Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật Elisa xét nghiệm hàm lượng Progesterone sữa giúp chẩn đoán sớm mang thai trên bò không động dục hoặc phối nhiều lần không đậu được điều trị bằng kích thích tố tại công ty cổ phần bò sữa Đồng Nai

Trong khi đó, các nghiên cứu đã chứng minh rằng việc khám qua trực tràng tốt nhất cũng nên thực hiện sớm nhất vào ngày thứ 60 sau khi gieo tinh nhân tạo. Nếu thực hiện kỹ thuật này sớm hơn, trong giai đoạn 40 ngày sau khi gieo tinh nhân tạo sẽ làm tăng đáng kể tỷ lệ sẩy thai từ 10% đến 11%. Đo hàm lượng progesterone trong máu hoặc trong sữa vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 sau khi gieo tinh đã có thể xác định tình trạng có hay không có thai ở bò cái. Cơ sở của việc ứng dụng hàm lượng progesterone vào ngày thứ 21 sau khi gieo tinh để xác định sự mang thai sớm của bò cái được biểu hiện trên biểu đồ 2.2. Biểu đồ 2.2. Động thái progesterone giúp chẩn đoán sớm có thai (Chung Anh Dũng, 2002). Động thái progesterone khi u nang noãn và tồn hoàng thể ở bò sữa Có 70,3% trường hợp u nang noãn và 25% trường hợp u hoàng thể đã bị chẩn đoán sai bởi phương pháp khám qua trực tràng. Do đó, khám buồng trứng qua trực tràng là phương pháp không đủ tin cậy để giám sát tình trạng hoạt động của buồng trứng. Mặt khác, xác lập động thái progesterone ở bò sữa có khối u trên buồng trứng có thể giúp phân biệt dễ dàng hơn giữa 2 trường hợp u nang noãn và u hoàng thể. Biểu đồ 2.3. Động thái progesterone u nang noãn và u hoàng thể ở bò sữa(nguồn : Blowey, 1992). Các chỉ định và ứng dụng của xét nghiệm progesterone trong sữa Xác nhận động dục Bò cái thường có dấu hiệu động dục không rõ ràng dẫn đến việc quyết định phối giống sai. Vào thời điểm phối tinh có tới 15 – 20% bò sữa không động dục. Ở một số trang trại, tỷ lệ phát hiện động dục sai có thể cao tới 50% hoặc hơn (Shearer, 2006). Progesterone trong sữa có thể dùng để xác định động dục ở bò. Nếu mẫu sữa kiểm tra cho thấy hàm lượng progesterone cao thì có thể bò không động dục và cần được theo dõi cẩn thận cũng như kiểm tra lại các mẫu lấy vào thời điểm muộn hơn. Có thể tiến hành đơn giản bằng cách giữ lại mẫu sữa vào thời điểm bò được đưa ra phối tinh cho đến khoảng 2 tuần hoặc một tháng sau. Nếu nhiều hơn 10% số bò được phối tinh vào thời điểm có hàm lượng progesterone cao thì có thể chứng minh được là việc phát hiện động dục không chính xác. Các stress với môi trường có tác dụng rất lớn đến hiệu quả sinh sản. Đặc biệt, stress nhiệt là nguyên nhân dẫn đến việc giảm nghiêm trọng tỷ lệ có chửa, tăng tỷ lệ chết phôi sớm, giảm độ dài và cường độ của các biểu hiện động dục và làm giảm thể trọng bê sinh ra. Ngày nay người ta đã sử dụng progesterone trong sữa để trợ giúp cho các chương trình phối giống trong điều kiện gia súc bị stress do môi trường. Chẩn đoán bò mang thai và không mang thai Việc chẩn đoán có thai sớm bằng progesterone chính xác khoảng 80%, 20% sai sót là do sự khác nhau về độ dài của chu kỳ động dục giữa các bò, các nhầm lẫn trong phát hiện động dục, bệnh tử cung như bọc mủ tử cung, hoạt động khác thường của buồng trứng như u nang thể vàng hoặc nang trứng và phôi chết sớm. Việc sử dụng progesterone để chẩn đoán có thai cần phải kết hợp với việc khám thai 40 ngày, hoặc muộn hơn sau khi phối giống. Tuy nhiên, với một loạt các mẫu lấy vào ngày 0 (ngày phối tinh) và các ngày thứ 21 và 24, việc chẩn đoán sớm sự không có chửa có thể đạt đến độ chính xác 95 – 100%. Do vậy, progesterone vốn là công cụ để chẩn đoán có thai sớm nên được sử dụng cho mục đích chẩn đoán không có thai và từ đó có thể xác định được tình trạng có thai hay không của gia súc. Việc sớm xác định không có chửa này sẽ tránh được sự bỏ lở cơ hội phối giống tiếp theo (Shearer, 2006). Bò có các vấn đề về sinh sản Progesterone trong sữa có thể dùng để chẩn đoán các những rối loạn về tử cung như viêm tử cung cũng như có thể ứng dụng để phân biệt trường hợp thể vàng hình thành u nang. Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy việc khám qua trực tràng chỉ phát hiện được 65 – 75% trường hợp bò bị u nang buồng trứng. Do vậy, qua xác nhận kết quả chẩn đoán, có thể quyết định liệu pháp điều trị. Sau điều trị, có thể kiểm tra xem bò có phản ứng theo chiều hướng mong muốn hay không (Shearer, 2006). Các chương trình cấy truyền phôi Các chương trình cấy truyền phôi đòi hỏi phải kiểm tra con cho và con nhận một cách thường xuyên. Việc gây động dục đồng pha thành công rõ ràng là bước sống còn để đạt được thành công trong qui trình cấy truyền phôi. Đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng độ chính xác của việc xác định thể vàng phát triển qua khám trực tràng chỉ đạt 75 – 80%. Như vậy, việc sử dụng các test chẩn đoán progesterone một cách có chọn lọc ở những bò cho kết quả khám thể vàng không rõ ràng sẽ cải thiện hiệu quả cấy truyền phôi rất nhiều do tình trạng sinh sản của bò chuẩn bị cho cấy truyền phôi được xác định đúng. Nguyên tắc xét nghiệm hàm lượng progesterone bằng kỹ thuật ELISA Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật EIA là phản ứng ELISA Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng ELISA Phương pháp kiểm tra hàm lượng progesterone dựa trên xét nghiệm miễn dịch enzyme pha loãng nhờ vào phương pháp cạnh tranh bắt buộc. Mẫu chứa một lượng progesterone không biết sẽ được cạnh tranh với một lượng progesterone đã được gắn enzyme có độ gắn kết cao với một số lượng kháng thể nhất định được gắn ở mặt trong của đĩa. Sau khi bỏ đi lượng kháng nguyên tự do và lượng kháng nguyên được đánh dấu trong mẫu, sẽ suy ngược ra để tính lượng kháng nguyên không đánh dấu. Nồng độ thực của những mẫu chưa biết sẽ được biết nhờ ý nghĩa của đường cong chuẩn dựa trên tỷ lệ đã biết của kháng nguyên không đánh dấu đã được phân tích song song với mẫu chưa biết. Sau khi loại bỏ dung dịch nền được thêm vào và enzyme được kết hợp trong một khoảng thời gian cố định trước khi phản ứng kết thúc, những chất hấp thu đo được ở 450nm nhờ máy đọc đĩa ELISA. Một đường cong chuẩn được tạo thành nhờ sử dụng các giá trị tiêu chuẩn ở giá trị hấp thu của các ống không được làm đối chứng. Kết quả những mẫu được đọc chính xác nhờ đường cong chuẩn bằng cách sử dụng những phép tính tay hay chương trình máy tính thích hợp. Các công trình nghiên cứu liên quan Các nghiên cứu trong nước Lê Xuân Cương và ctv (1990) đã sử dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ để định lượng progesterone nhằm chẩn đoán sớm có thai ở trâu bò.Nguyễn Thanh Dương và ctv (1995) đã điều tra các trạng thái chậm sinh trên 63 bò cái ở Phù Đổng, Ba Vì. Kết quả có 25,39% do tồn thể vàng; 11,11% do động dục ngầm; 23,08% bò cái có buồng trứng kém hoạt động; 9,52% bò động dục nhưng không rụng trứng; 19,04% viêm nội mạc tử cung; 4,67% do tử cung tích mủ và 6,34% u nang buồng trứng. Chung Anh Dũng (2002) đã nghiên cứu việc ứng dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA – Radio Immuno Assay) để xác định hàm lượng progesterone trong sữa nhằm nâng cao hiệu quả gieo tinh nhân tạo cho bò lai hướng sữa. Phan Văn Kiểm và ctv (2006) đã xác định hàm lượng progesterone trong sữa ở bò lai hướng sữa bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA) nhằm xác lập diễn biến của progesterone trong chu kỳ động dục, chẩn đoán mang thai và các nguyên nhân gây chậm động dục ở bò cái. Các nghiên cứu nước ngoài Dùng kỹ thuật RIA để đo hàm lượng progesterone trong máu, sữa hoặc lông vào ngày thứ 21 – 24 sau khi gieo tinh đã có thể xác định tình trạng có thai hay không của bò cái của nhiều tác giả (Booth, 1979; Adeyemo, 1986; Dazhi và ctv, 1986; Mahaputra và ctv, 1986). Các nghiên cứu nhằm xác định thời điểm động dục ở bò sữa bằng việc định lượng progesterone trong sữa bò hay nghiên cứu về động thái của progesterone trong chu kỳ động dục bình thường và bất bình thường được thực hiện bởi rất nhiều tác giả (Thatcher và ctv, 1986; Tan và ctv, 1986; Gombe và ctv, 1986…). Sử dụng kỹ thuật EIA và RIA để định lượng progesterone nhằm giám sát chức năng sinh sản của bò sữa là các nghiên cứu của Kalis và ctv (1980); Wiel và ctv (1982); Laitinen và ctv (1985); Wiel và ctv (1986). Blowey (1992) đã sử dụng kỹ thuật RIA để xác lập động thái progesterone ở 4 bò sữa có khối u trên buồng trứng, từ đó tác giả đã có thể phân biệt dễ dàng hơn giữa hai trường hợp u nang noãn và u hoàng thể. Nghiên cứu của Roeloft và ctv (2005) về mối tương quan giữa hàm lượng progesterone trong sữa và trong huyết tương vào thời điểm rụng trứng ở bò sữa cho thấy có sự dao động lớn trong thời gianprogesterone giảm xuống đến rụng trứng, làm cho việc theo dõi hàm lượng progesterone không phù hợp để dự đoán thời điểm rụng trứng. Tuy nhiên, theo dõi sự giảm của progesterone có tác dụng làm tăng độ nhạy cảm của các dự đoán khác về thời điểm rụng trứng. Vài nét về điểm thực tập Sơ lược về Công ty cổ phần bò sữa Đồng Nai Vị trí địa lý Công ty cổ phần bò sữa Đồng Nai nằm trên địa bàn xã Tam Phước, huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai, trên quốc lộ 51, cách ngã tư Vũng Tàu 14 km theo hướng Vũng Tàu. Quá trình hình thành Là một công ty nhà nước trực thuộc sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai được thành lập năm 1977 với tên gọi ban đầu là trại bò sữa An Phước. Đến năm 1995 đổi tên là Xí nghiệp bò sữa An Phước. Tháng 01 năm 2006 chính thức đổi tên là Công ty cổ phần bò sữa Đồng Nai – trực thuộc tổng công ty công nghiệp thực phẩm Đồng Nai. 2.9.1.3 Chức năng và nhiệm vụ - Sản xuất kinh doanh, xuất nhập khẩu con giống bò sữa, bò thit và các loại gia súc khác, các loại nông dược phẩm, thức ăn gia súc, các loại cỏ và cây trồng. - Sản xuất, thu mua, chế biến, kinh doanh sữa tươi và sản phẩm về sữa. - Kinh doanh thuốc và vật tư thú y, dịch vụ kỹ thuật chăn nuôi gia súc. - Sản xuất kinh doanh phân hữu cơ, vi sinh. Tổ chức sản xuất 2.9.2.1 Cơ cấu đàn bò Tính đến tháng 07/2006 số lương đàn bò của Công ty cổ phần bò sữa Đồng Nai được thể hiện qua bảng sau: Bảng 2.2 Cơ cấu đàn bò của Công ty cổ phần bò sữa Đồng Nai Loại đàn Đầucon Nhóm máu F1 F2 F3 F4 F5 F6 5/8 HL Sind 0 – 4 tháng 34 - 8 18 3 5 - - - - 5-8 tháng 32 - 10 8 13 1 - - - - 9– 12 tháng 26 - 9 5 9 2 - - 1 - Tơ lở 193 28 53 59 31 13 2 3 4 - Cạn sữa 106 24 35 33 12 - - 1 1 - Vắt sữa 130 33 46 36 9 2 - 3 1 - Bò nuôi thịt 43 16 10 3 2 2 1 - - 2 Bò Sind 31 - - - - - - - - 28 Bò đực 5 - - - - - - - - 3 Cộng 600 96 171 162 79 25 3 7 7 33 2.9.2.2 Diện tích đất sử dụng Tổng diện tích đất do Công ty quản lý là 367 ha thuộc loại đất cát xám bạc màu. Trong đó, diện tích đất trồng cỏ 50ha bao gồm các loại cỏ chủ yếu như cỏ voi, cỏ sả lá lớn và lá nhỏ, cỏ Stylosanthes. Đồng cỏ chăn thả và phân lô 70ha. Một phần diện tích đất khác sử dụng cho xây dựng cơ bản như Văn phòng công ty, nhà xưởng, chuồng trại chăn nuôi còn lại 120 ha giao khoán cho CB-CNV làm trang trại theo Nghị định 01/ CP của Chính phủ tạo vùng nguyên liệu cho Công ty. Chuồng trại Hệ thống chuồng trại của Công ty được chia thành 2 khu vực. Trại cũ được xây dựng vào năm 1980 theo kiểu chuồng của CuBa gồm 7 dãy. Chuồng xây 1 mái, kết cấu nền bê tông, khung gỗ, mương nước ở giữa 2 dãy, có gắn hệ thống quạt mát và phun sương. Trại mới được xây dựng năm 2003 với kiểu chuồng tương đối hiện đại, phù hợp với chăn nuôi bò sữa. Chuồng cao ráo, thoáng mát, 2 mái lệch có khoảng hở để thông khí, kết cấu nền bê tông, cột sắt, trụ bê tông, mái che bằng tole, có sân chơi riêng. Trại mới bao gồm 2 dãy chuồng: một dãy nuôi bò vắt sữa, một dãy nuôi bê hậu bị. Mỗi dãy phân thành 2 dãy nhỏ có lối đi giữa. Từng dãy được ngăn ra thành nhiều ô riêng biệt để thuận tiện cho việc chăm sóc, nuôi dưỡng các loại bò và nhóm bò khác nhau. 2.9.2.4 Quy trình chăm sóc nuôi dưỡng Thức ăn Thức ăn thô: Thức ăn chủ yếu là cỏ được cho ăn tự do. Giống cỏ chủ yếu là cỏ sả lá lớn, lá nhỏ, cỏ voi và cỏ Stylosanthes để cải thiện chất lượng thức ăn thô xanh cho đàn bò nhất là vào mùa khô. Mùa nắng thiếu cỏ nên phải bổ sung thêm rơm khô cho ăn dưới dạng ủ urea trong thời gian 1 tháng. Bên cạnh đó còn có cỏ ủ chua được dự trữ thường xuyên để bổ sung vào khẩu phần. Thức ăn tinh: chủ yếu là cám hỗn hợp và hèm bia. Thức ăn bổ sung: Ngoài thức ăn thô và thức ăn tinh bò được bổ sung thêm một số loại thức ăn bổ sung khác như: mật, muối, Urea, cỏ họ đậu chủ yếu vào mùa nắng thức ăn thô xanh kém chất lượng. Riêng đá liếm cho bò sử dụng thường xuyên. Cách thức cho ăn: Tất cả các loại thức ăn thô xanh như: Cỏ băm nhỏ, cỏ ủ chua, rơm được đưa vào máng ăn cho bò ăn tự do. Mùa nắng tưới thêm mật, muối, urea pha loãng. Mỗi ngày cho ăn 5 lần vào các thời điểm 8h sáng, 11h trưa, 2h, 4h chiều và 8h tối. Cám và hèm bia cho ăn vào mỗi buổi sáng. Riêng đàn vắt sữa được cho ăn cám hỗn hợp và hèm bia vào thời điểm vắt sữa lúc 3 giờ sáng và 15 giờ chiều mỗi ngày. Định mức thức ăn: Số lượng thức ăn được tính riêng cho từng đàn loại, nhóm giống. Đàn vắt sữa khẩu phần thức ăn tinh tính theo năng suất sữa cứ 0,3 kg cám hỗn hợp cho 01 kg sữa và 8 – 10 kg hèm bia / con. Kết quả được trình bày ở Bảng 2.3. Bảng 2.3. Định mức các loại thực liệu trong khẩu phần ăn cho các nhóm bò (kg/con/ngày) Đàn loại Loại thức ăn Cám Mật Muối Ure Cỏ Rơm Hèm bia Sữa bê Cỏ ủ Bê 0 – 4 tháng 1 - - - 10 - - 3 - Bò 5 – 8 tháng 1,5 - - - 18 - - - - Bò 9 – 12 tháng 1 1,2 0,03 - 15 2 3 - - Tơ lỡ 2 1,5 0,03 0,02 18 4 4 - - Đàn cạn sữa 1 1 0,05 0,03 20 5 - - - Bò chửa 7 – 8 tháng 2 2 0.05 0.03 20 5 4 - - Bò chửa trên 8 tháng 3 2 0.05 0.05 20 5 8 - - Đàn vắt sữa * Dưới 4 kg sữa - 2 0,05 0,03 25 6 3 - - * Từ 4 – 6 kg sữa 1 2 0,05 0,03 20 6 3 - 5 * Từ 6 –10 kg sữa 0,3 2 0,05 0,03 15 4 5 - 5 *Từ 10–15kg sữa 0,3 2 0,05 0,05 15 4 10 - 10 * Trên 15 kg sữa 0,3 2 0,05 0,05 15 3 12 - 10 Sind nuôi con + chửa 1 1 0,04 0,03 35 9 3 - - Bò đực 2 2 0,06 0,08 10 10 6 - - Bò thịt 1 1,2 0,06 0,06 15 10 6 - - * Ghi chú: đàn vắt sữa định mức cám tính trên kg sữa. 2.9.2.5 Quy trình vệ sinh Đàn bò được tắm 2 lần mỗi ngày kết hợp dọn phân, rửa chuồng. Phân gom được đưa về nhà chứa phân ủ ít nhất 1 tháng trước khi đưa ra bón đồng cỏ. Nước thải cho xuống hệ thống mương và hầm lắng để xử lý vi sinh. 2.9.2.6 Công tác thú y Chuồng trại đều được phun thuốc sát trùng hàng tháng. Đàn bò được định kỳ phòng bệnh ký sinh trùng ngoài da, ký sinh trùng máu, xổ sán lãi. Quy trình tiêm phòng được thực hiện đúng theo quy định của ngành thú y. Các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như: Lỡ mồm long móng, tụ huyết trùng định kỳ tiêm 6 tháng 1 lần. Nước thải được cho xuống hệ thống hầm lắng và xử lý trước khi sử dụng tưới cho đồng cỏ. Định kỳ 3 tháng 1 lần tổ chức tiêu độc sát trùng chuồng trại cho các hộ chăn nuôi trong khu vực. 2.9.2.7 Khai thác và tiêu thụ sữa Đàn bò được vắt sữa bằng máy 2 lần/ ngày. Buổi sáng từ 3 – 5 giờ, buổi chiều từ 15 – 17 giờ sau khi bò được tắm chải vệ sinh, sát trùng bầu vú bằng thuốc nhúng vú Iodaman. Sữa vắt xong được bỏ vào can nhựa vận chuyển ra điểm thu mua sữa của Công ty trong thời gian 2 giờ để kiểm tra chất lượng và bảo quản lạnh ở 4 độ C. Các tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng sữa theo đúng các quy định của Vinamilk. NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP Thời gian, địa điểm và đối tượng khảo sát Thôøi gian: Töø thaùng 03/2007 ñeán thaùng 6/2007. Ñòa ñieåm thöïc hieän taïi Coâng ty Coå phaàn boø söõa Ñoàng Nai, huyeän Long Thaønh, tænh Ñoàng Nai. Maãu söõa xeùt nghieäm ñöôïc phaân tích taïi trung taâm phaân tích thí nghieäm Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm thaønh phoá Hoà Chí Minh. Ÿ Boø nhoùm maùu 50 vaø 75% Holstein Friesian (HF) thuoäc löùa 1, 2, 3, 4 sinh saûn bình thöôøng hoaëc sau khi sinh töø 90 ngaøy trôû leân khoâng ñoäng duïc hoaëc phoái gioáng nhieàu laàn khoâng ñaäu thai. Nội dung nghiên cứu - Sử dụng một số chế phẩm kích dục tố để tiêm cho bò không động dục hoặc phối nhiều lần không đậu như PGF2a, huyết thanh ngựa chửa (HTNC)…để điều trị đúng các tình trạng kém khả năng sinh sản và đánh giá hiệu quả điều trị. - Lấy mẫu sữa ở bò sinh sản bình thường và chậm sinh được phân theo nhóm máu, lứa đẻ ở các ngày 0, 7, 14, 21 sau khi gieo tinh để khảo sát hàm lượng progesterone. Vật liệu hóa chất Boä kít progesterone (Bovine progesterone ELISA Test. Endocrine technologies, INC. USA) ñöôïc baûo quaûn ôû 2 ñeán 80C neáu khoâng söû duïng. Tuyeät ñoái khoâng tröõ ñoâng, caùc maãu söõa xeùt nghieäm ñöôïc ñöa veà nhieät ñoä phoøng ñeå chuaån bò pha dung dòch pha loaõng vaø TBM theo tyû leä 1/1 trong moät oáng nghieäm saïch tröôùc khi xeùt nghieäm töø 5 ñeán 10 phuùt. Nhöõng chaát xeùt nghieäm dö phaûi ñöôïc loaïi boû. Maùy ly taâm 3000 voøng/phuùt OÁng nghieäm baèng nhöïa (5 ml) Boâng thaám nöôùc Thuøng ñaù baûo quaûn maãu Pipette chính xaùc huùt ñöôïc 25, 50, 100, 200 ml vaø 1 ml Nöôùc caát OÁng nghieäm baèng thuûy tinh ñeå pha chaát neàn maøu A, B Giaáy thaám Baêng keo trong Maùy ñoïc ñóa vi chuaån ñoä Giaáy veõ ñoà thò tuyeán tính Tuû saáy 370C Parafine ñeå bòt kín ñóa Ñaàu huùt gaén vaøo pipette söû duïng moät laàn Phương pháp tiến hành Khaûo saùt 40 boø söõa nhoùm maùu 50 vaø 75% HF sau khi sinh töø 90 ngaøy trôû leân khoâng ñoäng duïc hoaëc phoái nhieàu laàn khoâng ñaäu ôû caùc löùa ñeû 1, 2, 3 vaø 4. Bố trí điều trị bò không lên giống hoặc phối nhiều lần không đậu Trong quá trình điều trị cần phải tăng cường cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho bò không lên giống hoặc phối nhiều lần không đậu để loại trừ trường hợp bò bị suy dinh dưỡng làm kém khả năng sinh sản. - Bò không lên giống: Bò sau khi sinh 90 ngày mà không có biểu hiện lên giống. Khám trực tràng phát hiện buồng trứng teo không có nang noãn. Sử dụng huyết thanh ngựa chửa tiêm cho nhóm bò này. - Bò phối nhiều lần không đậu: Xác định nguyên nhân xem bò bị u nang noãn hoặc tồn hoàng thể bằng cách khám qua trực tràng xem hoàng thể (cứng) hoặc nang noãn (mọng nước). Bảng 3.1. Bố trí điều trị bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu dựa theo quy trình điều trị của trại. Tình trạng Số bò (n) Biện pháp can thiệp Bò teo buồng trứng 10 Tiêm huyết thanh ngựa chửa Bò u nang noãn 10 Tiêm Gonestrone Bò u hoàng thể 10 Tiêm PGF2a Bố trí số mẫu sữa khảo sát + Khảo sát chung 40 boø söõa ñöôïc chia thaønh 4 loâ theo sô ñoà sau: Bảng 3.2. Bố trí chung Loâ thí nghieäm Soá boø (n) Soá maãu söõa thu thaäp (n) Ñoái chöùng 10 50 Tiêm HTNC 10 50 Tieâm PGF2a 10 50 Tieâm Gonestrone 10 50 Toång coäng 40 200 + Theo nhoùm maùu Baûng 3.3. Soá maãu söõa khaûo saùt treân boøsinh sản bình thường, bò chẩn đoán tồn hoàng thể, u nang noãn và teo buồng trứng Nhoùm maùu (%) HF Soá boø (n) Soá maãu söõa thu thaäp (n) 50 20 100 75 20 100 Toång coäng 40 200 + Theo caùc löùa ñeû Baûng 3.4. Soá maãu söõa khaûo saùt theo löùa ñeû ôû boø sinh saûn bình thöôøng, bò chẩn đoán tồn hoàng thể, u nang noãn và teo buồng trứng Löùa ñeû Soá boø (n) Soá maãu thu thaäp (n) 1 13 65 2 14 70 3 7 35 4 6 30 Toång coäng 40 200 - Choïn boø khaûo saùt Boø sau khi sinh treân 90 ngaøy khoâng leân gioáng hoaëc phoái nhieàu laàn khoâng ñaäu: . Xaùc ñònh heä thoáng sinh duïc baát bình thöôøng: Khaùm tröïc traøng xem dò taät, bò theïo, raùch coå töû cung, bò vieâm naëng (xem caùc noát saàn treân söøng töû cung vaø töû cung baèng caùch nắm vaø vuoát doïc theo töû cung vaø coå töû cung ñeå xaùc ñònh caùc noát saàn) … loaïi boû boø naøy khoâng ñöa vaøo khaûo saùt. . Xaùc ñònh boø bò oám do suy dinh döôõng: Khaùm tröïc traøng xem buoàng tröùng teo khoâng coù nang noaõn. Khuyeán caùo cung caáp ñaày ñuû dinh döôõng vaø boá trí thí nghieäm can thieäp kích thích toá ñeå boø leân gioáng. . Xaùc ñònh boø bò toàn nang noaõn hoaëc hoaøng theå: Khaùm tröïc traøng xem hoaøng theå (cöùng) hoaëc nang noaõn (moïng nöôùc). Ñöa vaøo boá trí thí nghieäm can thieäp kích thích toá ñeå boø leân gioáng. - Laáy maãu söõa Veä sinh loï ñöïng söõa coù theå tích khoaûng 50 ml. Röûa saïch vaø lau khoâ baàu vaø nuùm vuù cuûa boø söõa. Vaét söõa boø bình thöôøng ñöôïc khoaûng vaøi lít, sau ñoù höùng söõa cho vaøo loï ñeå ñaït theå tích khoaûng 50 ml. Söõa ñöôïc laáy vaøo buoåi saùng ñoái vôùi caû hai nhoùm boø sinh saûn bình thöôøng vaø boø chaäm sinh. - Ly taâm maãu söõa Maãu söõa ñöôïc ly taâm 3000 voøng/phuùt trong 30 phuùt. Phaàn maøu vaøng ñuïc vaø ñaëc ôû treân laø beùo vaø phaàn caën söõa ôû döôùi ñaùy oáng nghieäm phaûi ñöôïc loaïi boû. Söû duïng kim chích ñaâm xuyeân qua phaàn beùo roài huùt phaàn söõa trong beân döôùi cho vaøo oáng ñöïng maãu ghi soá hieäu vaø baûo quaûn trong tuû ñoâng -30 0 C. Kỹ thuật ELISA Chuaån bò xeùt nghieäm: Kít ñöôïc baûo quaûn ôû 2 ñeán 80C neáu khoâng söû duïng. Tuyeät ñoái khoâng ñöôïc tröõ ñoâng, caùc maãu söõa xeùt nghieäm ñöôïc ñöa veà nhieät ñoä phoøng ñeå chuaån bò pha H20/TBM theo tæ leä 1A/1B trong moät oáng nghieäm saïch tröôùc khi xeùt nghieäm töø 5 ñeán 10 phuùt. Nhöõng chaát xeùt nghieäm dö phaûi ñöôïc ñem boû caån thaän. Muïc ñích Phöông phaùp ELISA ño haøm löôïng progesterone laø moät heä thoáng xeùt nghieäm mieãn dòch enzyme ñeå xaùc ñònh haøm löôïng progesterone trong söõa boø vaø caùc loaøi thaân thuoäc. Phöông phaùp naøy coù ñaëc tính chuyeân bieät giuùp chaån ñoaùn vaø kieåm tra haøm löôïng progesterone trong söõa nhaèm xaùc ñònh tình traïng sinh saûn cuûa thuù. Nguyeân taéc xeùt nghieäm Kieåm tra haøm löôïng progesterone döïa treân xeùt nghieäm mieãn dòch enzyme pha loaõng nhôø vaøo phöông phaùp caïnh tranh baét buoäc. Maãu maùu hoaëc söõa chöùa moät löôïng progesterone khoâng bieát seõ ñöôïc caïnh tranh vôùi moät progesterone ñaõ ñöôïc gaén enzyme coù ñoä gaén keát cao vôùi moät soá löôïng khaùng theå nhaát ñònh ñöôïc gaén ôû maët trong cuûa ñóa. Sau khi boû ñi löôïng khaùng nguyeân töï do vaø löôïng khaùng nguyeân ñöôïc ñaùnh daáu trong maãu, seõ ñöôïc suy ngöôïc ra ñeå tính löôïng khaùng nguyeân khoâng ñaùnh daáu. Noàng ñoä thöïc trong nhöõng maãu chöa bieát seõ ñöôïc tính nhôø yù nghiaõ cuûa ñöôøng cong chuaån döïa treân tæ leä ñaõ bieát cuûa khaùng theå khoâng ñaùnh daáu ñaõ ñöôïc phaân tích song song voùi maãu chöa bieát. Sau khi loaïi boû dung dòch neàn ñöôïc theâm vaøo vaø enzyme ñöôïc keát hôïp trong moät khoaûng thôøi gian coá ñònh tröôùc khi phaûn öùng keát thuùc, nhöõng chaát haáp thu ñöôïc ño ôû 450 nm nhôø maùy ñoïc ñóa ELISA. Moät ñöôøng cong chuaån ñöôïc taïo thaønh nhôø söû duïng caùc giaù trò tieâu chuaån nhôø giaù trò haáp thu cuûa caùc oáng khoâng ñöôïc laøm ñoái chöùng. Keát quaû nhöõng maãu chöa bieát ñöôïc ñoïc chính xaùc nhôø ñöôøng cong chuaån baèng caùch söû duïng nhöõng pheùp tính tay hay chöông trình maùy tính thích hôïp. Caùc böôùc tieán haønh xeùt nghieäm haøm löôïng progesterone trong söõa Taát caû caùc thuoác thöû phaûi cho ñaït tôùi nhieät ñoä phoøng (18 – 250C) tröôùc khi söû duïng.( uû söõa 370C trong 1 giôø) Laáy pipette chuaån ñoä 50 ml huùt maãu vaät xeùt nghieäm vaø maãu ñoái chöùng vaøo caùc gieáng thích hôïp. ( uû söõa 370C trong 1 giôø) Laáy 100 ml dung dòch enzyme progesterone vaøo moãi loã gieáng (ngoaïi tröø nhöõng loã ñeå troáng), laéc loã gieáng 30 giaây, uû 370C trong 1 giôø. Neân duøng parafine ñeå che nhöõng loã gieáng hoaëc söû duïng tuùi thích hôïp ñeå caát giöõ nhöõng ñóa trong suoát quaù trình uû aám. Boû nhöõng chaát coøn toàn ñoïng beân trong loã gieáng vaø röûa ñóa 5 laàn vôùi dung dòch röûa (250 – 300 ml/gieáng). Laät ngöôïc ñóa, kieåm tra giaáy thaám ñeå laáy ñi nöôùc aåm coøn xoùt laïi. Theâm 100 ml dung dòch TMB vaøo taát caû caùc loã gieáng. Nhôù thöù töï pipette. UÛ ñóa ôû nhieät ñoä phoøng (18 -280C) trong 10 phuùt, khoâng ñöôïc di chuyeån. Döøng phaûn öùng baèng caùch cho theâm 50 ml dung dòch döøng phaûn öùng vaøo caùc loã gieáng… theo thöù töï gioáng nhau ñeå cô chaát theâm vaøo taùc ñoäng töø töø. Ñoïc böôùc soùng haáp thu ôû 450 nm vôùi maùy ñoïc ELISA. Chuù yù: uû cô chaát phaûi ñöôc giöõ trong nhieät ñoä giôùi haïn 25 – 280C. Neáu ngoaøi nhieät ñoä giôùi haïn naøy, thôøi gian uû aám phaûi ñöôïc tính laïi cho ñuùng. Tính toán kết quả và hiệu quả kinh tế - Tính ñoä haáp thu trung bình cuûa moãi loaïi: Maãu chuaån, maãu ñoái chöùng, maãu söõa xeùt nghieäm. - Veõ ñöôøng cong chuaån treân giaáy veõ ñoà thò tuyeán tính. Ñoä haáp thu cuûa chuaån ñeå ôû truïc tung (Y). Noàng ñoä chuaån töông öùng ôû truïc hoaønh (X). - Tính toaùn noàng ñoä progesterone cuûa maãu söõa döïa vaøo ñöôøng cong chuaån treân. Phương pháp xử lý số liệu Soá lieäu ñöôïc trình baøy döôùi daïng trung bình vaø sai soá cuûa maãu ± SE. - Trung bình coäng: X1, X2,…, Xn: laø noàng ñoä progesterone cuûa moãi boø n: laø soá boø - Ñoä leäch chuaån + Maãu nhoû: (vôùi n £ 30) + Mẫu lớn: (với n >30) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Qua thời gian điều trị và xét nghiệm hàm lượng progesterone sữa bằng kỹ thuật ELISA kết hợp với khám lâm sàng ở bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu đã cho kết quả như sau. Hàm lượng progesterone sữa trung bình ở bò sinh sản bình thường, bò tồn hoàng thể, u nang noãn hoặc teo buồng trứng 40 bò được chẩn đoán sinh sản bình thường, tồn hoàng thể, u nang noãn hoặc teo buồng trứng và được điều trị bằng kích thích tố đã lên giống và được phối. Sau khi tiến hành lấy mẫu sữa ở các thời điểm 0, 7, 14, 21 và 24 để xác định hàm lượng progesterone sữa. Kết quả khảo sát hàm lượng progesterone sữa trung bình ở bò sinh sản bình thưòng, tồn hoàng thể, u nang noãn hoặc teo buồng trứng được trình bày qua Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1. B