MỤC LỤC
TÊN MỤC TRANG
LỜI CẢM ƠN . iii
TÓM TẮT . iv
SUMMARY . v
MỤC LỤC . vi
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT . x
DANH SÁCH BẢNG . xi
DANH SÁCH HÌNH. xii
DANH SÁCH BIỂU ĐỒ . xiii
Chương 1: MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích và yêu cầu . 2
1.2.1. Mục đích . 2
1.2.2. Yêu cầu . 2
1.3. Giới hạn đề tài . 3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
2.1. Sơ lược về cây cao su . 4
2.1.1. Cây cao su và tầm quan trọng của nó . 4
2.1.2. Tình hình bệnh hại trên cây cao su . 5
2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola . 6
2.2.1. Phân loại học . 6
2.2.2. Đặc điểm hình thái . 7
2.2.3. Đặc điểm sinh lý . 7
2.2.4. Khả năng tồn tại . 7
2.2.5. Khả năng phát tán . 8
2.2.6. Con đường xâm nhập, phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây
bệnh của nấm C. cassiicola . 8
2.3. Giới thiệu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su . 9
2.3.1. Lịch sử phát hiện . 9
2.3.2. Triệu chứng của bệnh Corynespora trên cây cao su . 10
2.3.2.1. Trên vườn ươm . 10
2.3.2.2. Trên vườn khai thác . 11
2.3.3. Khả năng hình thành nòi mới . 12
2.3.4. Nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp tuyển non dvt . 13
2.4. Sơ lược về enzyme . 13
2.4.1. Định nghĩa . 13
2.4.2. Tính đặc hiệu . 13
2.4.3. Cơ chế tác động . 14
2.4.4. Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme . 14
2.4.5. Một số phương pháp xác định hoạt tính của enzyme . 14
2.4.6. Sơ lược về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật . 16
2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su . 17
2.4.8. Peroxidase . 17
2.4.8.1. Sơ lược về peroxidase . 17
2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su . 18
2.5. Sơ lược về khí khổng . 18
2.5.1. Cấu tạo . 18
2.5.2. Sự phân bố . 19
2.5.3. Vai trò của khí khổng đối với thực vật . 20
2.5.4. Chu kỳ đóng mở ngày đêm của khí khổng . 20
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 21
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành . 21
3.1.1. Thời gian . 21
3.1.2. Địa điểm . 21
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu . 21
3.2. Phương pháp tiến hành . 21
3.2.1. Phương pháp lấy mẫu lá . 21
3.2.2. Phương pháp phân lập nấm C. cassiicola . 22
3.2.2.1. Hoá chất và dụng cụ . 22
3.2.2.2. Phân lập mẫu nấm . 22
3.2.2.3. Nhân số lượng bào tử . 22
3.2.3. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá
nguyên bằng cách lây bệnh nhân tạo . 23
3.2.3.1. Vật liệu và dụng cụ . 23
3.2.3.2. Phương pháp . 23
3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện . 25
3.2.4. Phương pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt . 25
3.2.4.1. Mục đích . 25
3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất . 25
3.2.4.3. Phương pháp . 25
3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm . 27
3.2.5. Phương pháp đếm số lượng khí khổng trên lá của một số dvt cao su . 27
3.2.5.1. Mục đích . 27
3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ . 27
3.2.5.3. Phương pháp . 27
3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm . 28
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29
4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora tại Lai Khê . 29
4.2. Kết quả phân lập . 31
4.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh
nhân tạo trên mẫu lá nguyên . 32
4.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính
kháng bệnh CFLD trên một số dvt cao su . 36
4.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng . 36
4.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính POD giữa các dvt . 38
4.5. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính
mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su . 40
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 43
5.1. Kết luận . 43
5.2. Đề nghị . 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 45
PHỤ LỤC . 50
69 trang |
Chia sẻ: leddyking34 | Lượt xem: 1953 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Tuyển non dòng vô tính cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) kháng bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora Leaf Fall Disease), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham
gia vào các phản ứng hơn.
Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần cho
phản ứng nhỏ hơn khi không có enzyme và cũng nhỏ hơn so với các phản ứng được
xúc tác bởi các chất xúc tác khác.
Quá trình xúc tác xảy ra qua 3 giai đoạn:
E + S → ES → P +E
Trong đó:
+ E: enzyme.
+ S: cơ chất.
+ P: sản phẩm.
Ở giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu. Kết
quả là tạo thành một phức hợp ES, phức hợp này không bền. Phản ứng này xảy ra
rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng.
Ở giai đoạn thứ hai: cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng và phá vỡ các liên
kết đồng hóa trị.
Ở giai đoạn thứ 3: sản phẩm tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại
trạng thái tự do (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.4.4. Các nhân tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme
Enzyme rất nhạy cảm với nhiều nhân tố: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất,
nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, các anion.
2.4.5. Một số phƣơng pháp xác định hoạt tính của enzyme
Theo Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa (2006), để phân tích hoạt độ
enzyme có thể tiến hành bằng một trong hai cách là phân tích liên tục và phân tích
gián đoạn. Tuy nhiên, dù phân tích theo cách nào thì cũng phải dựa trên nguyên tắc
15
chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme đó là phân tích sự biến đổi
theo thời gian trong những điều kiện phản ứng xác định của cơ chất còn lại, hoặc
sản phẩm tạo thành, hoặc cả cơ chất và sản phẩm.
Phân tích liên tục
Là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên
tục theo thời gian.
Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng của cơ chất ở bước sóng , người ta có thể tiến
hành phản ứng trong một cuvette và đo sự biến đổi của cơ chất bằng quang phổ kế
theo thời gian ngay từ khi bổ sung enzyme vào dung dịch phản ứng có chứa sẵn cơ
chất, hay bổ sung cơ chất vào hỗn hợp đã chứa sẵn enzyme.
Phương pháp đo liên tục thường hay áp dụng khi không có chất, hay cách
làm ngừng phản ứng thích hợp hoặc được áp dụng đối với một số enzyme dễ bị mất
hoạt tính xúc tác ở điều kiện phân tích. Ngoài ra, các phương pháp phân tích liên tục
còn được dùng phổ biến với các nghiên cứu động học enzyme. Tuy nhiên, yêu cầu
đối với thiết bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt để phản ứng có thể được thực
hiện ở các nhiệt độ mong muốn. Đây cũng là một hạn chế của phương pháp. Ngoài
ra, phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó có thể
thực hiện phân tích hoạt độ của nhiều mẫu enzyme trong cùng một lúc.
Phân tích gián đoạn
Là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian
nhất định thì làm ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng
cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Đây là cách được sử dụng phổ biến
nhấttrong các phân tích hoạt độ enzyme hiện nay.
Để làm ngừng phản ứng enzyme có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt như
nhiệt độ cao, thay đổi pH (bổ sung acid hoặc kiềm), dùng chất tạo phức hay tách
enzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng… Phương pháp này khắc phục được những hạn
chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể ổn
nhiệt, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu… Tuy vậy, vấn đề là phải tìm ra cách làm
ngừng phản ứng thích hợp.
16
Dựa trên nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme bằng cách đo liên tục hay gián
đoạn, hoạt độ enzyme có thể xác định theo một hay một số phương pháp chính sau đây:
Phương pháp đo độ nhớt.
Phương pháp phân cực kế.
Phương pháp đo áp suất hay
áp kế.
Phương pháp quang phổ kế.
Phương pháp chuẩn độ.
Phương pháp sắc ký.
Phương pháp hoá học.
Phương pháp phóng xạ.
Phương pháp huỳnh quang.
Tuỳ theo các đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp phân tích,
yêu cầu về độ chính xác của phép đo cũng như điều kiện của phòng thí nghiệm mà
có thể lựa chọn cách xác định nào là thích hợp nhất. Tuy vậy cách đáng tin cậy nhất
trong mọi trường hợp là xác định sản phẩm tạo thành theo thời gian, bởi vì có các
trường hợp, hoạt độ enzyme cần xác định có thể rất thấp, sự chuyển hoá cơ chất vốn
phải có ở mức bão hoà có thể xảy ra nhưng rất khó đo được một cách chính xác.
Khi đó, sự xuất hiện của sản phẩm phản ứng được xác định bằng những cách đo đặc
hiệu, cho phép khẳng định sự có mặt của enzyme một cách đáng tin cậy.
2.4.6. Sơ lƣợc về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật
Để hạn chế sự phát triển của các mầm bệnh do nấm gây ra thì các loại thực
vật cũng tạo ra nhiều cơ chế để chống lại các mầm bệnh đó. Ký chủ có thể gia tăng
thành tế bào của chúng bằng cách hình thành thêm thành tế bào, lignin… và tạo ra
các hợp chất kháng vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp như phenol, quinone,
alkaloid. Tăng cường tạo các enzyme và hoạt tính của chúng đóng vai trò quan
trọng trong cơ chế kháng của thực vật. Các enzyme này thường xuất hiện dưới các
dạng đồng hình khác nhau và thường liên quan đến quá trình tổng hợp các chất
phòng vệ hoặc có tác động trực tiếp đến sự kháng khuẩn. Nhiều loại PR proteins
(Pathogenesis Related Proteins) được xem như là enzyme. Khi không có sự xuất
hiện của các chất từ sự nhiễm bệnh thì sự hoạt động của các enzyme này sẽ bị ức
chế. PR proteins có thể chỉ xuất hiện sau khi đã phát sinh bệnh thì chúng mới có
biểu hiện kháng. Một số PR proteins điển hình là -1,3-glucanase, chitinase,
peroxidase, polyphenol oxidase… (Joseph, 2006).
17
2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su
Breton và ctv (1996), hoạt tính -1,3-glucanase khác nhau giữa các dòng vô
tính khác nhau: GT 1, PB 235 và PB 260. Đồng thời ông cũng nhận thấy hoạt tính
peroxidase cao hơn trong dòng kháng GT 1 và hoạt tính của chitinase của dvt GT 1
cũng tăng lên trong khi lây nhiễm nhân tạo bệnh Corynespora.
Hoạt tính của enzyme -1,3-glucanase của dvt GT 1 cũng được ghi nhận là
tăng lên sau 24 tới 96 giờ lây bệnh Corynespora nhân tạo (Philip và ctv, 2001).
Năm 2006, Kurma và Jacob đã nghiên cứu sự thay đổi của các enzyme oxy
hoá liên quan đến khả năng phòng vệ trên cả dvt cao su cảm nhiễm (RRII 105 và
PB 260) và kháng (RRIM 600 và GT 1) khi chủng bệnh Corynespora và thấy rằng
hoạt tính của enzyme oxy hoá liên quan đến khả năng phòng vệ ở các dòng kháng
cao hơn ở các dòng cảm nhiễm.
2.4.8. Peroxidase
2.4.8.1. Sơ lƣợc về peroxidase
Dunford và Stillman (1976); Gray và Montgomery (1997) đã cho rằng
peroxidase (POD) là enzyme oxy hoá khử phân bố rộng khắp mà sử dụng hydrogen
POD hoặc các hydroperoxide hữu cơ như là các chất oxy hoá. Phần lớn POD là các
glycoprotein chứa liên kết N – oligosaccharide (Miranda và ctv dẫn nhập, 2003).
Theo Chatchamon Daengkanit và Wallie Suvachittanont (2005), peroxidase
là một hemeprotein xúc tác oxy hoá electron của các cơ chất khác nhau (phenol, các
amine thơm) bởi H2O2. Heme peroxidase tồn tại ở nhiều nơi trong tự nhiên với
nhiều chức năng sinh lý học và đã được phân thành 3 lớp dựa vào trình tự amino
acid của chúng. Lớp I bao gồm các peroxidase nội bào, đó là cytochrome c
peroxidase, ascorbate peroxidase. Lớp II chứa các enzymes kích thích sự bài tiết
của nấm, như là manganese peroxidase và lignin peroxidase. Lớp thứ III bao gồm
các peroxidase kích thích bài tiết của thực vật.
Johann Putter (1974), thuật ngữ peroxidase (POD) trong nó mang một ý
nghĩa rộng lớn bao gồm một nhóm enzyme chuyên biệt như NAD – POD,
NADP – POD, acid béo – POD, cytochrome – POD và glutathione – POD cũng
18
như một nhóm enzyme không chuyên biệt từ các nguồn khác nhau, mà chúng được
biết đến nhiều nhất là POD. POD xúc tác phản ứng khử hydro của một số lượng lớn
các hợp chất hữu cơ như phenol và các amine thơm, các hydroquinone, các amine
dehydroquinone, các dẫn xuất của benzidine. Đặc biệt là o-toluidine, guaiacol...
2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su
Theo Geiger và ctv (1989), hoạt tính peroxidase tăng lên khi cây chịu nhiều
loại stress khác nhau. Ví dụ như bị tổn thương, sốc nhiệt hoặc sốc thẩm thấu và ô
nhiễm không khí. Phản ứng này đã được nghiên cứu trong trường hợp nhiễm bệnh
nơi mà thường xuyên liên quan đến kích thích hoạt tính POD để kháng lại mầm
bệnh. Trong trường hợp này, peroxidase được xem là nhân tố điều khiển bước cuối
cùng của quá trình sinh tổng hợp lignin bằng cách tạo chất đồng trùng hợp cinnamyl
alcohol dẫn đến sự gỗ hoá của mô tăng cao bất thường. Phản ứng lignin hoá này có
thể hạn chế sự xâm nhiễm của mầm bệnh và sự phát triển mầm bệnh trong mô.
POD liên quan đến sự hóa gỗ của thành tế bào và trong quá trình biến dưỡng
của sự oxy hoá hormone thực vật indole-3-acetic acid (IAA). Chúng đóng vai trò
quan trọng trong việc ngăn chặn cơ chế tấn công của mầm bệnh, giúp chống mặn và
giảm stress. Trong cây cao su, POD được tìm thấy nhiều ở gần lớp võ cây, có thể
ngăn chặn được các vết thương (Daengkanit và Suvachittanont, 2005).
Joseph và ctv (2006), POD là một enzyme quan trọng tìm thấy trong thực vật.
Nó đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp lignin và nó được biết đến như là chất xúc
tác cho quá trình oxy hoá của mono và diphenol, các amine thơm để tăng độc tố
quinone khi có sự hiện diện của hydrogen. POD được xem là độc tố của vi sinh vật.
2.5. Sơ lƣợc về khí khổng
2.5.1. Cấu tạo
Tế bào bảo vệ có một nhân lớn và nhiều lục lạp bé. Nó là tế bào biểu bì duy
nhất có lục lạp ở cây sống trên cạn.
Vách nối giữa tế bào bảo vệ với tế bào phụ mỏng và sự dẫn truyền giữa
chúng không cần sự có mặt của sợi liên bào. Tế bào bảo vệ dính với tế bào phụ và
treo lơ lửng trên xoang dưới lỗ khí.
19
Hình 2.1: Cấu tạo khí khổng
(Nguồn: và
Tế bào bảo vệ dạng elip có vách phía bụng hóa dày nằm sát lỗ, vách phía
lưng mỏng nằm xa lỗ.
Toàn bộ bộ máy lỗ khí được phủ bằng một lớp cutin dày nên ngăn sự mất
nước khỏi tế bào bảo vệ (Nguyễn Ngọc Trì, 2005).
2.5.2. Sự phân bố
Theo Phạm Thị Lộc (2002), khí khổng gặp ở lớp biểu bì của tất cả các cơ
quan, trừ rễ. Tuy nhiên, theo Nguyễn Ngọc Trì (2005), khí khổng có ở tất cả thực
vật bậc cao, hầu hết ở thực vật bậc thấp (rêu, dương xỉ) ngoại trừ các cây thủy sinh
mọc trong nước. Ở khỏa tử và bí tử, khí khổng có hầu hết ở các bộ phận cơ quan
trên không như lá, thân, hoa, quả mặc dù trong vài trường hợp khí khổng không
hoạt động. Kích thước, số lượng và sự phân bố khí khổng tùy thuộc rất nhiều vào
loài, vào vị trí lá, vị trí trên từng bản lá, bội thể và điều kiện sống. Thông thường
trên mỗi mm2 lá có 20 – 400 khí khổng. Tuy nhiên đôi khi có đến 1.000 khí
khổng/mm2 hoặc hơn nữa.
Lá của các loại thân thảo một lá mầm như họ hòa bản thường mang khí
Vách mỏng
Lỗ khí Tế bào bảo
vệ
Nhân
Lục lạp
Không bào
Tế bào thịt lá
Xoang dưới
lỗ khí
Tế bào
bảo vệ
Tế bào phụ
Lỗ khí
Tế bào biểu
bì
20
khổng bằng nhau ở cả hai mặt lá. Ở loài thân thảo hai lá mầm, số lượng khí khổng ở
mặt dưới lá nhiều hơn mặt trên. Hầu hết cây thân gỗ hai lá mầm khí khổng chỉ có ở
mặt dưới lá trong khi ở các lá nổi trên mặt nước ở những loài cây thủy sinh thì khí
khổng chỉ có ở mặt trên của lá, lá chìm trong nước thường không có khí khổng.
Trong phần lớn trường hợp, khí khổng phân bố rải rác ngẫu nhiên trên phiến lá. Tuy
nhiên, ở cây một lá mầm với lá có hệ mạch dẫn chạy song song, khí khổng được sắp
xếp thành hàng nằm giữa các mạch dẫn.
2.5.3. Vai trò của khí khổng đối với thực vật
Khí khổng là con đường chủ yếu xâm nhập CO2 trong quang hợp và là con
đường chủ yếu trong thoát hơi nước.
2.5.4. Chu kỳ đóng mở ngày đêm của khí khổng
Nét đặc trưng quan trọng của khí khổng là nó mở khi phản ứng với ánh sáng
và đóng lại trong tối. Cũng có khi lỗ khí đóng lại một phần hay hoàn toàn giữa ngày
khi cây bị mất nước nghiêm trọng, lá bị héo. Ngoại trừ cây mọng nước như xương
rồng thì lỗ khí mở suốt đêm và đóng lại suốt ngày (Nguyễn Ngọc Trì, 2005).
Cây cao su là loại thực vật bậc cao nên cơ chế đóng mở khí khổng của chúng
cũng tương tự như các loại thực vật khác. Khí khổng mở ra khi phản ứng với ánh
sáng và đóng lại trong tối, đây là một trong những điều kiện thuận lợi cho mầm
bệnh xâm nhập qua khí khổng khi chúng mở ra. Theo Phan Thành Dũng (2004),
bào tử C. cassiicola phóng thích cao điểm vào lúc 8 – 11 giờ. Mặt khác, đây cũng là
thời điểm khí khổng mở ra nên rất thuận lợi cho nấm C. cassiicola xâm nhập.
Hình 2.2: Cấu tạo mở và đóng của khí khổng
(Nguồn:
21
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
3.1.1. Thời gian
Từ tháng 03/03/2007 đến 30/07/2007.
3.1.2. Địa điểm
Địa điểm lấy mẫu: Vườn Dự án giống cao su Quốc gia và Vườn Sơ
tuyển 03 – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN) tại Lai Khê,
Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương.
Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Phòng
Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm của Trung Tâm
Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN.
3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu lá cao su của một số dvt bị nhiễm bệnh Corynespora và mẫu lá hoàn
toàn sạch bệnh. Mẫu lá được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm là khoảng 10 – 12
ngày tuổi.
3.2. Phƣơng pháp tiến hành
3.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu lá
a. Đối với lá bệnh (10 – 12 ngày tuổi)
Mẫu lá phải được lấy trước 8 giờ sáng khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử
còn nằm trên vết bệnh chưa phóng thích vào không khí.
Chọn những mẫu lá có vết bệnh đặc trưng. Sau đó giữ ẩm để đưa về phòng
thí nghiệm.
b. Đối với mẫu lá sạch bệnh (10 – 12 ngày tuổi)
Mẫu lá phải được lấy trước 8 giờ sáng. Phải xem kỹ và chắc chắn rằng trên
gân lá và phiến lá không có bất kỳ một vết bệnh nào dù lớn hay nhỏ. Ghi rõ tên dvt
22
lấy mẫu. Sau đó giữ ẩm để đưa về phòng thí nghiệm.
3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm C. cassiicola
3.2.2.1. Hoá chất và dụng cụ
Dụng cụ: becher, bình tam giác, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pence, lame,
lamelle, kính hiển vi quang học, autoclave, tủ sấy, hộp plastic đựng mẫu,
giấy thấm nước, bút lông, băng keo.
Hoá chất:
Môi trường PDA, PSA (cách pha chế Phụ lục 2).
Thuốc nhuộm Methylene blue.
3.2.2.2. Phân lập mẫu nấm
Lấy mẫu lá bệnh từ vườn đem về phòng thí nghiệm. Trước khi phân lập phải
xác định hình thái sợi nấm và bào tử dưới kính hiển vi bằng cách dùng băng keo
trong dán vào mặt dưới của lá bệnh sau đó ép lên lam kính.
Tại vị trí vết bệnh đặc trưng trên mẫu lá, cắt thành những miếng nhỏ tại phần
tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh có kích thước 5 mm x 5 mm. Tiến hành rửa lá 1
lần với cồn 70ºC trong 30 giây. Sau đó rửa lại 2 lần với nước cất (cất 2 lần), khử
trùng que kẹp trên ngọn đèn cồn, để nguội, dùng que kẹp gắp các mẫu lá đặt vào 5
vị trí trên đĩa môi trường (mặt dưới của lá tiếp xúc với bề mặt môi trường).
Sau 2 ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassicola được cấy chuyền
sang đĩa petri chứa môi trường PDA và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang
12 giờ/ngày ở điều kiện nhiệt độ 26 – 30ºC/2 – 3 ngày. Khi nấm phát triển, tiếp tục
cấy chuyền sang môi truờng mới cho đến khi tạo được nguồn nấm thuần chủng.
3.2.2.3. Nhân số lƣợng bào tử
Từ nguồn nấm thuần chủng, lấy mẫu nấm với đường kính 0,8 cm cấy vào đĩa
petri chứa môi trường PSA. Nấm C. cassiicola khó tạo bào tử trong môi trường
nhân tạo, để có được một số lượng lớn bào tử trên môi trường nhân tạo ta có thể tiến
hành như sau: đặt các đĩa petri này trong bóng tối 5 ngày liên tiếp để sợi nấm phát
triển. Tiếp theo, dùng lam kính cạo nhẹ trên bề mặt của khuẩn lạc để kích thích sợi
nấm tạo bào tử và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang liên tục trong 3 ngày.
23
3.2.3. Phƣơng pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu
lá nguyên bằng cách lây bệnh nhân tạo
Thực hiện theo phương pháp của Chee (1988) và phương pháp này hiện đang
được sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN.
3.2.3.1. Vật liệu và dụng cụ
Nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng (60 đĩa petri), micropipette, nước
cất 2 lần, thuốc chống mốc (2 g/lít nước), giấy thấm nước, lưới sắt
(24 cm x 14 cm), ống hút nhựa (có đường kính 1 cm), hộp plastic trong
suốt có nắp đậy với kích thước: dài 25 cm, rộng 15 cm, cao 8 cm.
Mẫu lá sạch bệnh (60 dvt) lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 – VNCCSVN.
3.2.3.2. Phƣơng pháp
a. Bố trí thí nghiệm
Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized
Design, CRD).
Số nghiệm thức: 60 (60 dvt), số lần lặp lại: 3, mỗi lần lặp lại 2 lá.
Tổng số mẫu: 180, mỗi mẫu (1 hộp plastic).
Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 2 đợt.
b. Phương pháp tiến hành
Đặt lớp giấy thấm nước xuống đáy hộp, cho nước cất (cất 2 lần) vào hộp đến
khi vừa thấm ướt giấy là đủ, tiếp theo đăṭ môṭ lớp ống hút nhựa lên trên lớp giấy,
sau đó đặt tấm lưới sắt lên (lớp ống hút có tác dụng là làm cho lá không tiếp xúc
trực tiếp với nước, tấm lưới sắt giúp cho lá giữ được thăng bằng để có thể nhỏ giọt
dung dịch bào tử ở trên mặt lá).
Mẫu lá được rửa với thuốc chống mốc 1 lần trong 30 giây, sau đó rửa lại 3
lần với nước cất, thấm khô, đặt vào hộp đã được chuẩn bị sẵn ở trên (mặt trên của lá
tiếp xúc với tấm lưới sắt). Dùng micropipette hút dịch bào tử đã qua lưới lọc, nhỏ
lên hai bên gân chính của lá, mỗi bên 4 giọt (1 giọt = 20 µl).
Sau khi lây nhiễm, đặt các hộp plastic dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12
giờ/ngày. Nhiệt độ phòng 26 ± 2ºC.
24
c. Các chỉ tiêu, chu kỳ theo dõi và cách phân cấp mức độ bệnh.
Chỉ tiêu theo dõi
Ghi nhận cấp bệnh (gồm 4 cấp từ 0 – 3) trên mỗi mẫu lá dựa vào số lượng và
diện tích vết bệnh như Hình 3.1.
Hình 3.1: Minh họa phân cấp bệnh trên mẫu lá nguyên
(Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN).
Theo dõi 3 lần vào các thời điểm 5, 7 và 10 ngày sau khi lây nhiễm. Cấp
bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh đang sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN
(Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Bảng phân cấp bệnh gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên
Cấp bệnh Triệu chứng
Cấp 0
Cấp 1
Cấp 2
Cấp 3
Không bệnh
Lá có màu hơi ngăm đen ngay bên dưới giọt dung dịch bào tử
Vết bệnh lan rộng và rõ nhưng chưa có sợi nấm
Vết bệnh lan rộng và rõ, xuất hiện nhiều sợi nấm
(Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN).
Phân hạng thống kê mức độ bệnh sau 10 ngày lây nhiễm theo cách tính sau:
Rất nặng: X ≥ +
25
Nặng: ≤ X < +
Trung bình: – ≤ X <
Nhẹ: X ≤ –
Trong đó:
X: cấp bệnh của mỗi dvt.
: cấp bệnh trung bình của 60 dvt.
: độ lệch chuẩn quần thể.
d. Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel.
3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: từ 15/03 – 30/05/2007.
Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn BVTV – VNCCSVN.
3.2.4. Phƣơng pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt cao su
Thưc̣ hiêṇ theo phương pháp của Thankamony và Philip (2006).
3.2.4.1. Mục đích
Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên
một số dvt cao.
3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất
a. Vật liệu và dụng cụ
Mẫu lá cao su bị bệnh rụng lá Corynespora và mẫu lá sạch bệnh lấy tại
Vườn Sơ tuyển 03 – VNNCSVN.
Máy đo quang phổ DR 5000, cối, chày, đá lạnh, micropipette các loại,
eppendorf, cân điện tử, kéo, nước cất 2 lần, máy ly tâm lạnh, autoclave,
tủ sấy, tủ lạnh.
b. Hoá chất:Phosphate buffer 0,1 M (pH = 7,0), dung dịch guaiacol 20 mM,
dung dịch H2O2 4,2%.
3.2.4.3. Phƣơng pháp
Bố trí thí nghiệm
Từ 60 dvt sau khi gây bệnh nhân tạo, chia thành 4 cấp bệnh, từ mỗi cấp bệnh
chọn ngâũ nhiên 3 dvt để xác định hoạt tính POD.
26
Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), trong mỗi nghiệm thức gồm 2 yếu tố: hoạt
tính POD trên mẫu lá bệnh và mẫu lá không bệnh (đối chứng), mỗi yếu tố
lặp lại 3 lần.
Tổng số mẫu: 72.
Điều kiện thí thiệm: ly trích enzyme ở điều kiện lạnh (khoảng 4ºC), bảo
quản enzyme ở 0 – 4ºC, đo hoạt tính enzyme ở 25ºC.
Phương pháp ly trích peroxidase từ lá cao su.
Phương pháp đo hoạt tính peroxidase
Phương pháp
Cho 3 ml dung dịch buffer + 0,05 ml dung dịch guaiacol + 0,1 ml dung dịch
enzyme + 0,03 ml dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) vào trong cuvette. Trộn đều
và đặt cuvette vào trong máy đo quang phổ kế. Đo ở bước sóng 436 nm.
Thêm 3ml phosphate buffer
Cân 1 gam mẫu lá, cắt nhỏ, cho vào cối
Cho dịch nghiền vào eppendorf
Ly tâm 18.000 vòng/15 phút ở 5ºC.
Thu dịch nổi, cất giữ enzyme ở 0 – 4ºC.
Nghiền trong điều kiện lạnh
Mẫu lá bệnh (hoặc mẫu đối chứng), rửa 2 lần với nước cất 2 lần
27
Chỉ tiêu quan sát
Sau khi đặt cuvette vào máy đo quang phổ. Ghi nhận thời gian cần để sự hấp
thu tăng thêm 0,05 ( t).
Họat tính enzyme được tính theo công thức sau:
Trong đó:
3,18: thể tích cuối (ml).
0,1: lượng enzyme đem đo (ml).
1000: đổi đơn vị ml sang lít.
6.39: tương đương với 1 đơn vị enzyme tạo thành ở bước sóng 436 nm.
1: độ dài ánh sáng đi qua cuvette (cm2).
Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0.
3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian thực hiện: 01/06 – 10/07/2007.
Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng
Thí nghiệm của Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN.
3.2.5. Phƣơng pháp đếm số lƣợng khí khổng trên lá của một số dvt cao su
Thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Kim Linh (2005).
3.2.5.1. Mục đích
Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD
của một số dvt cao su.
3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ
Hoá chất collodium, đũa thuỷ tinh, lame, lamelle, kính hiển vi quang học.
Mẫu lá sạch bệnh của 12 dvt được chọn ra từ 4 cấp bệnh, mỗi cấp bệnh 3
dvt sau khi đánh giá khả năng kháng bệnh rụng lá Corynespora.
3.2.5.3. Phƣơng pháp
Bố trí thí nghiệm:
Từ 60 dvt cao su sau khi gây bệnh nhân tạo in vivo, phân về 4 cấp bệnh, mỗi
Hoạt tính enzyme (đơn vị / lít)
28
cấp bệnh chọn ra 3 dvt để tiến hành đếm mật độ khí khổng.
Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), đơn yếu tố (số lượng khí khổng trên mẫu lá
sạch bệnh), số lần lặp lại 3 (1 lần lặp lại là một vị trí đếm trên 1 lá/1 dvt).
Tổng số mẫu: 36.
Phương pháp tiến hành
Thoa một lớp mỏng collodium (khoảng 1cm2) ở mặt dưới của lá cao su. Đợi
cho collodium khô, bóc ra đem quan sát dưới kính hiển vi giữa hai lớp lam và
lamelle. Đếm số khí khổng thấy được trong diện tích thị trường vật kính X40.
Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0.
3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian thực hiện: 10/07 – 30/07/2007.
Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn BVTV – VNCCSVN.
29
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora tại Lai Khê
Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.)
Wei., họ Moniliales gây ra, xuất hiện lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1999 tại
Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương.
Triệu chứng bệnh ban đầu khá đặc trưng như trên lá già là dạng xương cá
dọc theo gân chính và gân phụ, lá chuyển dần sang màu đỏ cam, trên lá non là
những vết tròn có tâm mỏng như giấy, bao quanh vết bệnh là vòng màu nâu hoặc
đen có quầng vàng ở ngoài, đôi khi hình thành lỗ thủng tại tâm vết bệnh...
Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm và lượng mưa nhiều đó
là điều kiện rất thuận lợi cho nấm gây CLFD phát triển cả về mức độ lẫn quy mô,
đồng thời cũng có những biến đổi lớn về triệu chứng bệnh, kích thước vết bệnh và
vị trí gây bệnh.
Mặt khác, cũng tùy theo tính mẫn cảm của từng dvt, tuổi lá, thời điểm nấm
xâm nhiễm hoặc yếu tố môi trường đối với mầm bệnh mà chúng hình thành những
triệu chứng không đặc trưng làm cho chúng ta khó xác định trực tiếp ngoài đồng
ruộng mà phải đem về phòng thí nghiệm quan sát hình thái bào tử qua kính hiển vi.
Có một số triệu chứng không đăc̣ trưng của bệnh rụng lá Corynespora dễ gây
nhầm lẫn với một số bệnh khác nhưng nếu quan sát kỹ vẫn có thể phân biệt được.
Ví dụ, triệu chứng quăn đầu lá gần giống như bệnh héo đầu lá do nấm Colletotricum
gloeosporioides (Penz) gây ra, điểm khác biệt lớn là bề mặt các đốm bệnh bằng
phẳng, không có u lồi và có những viền màu nâu được bao quanh bởi quầng vàng.
Một số triệu chứng CLFD tại Vườn Dư ̣án giống cao su Quốc gia – Lai Khê,
Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương (Hình 4.1a và Hình 4.1b).
30
Hình 4.1a: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá non
Hình 4.1b: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá già
Qua các đợt điều tra của Bộ môn BVTV tại các Vườn Sơ tuyển của
VNCCSVN (Bảng 4.1) cho thấy hầu hết các vườn này đều bị nấm C. cassiicola tấn
công và không một dvt nào có được tính kháng hoàn toàn với bệnh, 100% dvt trên
Vết tròn có
viền nâu được
bao quanh bởi
quầng vàng
Cháy phiến lá
Quăn đầu lá
Dạng
xương cá
Lá biến dạng
tạo lỗ trên vết
bệnh
31
vườn đều nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Tuy nhiên, trên
cuống và chồi rất ít gặp, bệnh gây trên lá là chủ yếu.
Bảng 4.1: Kết quả điều tra CLFD ở vƣờn sơ tuyển 03 và 04 tại Lai Khê
Tên vƣờn Ngày điều tra Số dvt
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- NGUYEN NGOC THANH TRANG.pdf