Khóa luận Tổng quan về Enzyme ngoại bào Bacillus Subtislis

amino acid. Enzyme này có ba cầu nối disufide. Hai cầu nối disulfide nằm trong trung tâm hoạt động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động. Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 - 75.000 Da. Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà khoa học chia chúng thành hai loại endoglucanase kiểu I và endoglucanase kiểu II. Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da. Endoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Ngoài ra endoglucanase còn được tìm thấy ở Clostridium thermocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác. Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều. b-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động trong khoảng pH rất rộng (pH từ 4,4 - 8,4) phân tử lượng 50.000 - 98.000 Da, PI (isoelectric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. b-glucosidase của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da. Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được. b-glucosidase của Clostridium thermocellum được chia ra làm hai loại b-glucosidase A và b-glucosidase B. b-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid và có phân tử lượng 51.482 Da. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 - 6,5 và ở nhiệt độ 60oC. Chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC. 1.2.4.2. Cơ chế xúc tác của cellulase vi sinh vật Cellulase C1 còn được gọi là exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-b-D-glucan cellobiohydrolase). Enzyme này thủy phân đặc hiệu liên kết b-1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết b-1,4-glucoside). Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng. Cellulase Cx còn được gọi là endocellulase (endoglucanase; 1,4-b-D-glucan-4-glucanohydrolase). Enzyme này thủy phân liên kết b-1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như CMC và Hydroxylethyl Cellulose (HEC). Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh. b-glucosidase (cellbiase; b-D-glucoside glucohydrolase) không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D-glucose. Cellulose kết tinh Enzyme cellulase C1 Exocellulase b-glucosidase Oligomer Cellobiose Các oligomer chuỗi ngắn Glucose Cellulose vô định hình Endoglucanase Hình 1.16. Cơ chế chuyển hóa cellullose dưới sự xúc tác của hệ enzyme cellulase Ngoài ra, còn có các loại enzyme khác như: lipase, hemicellulase và lignase... 1.3. Ưu điểm - nhược điểm của enzyme ngoại bào so với enzyme nội bào của vi sinh vật 1.3.1. Ưu điểm Dễ dàng thu nhận được dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy mà không cần dùng các phương pháp phá vỡ tế bào phức tạp. Không lẫn với các vật chất không hòa tan trong tế bào và có thể tách chiết dễ dàng và nhanh chóng. Enzyme ngoại bào được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào với lượng tương đối lớn trong khi enzyme nội bào nằm trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác và có lẫn cả các protein có tính chất lý hóa rất giống enzyme. Do đó, việc tách những phần nhỏ này rất khó. Không bị biến tính enzyme cần thu nhận do không sử dụng các phương pháp phá vỡ tế bào. Các enzyme ngoại bào đa phần ổn định và bền vững hơn so với enzyme nội bào nhờ sự có mặt của liên kết disulfide. Hoạt tính cao hơn so với các enzyme nội bào. Độ bền nhiệt cũng như khả năng chịu acid cũng cao hơn so với các enzyme nội bào. Giá thành chế phẩm enzyme thu nhận được rẻ hơn rất nhiều so với các enzyme nội bào. 1.3.2. Nhược điểm Các enzyme ngoại bào phần lớn là enzyme thủy phân ở dạng hòa tan nên trong quá trình sản xuất công nghiệp chúng thường lẫn vào sản phẩm gây khó khăn và đòi hỏi chi phí khá cao để tách chúng ra khỏi sản phẩm. Ví dụ như sản xuất glucose sử dụng trong y học phải tuyệt đối sạch cả về phương diện hóa học và sinh học. Còn các enzyme nội bào thường không tan (trừ các enzyme nội bào thuộc nhóm hydrolase) nên dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm ở giai đoạn cuối của phản ứng. Sau phản ứng, nếu tách các enzyme ở dạng hòa tan ra khỏi phản ứng để thực hiện phản ứng tiếp theo hoạt tính sẽ giảm dần. Như vậy việc tái sử dụng chúng không có hiệu quả cao, có nhiều trường hợp không thể sử dụng được nữa. Một số enzyme nội bào được ứng dụng trong y học nhằm mục đích điều trị, nghiên cứu, sản xuất kháng sinh bán tổng hợp và dược phẩm được tinh sạch kỹ lưỡng trong khi các enzyme ngoại bào phần lớn ứng dụng trong các ngành sản xuất công nghiệp thực phẩm, sản xuất các chất tẩy rửa, ngành công nghiệp thuộc da… chỉ ở dạng enzyme kỹ thuật thường không được tinh sạch nhất. CHƯƠNG 2: ENZYME NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS SUBTILIS 2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 - 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy… Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường… 2.1.2. Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc: Giới (Kingdom) : Bacteria Ngành (Division) : Firmicutes Lớp (Class) : Bacilli Bộ (Order) : Bacillales Họ (Family) : Bacillaceae Giống (Genus) : Bacillus Loài (Species) : Bacillus subtilis 2.1.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis 2.1.3.1. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 - 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 - 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học. Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB). Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid (Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại. Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng. 2.1.3.2. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,5 - 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 - 300 năm. Hình 2.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi 2.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose. Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+). Bảng 2.1. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis Phản ứng sinh hóa Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR (Metyl red) + VP (Voges-Proskauer) + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Manitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005) 2.1.3.4. Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 - 7,4. Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản: Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 - 5 mm, sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. Trên môi trường giá đậu - peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 - 4cm sau 72 giờ nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone). 2.1.3.5. Bộ gen của Bacillus subtilis Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào. 2.1.3.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử a) Bào tử Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 - 0,9 µm x 1,0 - 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006). b) Khả năng tạo bào tử Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại và nhiệt độ cao…). Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau: Hình thành những búi chất nhiễm sắc. Tạo tiền bào tử. Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ. Tổng hợp các lớp vỏ bào tử. Giải phóng bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003). 2.2. Hệ enzyme của Bacillus subtilis 2.2.1. Các enzyme nội bào Bacillus subtilis Trong tế bào Bacillus subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có những enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh tổng hợp và nằm trong sinh khối tế bào. Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào. Đó là những enzyme nội bào. Vậy, enzyme nội bào (endoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật tổng hợp trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham gia vào quá trình phân giải (dị hóa) các hợp chất hữu cơ có phân tử lượng thấp hay sinh tổng hợp các vật chất trong tế bào của chúng. Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis: các enzyme thủy phân như protease nội bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; các enzyme tổng hợp như aspagagin-syntetase; các enzyme tham gia các quá trình oxy hóa - khử như dehydrogenase, oxydase, cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế bào. 2.2.2. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường: amylase (α-amylase), b-glucanase, xylanase, protease… Bảng 2.2. Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc tính và phản ứng thủy phân Enzyme Nhiệt độ tối ưu (oC) pH tối ưu Phản ứng thủy phân α-amylase 70 - 80 5,6 - 6,2 Thủy phân liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột và những polysaccharide khác tạo ra các dextrin và oligosaccharide b-glucanase 35 - 55 6,0 - 7,0 Thủy phân liên kết b-1,6-glucoside của b-glucan tạo ra những chất có phân tử lượng thấp. Xylanase 25 5,0 Thủy phân liên kết xylan - một thành phần của hemicellulose. Protease 40 6,2 - 7,4 Thủy phân liên kết peptide và protein và các polypeptide, tạo ra các peptide có phân tử lượng thấp hơn và các amino acid. 2.2.2.1. Enzyme amylase: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) a) Đặc điểm của enzyme α-amylase Ngoài những đặc điểm chung đã nêu (ở chương 1), enzyme α-amylase của Bacillus subtilis còn có nhưng đặc điểm sau: Enzyme amylase thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α-amylase, b-amylase, glucoamylase (amyloglucosidase hay γ-amylase). Trong đó, Bacillus subtilis có thể tổng hợp nên α-amylase. Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iodine và độ nhớt giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các amylase khác. Khi có mặt ion Ca2+ cấu trúc của α-amylase sẽ bền vững và ổn định hơn, kém bền trong môi trường acid. α-amylase của Bacillus subtilis có thể chịu được nhiệt độ cao và ổn định hơn các loài nấm mốc vì trong phân tử enzyme có chứa 4 ion Ca2+. α-amylase của Bacillus subtilis không có các liên kết disulfide và disunithidine. Hoạt tính của chúng có liên quan mật thiết với sự có mặt của ion Ca2+ trong phân tử vì ion này được dùng để duy trì hoạt động của enzyme, từ đó nó có vai trò quan trọng trong việc ổn định hoạt tính của enzyme và tăng cường độ bền của α-amylase trước các tác nhân biến tính và tác dụng phân hủy của protease. Theo Huỳnh Minh Thư (2008), khi khảo sát ảnh hưởng của Ca2+ lên hoạt tính của amylase từ Bacillus subtilis thì kết quả như sau: Bảng 2.3. Ảnh hưởng của Ca2+ lên hoạt tính của amylase từ Bacillus subtilis Nồng độ Ca2+ (%) Hoạt tính α-amylase (UI/ml) 0,1 2880,47 0,15 3371,84 0,2 3001,29 (Huỳnh Minh Thư, 2008) Tác giả đã nhận xét như sau: tùy vào đặc điểm sinh lý sinh hóa của mỗi loại vi sinh vật nhu cầu Ca2+ sẽ khác nhau. Theo kết quả trên, sau khi hoạt tính amylase đạt cực đại, nếu tăng nồng độ ion Ca2+ thì hoạt tính amylase có xu hướng giảm. Điều này do nồng độ ion Ca2+ đã bão hòa và ức chế quá trình tổng hợp enzyme của vi khuẩn. Kết quả này phù hợp với dẫn liệu của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2003), hàm lượng ion Ca2+ thích hợp cho vi khuẩn là 0,01 - 0,03 g/l. Nhưng theo kết quả nghiên cứu của Lê Văn Việt (2007) thì hoạt tính amylase cao nhất đạt được ở nồng độ ion Ca2+ là 0,125%. Sự khác biệt này là do sự khác nhau về nguồn nguyên liệu, nguồn nước sử dụng cũng như sự khác nhau về nhu cầu Ca2+ của chính các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis nghiên cứu. α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tích, còn α-amylase của Bacillus subtilis lại có khả năng phân hủy những hạt tinh bột nguyên lẫn hồ tinh bột. α-amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột nguyên nhanh hơn 2 - 2,5 lần so với α-amylase của nấm mốc. α-amylase của Bacillus subtilis khi lên men rượu, từ tinh bột nấu chín chuyển hóa thành đường nhanh hơn từ tinh bột sống. Sau 1 ngày lên men hàm lượng CO2 thoát ra trong trường hợp nấu chín tinh bột là 9,7g trong khi để đạt được hàm lượng này, khi không nấu chín tinh bột cần thời gian là 4 ngày. Các chủng vi khuẩn chẳng hạn như Bacillus subtilis thường không có độc tố lại tạo ra α-amylase có hoạt tính cao hơn hẳn các chủng nấm mốc. Hiệu suất thu hồi α-amylase của Bacillus subtilis cũng cao hơn khoảng 5 - 10 lần so với các chủng nấm mốc. b) Cơ chế và điều kiện hoạt động Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen: Tinh bột: là nhóm carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì, ngũ cốc, các loại hạt… và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Meyer, 1940). Các loại tinh bột đều có 20 - 30% amylase và 70 - 80% amylopectin. Ở thực vật, tinh bột là chất dự trữ năng lượng quan trọng. Hình 2.2. Cấu trúc của phân tử amylose và amylopectin Glycogen: là một loại carbohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật, glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 - 3.106 Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu ăn quá nhiều carbonhydrate thì cơ thể sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu trong gan. Quá trình α-amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột tương tự như mọi loại α-amylase của các vi sinh vật khác. Có thể tóm tắt như sau: Giai đoạn đầu: trong tinh bột, dưới sự xúc tác của α-amylase chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh tạo thành dextrin có phân tử lượng lớn, người ta gọi đây là giai đoạn dịch hóa hay dextrin hóa. Giai đoạn 2: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành. Nhờ đó, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử lượng thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. Theo số liệu của Lifsitx (1967), pH tối ưu cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm α-amylase của Bacillus subtilis nằm trong vùng pH 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenikxova (1969) thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6 - 7, bị mất hoạt tính hoàn toàn ở pH = 1 và bị mất hoạt tính một phần ở pH = 8. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. Theo một số tài liệu đã được công bố, dưới tác dụng của acid độ bền của α-amylase từ các nguồn khác nhau như sau: Aspergillus batatae > Aspergillus usamii > Aspergillus oryzae > Aspergillus awmori > Bacillus subtilis > thóc mầm. Khi so sánh độ bền với acid của α-amylase của malt, Bacillus subtilis và một số chủng nấm, Fenikxova (1969) và cộng sự đã xác định rằng, α-amylase của Aspergillus oryzae 3-9-15 và Aspergillus oryzae 476-I bền vững hơn so với vi khuẩn Bacillus subtilis và malt. Ở giá trị pH thấp 3,6 ở nhiệt độ 0oC, α-amylase của malt bị bất hoạt hoàn toàn sau 30 phút, và α-amylase của Bacillus subtilis bị bất hoạt tới 50%, trong khi nấm mốc hầu như không bị bất hoạt. α-amylase của Bacillus subtilis tác dụng lên tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6 - 8 gốc glucose (gelatin6 (G6), gelatin7 (G7), gelatin8 (G8)). Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ: G6 G1 + G5; G7 G1 + G6 hay G2 + G5 (ít) G8 G2 + G6 hay G3 + G5 (ít) Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản ứng này bao gồm: dextrin (trong đó chủ yếu là detrin phân tử lượng thấp), maltose và glucose. So với α-amylase của nấm mốc, α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin trội hơn là hoạt lực đường hóa, theo số liệu của Lifsitx và cộng sự, khả năng dextrin hóa của α-amylase từ Aspergillus oryzae cao hơn khả năng đường hóa 1,75 lần còn ở Bacillus subtilis thì cao hơn 2 lần (Lifsitx và Baznit - senko, 1967). Kretovits và Iarovenko (1970) khi nghiên cứu đường hóa tinh bột bằng α-amylase của Bacillus subtilis với các liều lượng khác nhau thấy rằng quá đường hóa đều kết thúc nhanh sau 36 giờ, sau đó lượng glucid không lên men còn lại không đổi trong suốt 36 giờ còn lại. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Người ta nhận thấy rằng α-amylase của vi khuẩn ít bền vững ở điều kiện pH thấp nhưng lại khá bền ở nhiệt độ cao so với α-amylase của nấm sợi. α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động của nhiệt. Nhiệt độ tối ưu của nó là 50oC. Amylase của thóc mầm và malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối ưu ở 58 - 60oC, còn α-amylase của Bacillus subtilis thì nhiệt độ tối ưu có thể đạt từ 70 - 80oC. α-amylase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt thường bền nhiệt hơn α-amylase của các chủng vi sinh vật khác như: α-amylase của Bacillus stearothermophilus 5034 không mất hoạt tính sau 24 giờ nấu ở nhiệt độ 50oC - 70oC. α-amylase của Bacillus stearothermophilus BS -I thì ở 90oC sau 6 phút thì hoạt tính giảm 17% trong khi đó α-amylase của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính hoàn toàn. Kvexitazde và cộng sự (1890) đã tiến hành so sánh tính chất đặc trưng của α-amylase giữa 4 chủng vi khuẩn và nấm mốc điển hình. Theo ông, có thể sắp xếp theo khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ 4 chủng như sau: Bacillus stearothermophilus > Bacillus subtilis > Aspergillus niger >Aspergillus oryzae còn khả năng chịu acid thì ngược lại: Aspergillus niger >Aspergillus oryzae > Bacillus subtilis > Bacillus stearothermophilus. Ở tây Đức người ta đã tuyển chọn được một chủng Bacillus subtilis mà amylase của nó không khác gì amylase của vi khuẩn thông thường về đặc tính tác dụng lên tinh bột song lại có độ bền nhiệt như amylase của nấm sợi (Srisler, Unlig, 1972). Tính chất của α-amylase từ chủng bền nhiệt này cũng đặc trưng cho Bacillus subtilis: có pH tối ưu 6,0; bị bất hoạt hoàn toàn ở pH = 4 và bị mất hoạt tính 50% ở pH = 8. c) Sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis Amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis là một enzyme cảm ứng với cơ chất là tinh bột hay glycogen. Khi trong môi trường có mặt những cơ chất này thì Bacillus subtilis sẽ tổng hợp nên enzyme amylase để thủy phân các cơ chất về các dạng hợp chất có phân tử lượng thấp có thể đi qua màng tế bào. Khi nuôi cấy vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Hai quá trình này không phải bao giờ cũng trùng khớp với nhau về thời gian, nhất là trong phương pháp nuôi cấy chìm. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân (autolysis). Nhiều tác giả cho rằng quá trình tổng hợp enzyme xảy ra trên màng tế bào (Nomura, 1958), và người ta lập luận rằng ở gần màng tế bào tập trung enzyme phân hủy, nó ở trạng thái không hoạt động khi amylase chưa được tạo thành. Khi bắt đầu tổng hợp amylase, enzyme phân hủy trở nên hoạt động và làm biến đổi cấu trúc màng tế bào tới độ cho phép các phân tử amylase đứt ra ngoài môi trường. Song, thật ra, amylase ngoại bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào. Trong các tế bào được phân hủy sơ bộ bằng lysozyme chỉ chứa một lượng amylase rất nhỏ, không thể đáp ứng được amylase hoạt động mạnh mẽ như vậy. Các yếu tố ảnh hưởng của thành phần môi trường: Ảnh hưởng của thành phần môi trường: Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: nồng độ tinh bột tối ưu cho nuôi cấy chìm là 0,5 - 0,7%. Để có hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh bột. Tuy nhiên, khi sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus subtilis thì việc thay tinh bột bằng maltose đã làm khả năng sinh tổng hợp enzyme tăng 50%. Nhưng Srivastava và cộng sự (1981), lại cho rằng isomaltose và pan