Khóa luận Tổng quan về Clostridium botulinum và độc tố butulin

nella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid permeability facto viết tắt là RPF) và độc tố thẩm xuất chậm (Delayed permeability facto viết tắt là DPF). - Độc tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của E.coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella (Heat Stable Toxin -viết tắt là ST). ST có khả năng chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗi polypeptide. Độc tố thẩm xuất nhanh kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch, phá huỷ tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và phát triển tăng nhanh về số lượng. Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố làm rối loạn cân bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải. Quá trình bệnh lý đường ruột và hội chứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng. - Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E.coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella (Heat Lable Toxin -viết tắt là LT). Nó thực hiện chức năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ. LT bị phá huỷ ở 700C trong vòng 30 phút và ở 560C trong vòng 4 giờ. LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid. Độc tố thẩm xuất chậm làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hoá lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy. * Độc tố tế bào: Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất nước và mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ hoặc bị tổn thương ở các mức độ khác nhau. Sự phá huỷ hay tổn thương đó là do độc tố tế bào của Salmonella gây nên, theo cơ chế chung là: Ức chế tổng hợp prôtein của tế bào Eukaryotic và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). Theo Clarke và các cộng sự, có ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào: - Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Dạng này được phát hiện ở rất nhiều serova Salmonella, có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 56 - 78kDa, không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Shigellatoxin hoặc Shigella - like. Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào. - Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn có cấu trúc và chức năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng Entero Toxigennic E.coli (ETEC) sản sinh ra. Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh. - Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa, có liên hệ với độc tố hemolysin. Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với các Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào. Tóm lại, là một vi khuẩn sống cộng sinh trong đường tiêu hoá, Salmonella chứa đựng rất nhiều các yếu tố gây bệnh là độc tố và các yếu tố gây bệnh không phải là độc tố, do vậy nó là tác nhân gây bệnh thường trực cho con người và gia súc. 2.1.5.4. Khả năng gây bệnh Thức ăn phải bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn vì khả năng gây ngộ độc của Salmonella yếu. Vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn. Vấn đề này phụ thuộc nhiều vào phản ứng cơ thể của từng người. Ðiều này giải thích hiện tượng nhiều người cùng ăn một loại thức ăn như nhau nhưng có người bị ngộ độc có người không bị, có người bị nhẹ, có người bị nặng... Thông thường thì những người già, người yếu và trẻ em nhỏ bao giờ cũng bị nặng hơn. Salmonella theo thức ăn vào đường tiêu hóa và phát triển. Một số khác đi vào hệ bạch huyết và tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết. Vì Salmonella là vi khuẩn ưa môi trường ruột nên nhanh chóng trở về ruột gây viêm ruột. Nội độc tố sẽ được thoát ra khi vi khuẩn bị phân hủy trong máu cũng như ở ruột, gây nhiễm độc cấp bằng một hội chứng loạn tiêu hóa nặng, nhưng chỉ sau 1 - 2 ngày bệnh nhân nhanh chóng trở lại bình thường, không để lại di chứng. 2.1.5.5. Các thực phẩm liên quan Thức ăn gây ngộ độc thường là thức ăn có nguồn gốc động vật như thịt gia súc gia cầm. Thịt là nguyên nhân gây ngộ độc chính ngoài ra có thể ngộ độc do ăn trứng, cá, sữa... nhưng tỉ lệ ít hơn nhiều. Thực phẩm gây ngộ độc thức ăn thường có độ ẩm cao, pH không axít, đặc biệt là thức ăn đã nấu chín dùng làm thức ăn nguội như món đông, pate, xúc xích, dồi tiết... 2.1.5.6. Biện pháp phòng ngừa và điều trị Phòng ngừa: Bảo đảm thời hạn cất giữ thức ăn đã chế biến và các nguyên liệu. Sử dụng ướp lạnh khi bảo quản thức ăn và nguyên liệu. Ðun sôi thức ăn trước khi ăn là biện pháp phòng bệnh tích cực và có hiệu quả. Ðiều trị: Không có thuốc điều trị đặc hiệu và phải nhanh chóng tìm mọi cách để đưa thức ăn bị nhiễm trùng ra khỏi cơ thể bệnh nhân như rửa dạ dày, gây nôn... Nếu bệnh nhân bị mất nước nhiều thì phải truyền nước và điện giải. Người bệnh phải được ủ ấm và yên tĩnh, ăn uống theo chế độ ăn kiêng đặc biệt trong 3-5 ngày cho đến khi bệnh nhân trở lại bình thường. 2.2. Giới thiệu về Clostridium botulinum 2.2.1. Lịch sử phát hiện Vào năm 1895, Emile Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện ngộ độc botulin ở dăm bông và ruột già của người bị chết do ngộ độc thịt. Hình 2.12: Emile Van Ermengem. Đến năm 1896, Emile Van Ermengem tìm ra mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn Clostridium botulinum), một loại sống kị khí, có nha bào, rất khó bị tiêu diệt. Sau này, các tác nhà khoa học khác còn thấy chúng trong đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người. Chúng có chất độc botulin, làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong cao (70%). Chúng có nhiều loại A, B, C, D, E nhưng loại A, B, E cho độc tố mạnh nhất. Nhưng sau đó những bằng chứng về kiểu hình và kiểu gen đáng kể tồn tại để chứng minh tính không đồng nhất trong các loài. Điều này đã dẫn đến việc phân loại lại của Clostridium botulinum loại G giống như là một loài. Năm 2003 bộ gen của Clostridium botulinum được công bố (công trình của viện Sanger với Tiến sĩ Roger Huston và Tiến sĩ M. Peck). 2.2.2. Phân loại Hình 2.13: Vi khuẩn Closridium botulinum. Phân loại Closridium botulinum: Ngành: Firmicutes. Lớp: Clostridia. Bộ: Clostridiales. Họ: Clostridiaceae . Chi: Clostridium Clostridium botulinum gồm có 7 chủng tùy thuộc vào loại độc tố A, B, C, D, E, F, G. Khi phát triển trên thực phẩm, Clostridium botulinum tiết các loại độc tố gây ngộ độc và nguy hiểm, gây chết người do tác động lên hệ thống thần kinh. Trong số này các loại A, B, E và F gây bệnh ở người.Types C and D cause disease in animals. Các loại C và D gây bệnh ở động vật.Type G has not yet been confirmed to cause illness in humans or animals.8, 4 Type A is the most potent toxin known and an estimated dose of this toxin required to cause death in humans vary between 0.1 to 1.0 micrograms. Loại G chưa được xác nhận để gây bệnh ở người hay động vật. 2.2.3. Đặc điểm 2.2.3.1. Đặc điểm chung Clostridium botulinum là vi khuẩn kỵ khí có thể di động da dạng, tồn tại ở trong đất, phân động vật, ruột cá. Chúng là vi khuẩn sinh độc tố botulin là nguyên nhân gây tê liệt cơ, phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 26-280C, sinh khí hydro sulfur (H2S) và sinh hơi. Có đặc điểm chung về kiểu hình là hình thành những nội bào tử nhiệt và kháng cự hóa học, sự hiện diện của gram dương trong cơ cấu các tế bào sinh dưỡng, có sự trao đổi chất kỵ khí làm lên men. Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum chủ yếu là đặc trưng bởi khả năng sản xuất độc tố ngoại bào protein nhiều hơn bất kỳ nhóm vi khuẩn nào khác. 2.2.3.2 Đặc điểm nuôi cấy/sinh hóa Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum không thể phát triển ở pH acid thấp hơn 4,5. Nồng độ muối trên 1% có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. Clostridium botulinum không thể sử dụng lactose như một nguồn carbon chính. Clostridium botulinum cũng có thể được chia thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc điểm sinh hóa và sinh lý. Những nhóm này bao gồm: Nhóm I – nhóm này bao gồm: - Chủng độc tố loại A. - Những biến dạng thủy phân protein của độc tố loại B và F. - Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh hơi cong với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt cao, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là 0,94 - 4,6. Nhóm II – nhóm này bao gồm: - Chủng độc tố loại E. - Những biến dạng không thủy phân protein nhưng phân giải đường của độc tố loại B và F. Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông rung rải rác, là nhóm ưa lạnh nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 18 – 250C, sản xuất bào tử với khả năng chịu nhiệt thấp, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là 0,97 - 5. Nhóm III – nhóm này bao gồm: - Chủng độc tố loại C và D. - Những sự biến dạng nói chung là không có thủy phân protein. Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết. Nhóm VI – nhóm này bao gồm: thủy phân protein của chủng độc tố loại G. Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết. 2.2.4. Cấu trúc của Clostridium botulinum 2.2.4.1. Cấu trúc tế bào Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương (+),kích thước khoảng 0,3 – 0,7µm × 3,5 – 7,0 µm, không có có roi. Sinh bào tử, bào tử thường to hơn chiều ngang của tế bào. a. Thành tế bào  Thành tế bào giúp duy trì hình thái của tế bào, giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể. Bảng 2.1: Thành phần của vi khuẩn gam (+). Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của tế bào Peptidoglycan 30-95 Acid teicoic (Teichoic acid) Cao Lipid Hầu như không có Protein Không có hoặc có ít b. Màng sinh chất Màng sinh chất vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid, chiếm 30-40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong, ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60-70% khối lượng của màng. Đầu phosphat của PL tích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ nước. Có các chức năng chủ yếu sau đây: - Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất - Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào. - Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của bao nhày (capsule). - Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng) - Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp. Hình 2.14: Cấu trúc của đầu và đuôi của phospholipid. c. Tế bào chất Là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước. Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp. Bào quan đáng lưu ý trong tế bào chất là ribosom. Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của tế bào chất, gồm 2 tiểu phần (50S và 30S) kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S (S là đơn vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng khi ly tâm cao tốc). Hình 2.15: Ribosom ở vi khuẩn. Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạt glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt dị nhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh... d. Thể nhân Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là 1 nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép e. Bao nhầy Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid và protein. Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic... Ý nghĩa sinh học của bao nhầy là: - Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn. - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn. - Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...). - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể. 2.2.5. Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum Clostridium botulinum sẽ tiết ra một độc tố sinh học mạnh ức chế sự phóng thích hoạt động của các bó cơ, tác động đến nơi tiếp hợp cholinergic qua trung gian Calcium vào khe synape làm mất khả năng chi phối hóa học tại chổ và mất hoạt động thần kinh của sợi nơron vận động trong thoi cơ. Hoạt chất này tác động tại nơi tiếp hợp thần kinh cơ nên ngăn cản sự phóng thích acetylcholine và gây ra liệt. Độc tố của Clostridium botulinum tác dụng qua 3 giai đoạn: Kết nối, thâm nhập, ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh. Độc tố này không ảnh hưởng vào sự tổng hợp hay dự trữ acetylcholine nhưng ảnh hưởng vào sự phóng thích chất này ở sợi tận cùng tiền tiếp hợp. Hình 2.16: Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum. 2.2.6. Bệnh và các triệu chứng Nguồn lây bệnh: Các thực phẩm dễ bị nhiễm Clostridium botulinum thường là rau quả ướp muối, hoặc chế biến mứt tại gia đình, các bán thành phẩm từ thịt, cá hoặc một vài đồ hộp không đảm bảo yêu cầu vệ sinh khi chế biến và khử khuẩn. Biểu hiện bệnh: Thời kỳ ủ bệnh thường là 12 - 36 giờ nhưng cũng có thể từ 2 giờ đến 8 ngày với các triệu chứng đau bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt, khó nuốt, khó thở... nếu bệnh kéo dài từ 4 - 8 ngày tỷ lệ tử vong tới 60%-70%. Ngộ độc Clostridium botulinum còn phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như yếu tố môi trường, đặc tính thực phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt và ăn uống của cá nhân mà nguồn thực phẩm gây ngộ độc cũng khác nhau. Ở Nga, ngộ độc chủ yếu do cá, ở Mỹ do đồ hộp rau quả, ở Đức do ăn các thức ăn làm bằng thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc xích... Các triệu chứng: bệnh xuất hiện với các dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là liệt thần kinh do tổn thương thần kinh trung ương và hành tủy. Triệu chứng sớm nhất là liệt mắt, cơ mắt, có biểu hiện song thị như nhìn một hóa hai; bị liệt vòm họng, lưỡi, yết hầu biểu hiện rối loạn lời nói rồi mất tiếng, mất phản xạ nuốt; bị liệt dạ dày, ruột dẫn đến táo bón, chướng bụng, giảm sự tiết dịch,... Bệnh nhân có thể không sốt nhưng mạch nhanh, mạch có thể tăng nhanh nhưng nhiệt độ cơ thể vẫn bình thường, có hiện tượng mạch-nhiệt phân ly. Các loại thực phẩm nhiễm Clostidium botulinum: phát hiện trong đồ hộp (thịt, cá, patê, xúc xích, rau quả...), lạp xưởng, thịt đùi lợn, cá ướp muối hoặc phơi khô rồi xông khói... thức ăn chế biến sẵn và mật ong. Thực phẩm nhiễm Clostridium botulinum rất khó nhận biết bằng cảm quan, chỉ nhận biết được sau khi sử dụng qua những dấu hiệu lâm sàng. 2.3. Độc tố botulin (BT) của vi khuẩn Clostridium botulinum 2.2.7.1. Cấu trúc độc tố botulin Độc tố botulin là một hỗn hợp phức tạp của các protein có chứa phân nữa chất độc thần kinh botulin gắn với phân nữa các protein khác không độc hại. Độc tố thần kinh botulin tồn tại trong bảy típ huyết thanh khác nhau A, B, C, D, E, F, G. Nó được tổng hợp ở dạng không hoạt động như là một chuỗi polypeptide duy nhất với trọng lượng phân tử của khoảng 150 kiloDalton (KD). Cơ chế hoạt động là phân cắt thủy phân protein để tạo thành một cấu trúc dichain, một hình thức hoạt động của độc tố. Cấu trúc dichain bao gồm một chuỗi nặng 100 KD và một chuỗi nhẹ 50 KD được liên kết bởi một liên kết disulfua có gắn với 1 phân tử Zn. Chuỗi nặng gồm một đầu chứa amino – 50 KD (miền này được gọi là miền di dời (HN) ) và một đầu chứa carboxy – 50 KD (miền này được gọi là miền ràng buộc (HC) ). Chuỗi nhẹ gồm một miền tiếp xúc (LC) 50KD hoạt động phân hủy enzyem trên chất nền tế bào thần kinh. Chuỗi nhẹ Chuỗi nặng Vi trí mối nối Hình 2.17: Cấu trúc độc tố botulin. 2.2.7.2. Yếu tố tạo nên độc tố botulin của Clostridium botulinum Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của Clostidium botulinum trong thực phẩm là: nhiệt độ, độ chua, hoạt động nước, thế cộng hưởng, thành phần dinh dưỡng, chất bảo quản thực phẩm, và vi sinh vật cạnh tranh. a. Nhiệt độ Clostidium botulinum chủng nhóm I đòi hỏi nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu là 10oC, trong khi chủng nhóm II có thể phát triển ở nhiệt độ thấp tới 3,3oC, các giới hạn nhiệt độ cho nhóm I và nhóm II là 45 đến 50oC và 40 đến 45oC nhưng nếu làm lạnh ở nhiệt độ trên thì có thể ức chế tối thiểu vi khuẩn Clostidium botulinum gây bệnh trong thực phẩm. Tuy nhiên, Clostidium botulinum phát triển và hình thành độc tố có thể xảy ra do lạm dụng nhiệt độ trong các cửa hàng lương thực, cơ sở dịch vụ thực phẩm, trong quá trình phân phối, hoặc bởi người tiêu dùng. Chính vì vậy, việc xử lý nhiệt độ thấp để ngăn cản sự tăng trưởng Clostidium botulinum gây bệnh trong thực phẩm đã được khuyến cáo. b. Độ chua Clostidium botulinum đòi hỏi pH tối thiểu là 4,6 cho sự tăng trưởng, nếu dưới thì bào tử của các tế bào sinh dưỡng sẽ không xảy ra nảy mầm. Nếu thực phẩm có giá trị pH nhỏ hơn 4,6 (thực phẩm acid cao) được coi là an toàn. Tuy nhiên, một số protein thực phẩm, chẳng hạn như đậu nành và thịt bò có thể có tác dụng bảo vệ Clostidium botulinum tại hoặc dưới pH 4,6. Ngược lại, những sản phẩm có giá trị pH cao hơn 4,6 sẽ tạo điều khiện thuận lợi cho sự phát triển mầm bệnh và tiết độc tố. Do đó, những thực phẩm này yêu cầu các phương pháp bảo quản chế biến phù hợp để ngăn chặn sự tồn tại hoặc tăng trưởng của Clostidium botulinum. c. Hoạt độ nước (aw) Clostidium botulinum yêu cầu phải có tối thiểu là 0,94 aw cho sự phát triển và tiết độc tố. Aw thấp ức chế sự tăng trưởng của mầm bệnh và chủ yếu đạt được bằng việc bổ sung các muối clorua natri (NaCl). Các giá trị mước muối thường được sử dụng để ngâm vi khuẩn ở nhóm I và II tương ứng là 5 – 10%, nồng độ sucrose cao từ 15 – 30% cũng có thể ngăn chặn hai nhóm này. Tương tự như vậy, những chất tan khác như glycerol, polyme hữu cơ và các ion kali có thể liên kết với nước tự do giúp giảm bớt aw, nhưng hiệu quả của chúng trên tổng thể aw cần phải được trình bày rõ ràng và điều tra cẩn thận trước khi thực hiện bất kỳ sự thay đổi nào trong thực phẩm. d. Thế cộng hưởng (Eh) Clostidium botulinum là một vi khuẩn kỵ khí chính vì vậy việc kiểm soát Eh là cần thiết cho các bào tử của các tế bào sinh dưỡng nảy mầm và phát triển. Các Eh tối ưu cho sự tăng trưởng thấp của vi khuẩn là khoảng -350 millivolts (mV). Tuy nhiên, bào tử nảy mầm và tiết chất độc đã được quan sát ở mức Eh cao hơn khoảng 200 - 250 mV. Điều này cho phép sự phát triển mầm bệnh và tiết độc tố ngay cả trong các sản phẩm đó được xem là có mức độ oxy cao. Sự có mặt của khí carbon dioxide có thể tăng cường sự nảy mầm của bào tử. Tuy nhiên, nguy cơ an toàn phụ thuộc không chỉ trên môi trường khí mà còn trên những đặc tính sản phẩm, nhiệt độ lưu trữ, loại bào bì đóng gói, những vi khuẩn cạnh tranh. e. Thành phần dinh dưỡng Clostidium botulinum có những yêu cầu tối thiểu về chất dinh dưỡng. Một số chất dinh dưỡng được yêu cầu với số lượng cao cho sự tăng trưởng của mầm bệnh, chẳng hạn như arginine cho chủng nhóm I và tryptophan cho các chủng loại E, tất cả các nhóm ngoại trừ nhóm IV sử dụng glucose như một nguồn carbon chính. Khả năng lên men carbohydrates (fructose, maltose, sucrose, và sorbitol) và khả năng phân hủy protein khác nhau giữa các nhóm. Ví dụ như các chủng thuộc nhóm I là protelytic, chúng thủy phân protein sữa và thịt trong khi các chủng nhóm II thì không thủy phân protein trong sữa và thịt. g. Chất bảo quản thực phẩm (kháng sinh) Clostidium botulinum phát triển và sản xuất độc tố có thể bị ức chế hoặc hạn chế bởi các chất bảo quản thực phẩm. Các chất đó bao gồm: Nitrite, sorbic acid, parabens, chất chống oxy hóa phenolic, polyphosphates, ascorbates. Những nhân tố (hệ số) riêng lẽ có tác động tích lũy hay kiểm soát tác nhân gây bệnh. Ví dụ, một sự kết hợp xử lý nhiệt và bổ sung các nitrit natri giúp thực phẩm thực sự an toàn. Tương tự như vậy, trong chế biến pho mát tiệt trùng, xử lý nhiệt dưới liều gây chết vi khuẩn kết hợp với mức độ phù hợp của độ ẩm, NaCl, acid, các muối phosphate giúp ức chế sự tăng trưởng của Clostidium botulinum. h. Vi sinh vật cạnh tranh Clostidium botulinum phát triển và hình thành một số độc tố trong thực phẩm được ức chế bởi sự hiện diện của vi sinh vật cạnh tranh. Vi khuẩn axit lactic như Lactobacillus, Pediococcus và Lactococcus, các loại nấm men lên men đường, nhiều chất khác sản xuất acid hữu cơ, cồn và thuốc kháng sinh làm bằng vi khuẩn cũng ngăn chặn Clostidium botulinum. 2.2.7.3. Khả năng nhiễm độc tố botulin a. Thực phẩm bị ô nhiễm Bào tử Clostridium botulinum thường được tìm thấy trong đất và nước, do đó dễ gây nhiễm khuẩn thực phẩm được thu hoạch từ đất và môi trường nước. Ví dụ, các loại thực phẩm thu hoạch từ đất như trái cây và rau quả thường chứa các bào tử loại A và B. Fishes harvested from marine and freshwater coastal environments are commonly contaminated with type E spores. Cá thu hoạch từ các môi trường biển và nước ngọt ven biển thường bị nhiễm các bào tử loại E. Ngoài ra, nhiễm khuẩn cũng có thể xảy ra thông qua việc bổ sung các thực phẩm khác với cá, rau, và các rau gia vị. Các bào tử có thể nảy mầm trong điều kiện thuận lợi sản xuất độc tố rất mạnh. Mầm bệnh lây truyền chủ yếu xảy ra thông qua việc tiêu thụ các thực phẩm có chứa các bào tử hình thành độc tố. b. Mật ong Đây là một thực phẩm nổi tiếng chứa bào tử Clostridium botulinum và có liên quan đến ngộ độc cho trẻ sơ sinh. Trong các nghiên cứu của mật ong, mẫu thử có chứa bào tử In addition, cross-contamination can also occur through supplementation of other foods with fish, vegetables, and spices.20, 22 The spores may germinate under favorable conditions producing highly potent toxin.lên đến 13 phần trăm các mẫu khác, mật ong chỉ bị nhiễm đối với trẻ sơ sinh mà không nhiễm với người lớn vì vậy thực phẩm đã được đề nghị không sử dụng cho trẻ sơ sinh dưới một tuổi. c. Bụi khí và thuốc trừ sâu Bào tử Clostridium botulinum phân tán nhanh trong bụi khí và thuốc trừ sâu, vì vậy thường xuyên gây ô nhiễm môi trường và một số loại thực phẩm. Sự truyền có thể xảy ra thông qua việc hít thở phải bụi ô nhiễm hoặc thuốc trừ sâu và thông qua việc tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm chứa độc tố. 2.3. Cơ chế tác dụng của độc tố Botulin 2.3.1. Cơ chế hoạt động phân tử của BT Khi có sự hoạt động của dây thần kinh vận động tạo nên sự khử cực ở đầu cuối của sợi trục (axon), acetylcholine sẽ được phóng thích từ tế bào chất vào khe synapse. Sự phóng thích acetylcholine được thực hiện bởi một chuỗi protein vận chuyển, phức hợp soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE). Khi BT được xâm nhập vào mô, chuỗi nặng của độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt với cấu trúc glycoprotein được tìm thấy ở đầu thần kinh dẫn truyền actylcholine. Sự gắn chuyên biệt này là nguyên nhân độc tố botulin có tính chọn lọc cao đối với synapse dẫn truyền acetylcholine. Sau khi xâm nhập, chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt lên trên phức hợp SNARE. Tùy các loại BT khác nhau sẽ có các protein đích khác nhau. BT-A được tách thành SNAP-25, BT-B được tách thành VAMP. Sự phân cắt chuỗi nhẹ của phức hợp protein SNARE ngăn cản quá trình sự chuyển acetylcholine vào các lỗ trên bề mặt bên trong trong màng tế bào và kết quả là dẫn đến sự khóa chặt các lỗ hổng. Khi mô đích là phần cơ, xảy ra sự liệt nhẹ do xảy ra sự cắt bỏ dây thần kinh hóa học. Khi mô đích là tuyến ngoại tiết thì sự tiết các chất ở các tuyến này bị khóa chặt. Sự ức chế quá trình xuất bào của acetylcholine bị loại bỏ bằng cách khôi phục lại sự thay thế của phức hợp protein SNARE. 2.3.2. Hoạt dộng của BT trên cơ vân 2.3.2.1. Khoảng thời gian hoạt động Khi BT được nhiễm vào một cơ vân, sự tê liệt nhẹ sẽ xảy ra sau 2 - 5 ngày và kéo dài từ hai đến ba tháng trước khi nó dần dần yếu đi. Khi kháng thể chống lại BT được hình thành như trong trường hợp này, thời gian hoạt động và mức độ ảnh hưởng của các liệu pháp chữa bệnh tối đa thường bị giảm sau khi có sự hiện diện của BT. 2.3.2.2. Liều lượng Có một sự tương quan giữa lượng BT nhiễm vào mô và mức độ gây tê liệt. Tuy nhiên, liều lượng BT thấp vừa phải cũng tạo nên sự tê liệt đáng kể. Đường cong tương quan ảnh hưởng the