 2004, Tina S. Boldt đã nghiên cứu nhiều hệ thống reporter gfp khác nhau để kiểm soát hoạt động vi khuẩn Pseudomonas fluorescens F113 định cƣ trên rễ cây linh lăng phát triển qua nhiều giai đoạn tăng trƣởng không phụ thuộc vào sự suy thoái 3-chlorobiphenyl. Trong năm đó Gejiao Wang và cộng sự sử dụng Real- time PCR để định lƣợng dòng Pseudomonas putida đánh dấu gfp trong quá trình suy giảm 2-chlorobenzoate trong đất. Đến Ninwe Maraha và cộng sự thì kiểm soát tình trạng sinh lý của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens SBW25 đánh