Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (White Spot Disease - WSD) trên tôm sú (Penaeus monodon)

dòng, kĩ thuật này càng phát huy được thế mạnh của nó về độ chính xác, độ nhạy và hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm. Trong khoá luận này, dựa vào những điều kiện sẵn có, chúng tôi tiến hành ứng dụng hoá mô miễn dịch để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú 2.4. Sơ lƣợc về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemmistry) 2.4.1. Lịch sử phát triển Coons và cộng sự (1941) là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mô. Kĩ thuật hoá mô miễn dịch ngày càng phát triển, một số enzyme đã được dùng để đánh dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1966) và alkaline phosphatase (Mason và Sammons, 1978). Keo vàng được phát hiện bởi Faulk và Taylor (1971) và 22 có thể sử dụng để phát hiện phản ứng hoá mô miễn dịch bằng cả kính hiển vi quang học lẫn kính hiển vi điện tử. Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử phóng xạ và phản ứng miễn dịch được nhận biết bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography). Ngày nay hoá mô miễn dịch đã trở thành một kĩ thuật chủ yếu và được sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đoán lâm sàng) (IHC world, 2005). 2.4.2. Nguyên lý Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thử đặc hiệu. Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi chúng tác dụng với cơ chất. 2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đưa vào cơ thể một động vật có thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta có thể nhận biết được (miễn dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thường là cả hai loại). Bản chất hóa học của kháng nguyên thường là những đại phân tử protein. Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987). Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhưng chỉ có một số vùng giới hạn trên những phân tử đó tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng thể. Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể và được gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng. Epitope là dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp. Lượng vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thước và tính phức tạp của kháng nguyên (Stites và ctv, 1987). 23 2.4.4. Kháng thể (antibody) Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đó, IgG và IgM thường được dùng trong hóa mô miễn dịch. Có hai loại kháng thể (Hình 2.8) A B Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002). A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên  Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Được tạo ra bởi những tế bào plasma khác nhau nên thường không đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu. Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhưng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên 24  Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Được tạo ra từ một dòng tế bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Ưu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu. Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm đã được phát triển bởi Poulos và ctv (2001). Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus WSSV trên tôm nhiễm bệnh. Phương pháp tạo ra kháng thể này như sau:  Một phần của gen VP28 (VP28F118) được clone vào vector  Chuyển vector vào E. Coli, mục đích là tạo ra một protein (rVP28F118) thiếu vùng liên màng tận cùng bằng đầu N.  Protein VP28F118 được tinh sạch bằng SDS-FAGE và dùng để gây miễn dịch trên chuột Swiss thu kháng huyết thanh.  Chọn một dòng tế bào plasma từ kháng huyết thanh thu được cho lai với tế bào u tuỷ bằng phương pháp cell fusion. Tế bào lai (hybridoma) tạo thành được dòng hoá. Thu kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 từ dòng tế bào lai này. Trong bài khóa luận chúng tôi dùng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 trong phương pháp hóa mô miễn dịch để phát hiện mầm bệnh virus WSSV trên tôm sú Penaeus monodon. Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể  Độ pha loãng kháng thể: tùy thuộc vào phương pháp, thời gian ủ và nhiệt độ. Nếu không có những thông tin từ nhà cung cấp kháng thể ta phải chuẩn độ để xác định nồng độ thích hợp nhất cho các chất tham gia phản ứng hóa mô miễn dịch. Kháng thể được pha loãng ở nồng độ thích hợp và không đổi sẽ nâng cao chất lượng nhuộm. Người ta thường xác định nồng độ thích hợp bằng cách đầu tiên chọn một thời gian ủ cố 25 định, sau đó thử nghiệm với một lượng nhỏ kháng thể ứng với một chuỗi các nồng độ pha loãng thử nghiệm. Kháng thể đơn dòng có khoảng pI và cấu tạo phân tử giới hạn hơn kháng thể đa dòng nên chúng nhạy cảm hơn với pH và ion trong dung dịch đệm. Vì vậy để ước lượng kháng thể đơn dòng cần chuẩn độ ở pH 6,0 và 8,6 và không có NaCl. Độ pha loãng cao nhất và pH duy trì phản ứng miễn dịch mạnh nhất được gọi là độ pha loãng tối ưu (Boenisch và ctv, 2002).  Thời gian ủ: thường trái ngược với độ chuẩn của kháng thể, độ chuẩn càng cao thì thời gian ủ để có kết quả tối ưu càng ngắn. Tuy nhiên trên thực tế thường thì người ta đưa ra một thời gian ủ thích hợp trước khi xác định độ pha loãng tối ưu. Nồng độ kháng thể đặc hiệu càng cao thì thời gian ủ càng ngắn (Boenisch và ctv, 2002).  Nhiệt độ ủ: Trạng thái cân bằng trong phản ứng kháng nguyên – kháng thể đạt được nhanh ở 370C. Với nhiệt độ ủ khá cao ta có thể rút ngắn thời gian ủ và tăng độ pha loãng kháng thể. Tuy nhiên không thể biết được là nhiệt độ chỉ thúc đẩy phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể hay kích ứng tất cả những phản ứng nền. Để phát triển kĩ thuật hóa mô miễn dịch chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam chúng tôi chọn thử nghiệm một chỉ tiêu quan trọng quyết định kết quả nhuộm là độ pha loãng kháng thể và 1 yếu tố phụ là nồng độ DAB. 2.4.5. Các phƣơng pháp nhuộm Có nhiều phương pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005). 26 Hình 2.9. Các phƣơng pháp nhuộm A: Phương pháp trực tiếp (direct method). B: Phương pháp gián tiếp hai bước (two-step indirect method). C: Phương pháp gián tiếp ba bước (three-step indirect method). D: Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan (APAAP) E: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (ABC). F: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (LAB hay LSAB). A. Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất. Quá trình thực hiện như sau: Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng. Vì phương pháp này chỉ dùng một kháng thể nên tiết kiệm thời gian và rất ít phản ứng không đặc hiệu. Tuy nhiên cũng vì phản ứng chỉ gồm một kháng thể đánh dấu nên tín hiệu thu được rất ít và không đủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay (Hình 2.8.A) ( Boenisch và ctv, 2002). A B Enzyme Khángnguyên Kháng thể 1 Kháng thể 2 Kháng thể 3 Biotin (Strept)avidin Chú thích C D E F 27 B. Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể sơ cấp kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phương pháp này linh hoạt hơn phương pháp trực tiếp vì nhiều loại kháng thể sơ cấp khác nhau từ cùng một loài có thể được sử dụng với cùng kháng thể thứ cấp cộng hợp. Quy trình này cũng nhạy hơn nhuộm trực tiếp vì nhiều kháng thể thứ cấp sẽ phản ứng với nhiều epitope khác nhau trên kháng thể sơ cấp và khuyếch đại tín hiệu lên nhiều lần vì nhiều enzyme được cố định trên mỗi vị trí đích (Hình 2.8.B) (Boenisch và ctv, 2002). Thông thường, kháng thể sơ cấp là kháng thể đơn dòng và kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng. C. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Trong phương pháp này người ta bổ sung thêm 1 kháng thể đánh dấu enzyme nữa vào phương pháp B. Hai kháng thể thứ cấp được bố trí theo thứ tự như hình 2.8.C. Ví dụ như nếu kháng thể thứ cấp thứ 1 tạo ra từ dê, thì kháng thể thứ cấp thứ 2 phải đặc hiệu với globulin miễn dịch của dê. Cả hai kháng thể thứ cấp này phải được đánh dấu với cùng enzyme. Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu. Phương pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope (Boenisch và ctv, 2002). D. Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan: còn được gọi là phương pháp không đánh dấu kháng nguyên. Quá trình nhuộm cần có kháng thể sơ cấp, phức hợp miễn dịch hòa tan enzyme – kháng thể kháng enzyme và dung dịch cơ chất. Phức hợp miễn dịch được tạo ra bằng cách cho enzyme phản ứng với kháng thể của nó, loại bỏ kết tủa, thu dịch hòa tan. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó. Trước tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp. Kháng thể thứ cấp phải được bổ sung với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme. 28 Kĩ thuật này được đặt tên theo phức hợp miễn dịch enzyme sử dụng.Ví dụ: Phương pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase, APAAP (alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase) sử dụng phức hợp alkaline phosphatase – kháng alkaline phosphatase. Phức hợp PAP gồm 3 phân tử peroxidase và 2 kháng thể, phức hợp APAAP gồm 2 phân tử alkaline phosphatase và 1 kháng thể (Hình 2.8.D) (Boenisch và ctv, 2002). E. Kỹ thuật (strept)avidin-biotin: Hầu hết những phương pháp nhuộm ngày nay đều dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà) với biotin. Kỹ thuật này có độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin- biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thường được sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Phương pháp LSAB nhạy hơn phương pháp ABC (Hình 2.8.E, F) (Boenisch và ctv, 2002). Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp ABC với kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). 2.4.6. Ứng dụng phƣơng pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản Kể từ khi ra đời phương pháp IHC đã chứng tỏ tính ưu việt trong chẩn đoán bệnh, các thí nghiệm khẳng định trong nhân y (chẩn đoán bệnh ung thư vú, ung thư phổi) (Hayat, 2004), thú y và trong thủy sản hay ứng dụng trên lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về hệ miễn dịch (dùng IHC để phát hiện kháng thể kháng Enteromyxum scophthalmi (Myxozoa) trong cá bơn Scophthalmus maximus L. (Sitja-Bobadilla và ctv, 2005) Đối với thủy sản, xác định nhanh mầm bệnh quyết định tính hiệu quả trong kiểm soát bệnh. Phát hiện mầm bệnh không những quan trọng với cá nhiễm bệnh mà còn với môi trường (giữa thời kì thu hoạch và tái xuống giống) và như là một hệ thống 29 cảnh báo sớm. Ứng dụng probe kháng thể và probe/primer DNA đã có những ảnh hưởng quan trọng trong phát triển những phương pháp chẩn đoán nhanh mới (Hiney và Smith, 1998). Phương pháp IHC và một số phương pháp dựa trên kháng thể khác như miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (flourescence antibody tests – FAT), gián tiếp (indirect flourescence antibody tests – IFAT), ELISA (enzyme link immunosorbent assays) được ứng dụng trên nhiều dạng mầm bệnh khác nhau gồm vi khuẩn (Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Photobacterium damsela subspecies piscicida, Renibacterium salmoninarum, Mycobacterium spp., Vibrio anguillarum và Flavobacterium psychrophilum; (Adams và Thompson, 1990; Adams, 1995; Bakopoulos và ctv., 1997; Adams và ctv., 1996), kí sinh trùng (Morris và ctv., 1997), virus (infectious salmon anaemia virus), và rickettsia trên cá Piscirickettsia salmonis (Alday-sanz và ctv., 1994). Trong một số trường hợp các phương pháp dựa trên kháng thể rất hiệu quả và đạt được độ nhạy, độ đặc hiệu cần thiết. Tuy nhiên trong những trường hợp khác, như với mẫu nước và bệnh sau lâm sàng, cần có những phương pháp dựa trên DNA (PCR, in situ hybridisation) với độ nhạy cao hơn. Đối với tôm (tôm nước mặn và tôm nước ngọt), phương pháp IHC cũng chứng tỏ tính hiệu quả khi được ứng dụng trong chẩn đoán các loại mầm bệnh, đặc biệt là khi sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies – mAbs).  Với mầm bệnh virus, IHC dùng trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng WSSV với kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng kháng protein VP28 (Liu và ctv, 2002; Poulos và ctv, 2001; Yoganandhan và ctv, 2004), phát hiện và phân biệt các dạng khác nhau của phức hợp virus đầu vàng (Yellow head complex virus – YHV) bằng kháng thể đơn dòng V – 3 – 2B, Y – 18, Y – 19 (Soowannayan và ctv, 2003), virus hội chứng Taura (Taura syndrome virus – TSV) với kháng thể đơn dòng TSV – 1A1 (Anil và ctv, 2002; OIE, 2003).  Với mầm bệnh vi khuẩn nhiều kháng thể đơn dòng kháng các loại vi khuẩn (15 kháng thể đơn dòng kháng một dòng vi khuẩn nguy hiểm là Vibrio harveyi 639 – Phianphak và ctv, 2005) đã được xác định nhằm phát triển kĩ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch như IHC. 30 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu A. Thời gian thực hiện đề tài: 3/2005 – 8/2005. B. Địa điểm thực hiện: Phòng Mô Học - Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II (116 Nguyễn Đình Chiểu – Q.1 – Thành phố Hồ Chí Minh). 3.2. Vật liệu 3.2.1. Mẫu xét nghiệm: - 10 mẫu tôm sú thương phẩm thu từ các ao nuôi tại tỉnh Cà Mau và tỉnh Sóc Trăng (nội dung 1). Bảng 3.1. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1 Kí hiệu Nơi thu Loại mẫu Ngày thu 45D 45P 101 53 103 97 50 98 453 99 Sóc Trăng Sóc Trăng Cà Mau Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Cà Mau 30 ngày tuổi 30 ngày tuổi 3 tháng tuổi 45 ngày tuổi 3 tháng tuổi 2 tháng tuổi 28 ngày tuổi 2 tháng tuổi 50 ngày tuổi 2 tháng tuổi 10/4/2005 10/4/2005 21/1/2005 10/4/2005 21/1/2005 21/1/2005 10/4/2005 21/1/2005 17/3/2004 21/1/2005 - 25 mẫu tôm sú post-larvae chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu thu từ các trại giống ở khu vực miền Trung (Đà Nẳng, Phan Rang, Bình Định), miền Nam (Vũng Tàu, Cà Mau). 30 mẫu tôm sú thương phẩm chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu 31 thu ở các ao nuôi tại Cà Mau, Sóc Trăng, Kiên Giang, Vũng Tàu, Trà Vinh trong đó thử nghiệm PCR trên 20 mẫu, thử nghiệm IHC và Mô học trên cả 30 mẫu (nội dung 2). Bảng 3.2. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2 Tôm post-larvae Tôm thương phẩm Kí hiệu Nơi thu Ngày thu Kí hiệu Nơi thu Ngày thu 7683 7787 7661 7781 7536 7786 7718 7769 7768 7764 7684 7691 7650 7722 7725 2682 2741 2708 3122 2752 2745 12964 2794 2746 7755 Phan Rang Cà Ná Bình Định Đà Nẵng Cà Mau Cà Ná Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Vũng Tàu Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Cà Ná Cà Mau Cà Mau Cà Mau 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 14/2/2005 15/2/2005 15/2/2005 25/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 9/12/2004 19/2/2005 18/2/2005 3/7/2005 101 97 98 99 336 341 342 340 339 338 103 44 55 57 49 94 136 134 137 135 159 161 152 153 156 178 179 181 182 185 Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Kiên Giang Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Trà Vinh Trà Vinh Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Vũng Tàu Vũng Tàu Vũng Tàu Vũng Tàu Vũng Tàu 21/1/2005 21/1/2005 21/1/2005 21/1/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 21/1/2005 11/4/2005 10/4/2005 10/4/2005 10/4/2005 21/1/2005 17/2/2005 17/2/2005 17/2/2005 17/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 1/3/2005 1/3/2005 1/3/2005 32 3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC: - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đơn dòng 8B7 của chuột kháng protein WSSV VP28 (WSSV - 8B7 mAb) (4 C) - công ty Diagxotics - Kháng thể thứ cấp: Kháng thể của cừu có gắn biotin kháng kháng thể chuột (kháng thể sơ cấp) (Anti-mouse Ig biotinylated species-specific whole antibody) (4 C) - công ty Amersham Biosciences UK. - Huyết thanh cừu (Normal sheep serum) (4 C) - Công ty CalBioChem. - Streptavidine-biotinylated horseradish peroxidase complex (HRP) (4 C) - Công ty Amersham Biosciences UK. - 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (-20 C ). - Sodium azide, H2O2 30% (4 C). 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy xử lý mẫu tự động - Máy cắt microtome - Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính - Bộ phận làm lạnh mẫu - Nồi nước có điều chỉnh nhiệt độ - Bình rót paraffin Electrothermal - Kính hiển vi quang học - Găng tay y tế, lam, lamel, cassette và nắp, đèn cồn, kéo, panh, khuôn inox, micropipette, eppendoff, becher, ống đong, bình tam giác. 3.2.4. Hóa chất - Cồn 50%; 70%; 95%; 99,6%. - Chloroform, Paraffin, nước cất 2 lần, nước cất khử ion, xylene, NaCl. - Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada. 33 - Dung dịch Davidson với thành phần như sau: Cồn 95% : 330 ml Formalin : 220 ml Acid acetic glacial : 115 ml Nước cất : 335 ml - Hoá chất làm lam dương: Aceton : 250 ml (3-aminopropyl) triethoxysaline : 5 ml 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu tạo khối đầy đủ ngẫu nhiên (Randomized complete block design - RCBD). Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 7.0. Dùng trắc nghiệm LSD (Least significant different) 95% để so sánh các nghiệm thức. A. Với nội dung 1: Phát triển phương pháp IHC phù hợp với điều kiện tại Việt Nam dựa trên qui trình đề nghị của Nauwynck và cộng sự (Đại Học Gent - Bỉ) thông qua bố trí thử nghiệm:  Khả năng nhuộm màu của các nồng độ DAB khác nhau (1X; 1,5X và 2X). Thí nghiệm trên 5 mẫu, mỗi mẫu sau khi cố định trong paraffin được bố trí trên 3 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1 nồng độ.  Độ nhạy và tính đặc hiệu của mAb ở các nồng độ pha loãng khác nhau (0,5X; 1X; 1,5X và 2X). Thí nghiệm trên 10 mẫu, mỗi mẫu sau khi cố định trong paraffin được bố trí trên 4 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1 nồng độ. Kết quả được ghi nhận trên 3 đặc tính của mẫu sau khi nhuộm: Cường độ cảm nhiễm, cường độ bắt màu và độ sắc nét. Ghi chú: 1X: Nồng độ đề nghị của Đại học Gent. 34 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 Yếu tố thử nghiệm Nồng độ DAB Nồng độ mAb 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X K í h iệ u m ẫ u 45D 45D 45D 45D 45D 45D 45D 45P 45P 45P 45P 45P 45P 45P 101 101 101 101 101 101 101 53 53 53 53 53 53 53 103 103 103 103 103 103 103 97 97 97 97 50 50 50 50 98 98 98 98 453 453 453 453 99 99 99 99 B. Với nội dung 2: So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và PCR qua bố trí thử nghiệm khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV trên 25 mẫu tôm post-larvae và 30 mẫu tôm thương phẩm. Mỗi mẫu được chia thành 2 phần, một phần cố định trong cồn dùng cho PCR, phần còn lại cố định trong dung dịch Davidson cho Mô học và IHC (sau khi cố định trong paraffin, mỗi mẫu được cắt và bố trí trên 2 lam, một cho IHC và 1 cho Mô học). Kết quả được ghi nhận dựa trên tỉ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm của mẫu sau khi xét nghiệm. 35 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 Đối tƣợng Tôm post-larvae Tôm thƣơng phẩm Loại xét nghiệm PCR Mô học IHC PCR Mô học IHC K í h iệ u m ẫ u 7638 7638 7638 101 101 7787 7787 7787 97 97 7661 7661 7661 98 98 7781 7781 7781 99 99 7536 7536 7536 336 336 7786 7786 7786 341 341 7718 7718 7718 342 342 7769 7769 7769 340 340 7768 7768 7768 339 339 7764 7764 7764 338 338 7684 7684 7684 103 103 103 7691 7691 7691 44 44 44 7650 7650 7650 55 55 55 7722 7722 7722 57 57 57 7725 7725 7725 49 49 49 2682 2682 2682 94 94 94 2741 2741 2741 136 136 136 2708 2708 2708 134 134 134 3122 3122 3122 137 137 137 2752 2752 2752 135 135 135 2745 2745 2745 159 159 159 12964 12964 12964 161 161 161 2794 2794 2794 152 152 152 2746 2746 2746 153 153 153 7755 7755 7755 156 156 156 178 178 178 179 179 179 181 181 181 182 182 182 185 185 185 36 3.3.2. Quy trình thực hiện: Quy trình thực hiện gồm 3 giai đoạn chính Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (tương tự như phương pháp mô học truyền thống) Bước 1: Cố định mẫu trong dung dịch Davidson Với tôm post-larvae: Vớt tôm mẫu (còn sống) để vào mảnh vải mùng nhỏ, bỏ vào cassette và đóng nắp lại, cho trực tiếp vào dung dịch Davidson. Ngâm mẫu 24 giờ. Với tôm thương phẩm: Lấy tôm sống, cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (chứa mang và gan tụy), tiêm dung dịch Davidson vào Nhận mẫu Cố định mẫu Đúc mẫu Cắt mẫu Làm lạnh Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ Chuyển mẫu lên lam Nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi Ủ mẫu ở 400C đến khi mẫu dính chặt vào lam Xử lý mẫu 12,5 giờ 37 gan tụy và vùng xung quanh gan tụy, lượng thuốc dùng từ 0,1 – 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ chứa dung dịch Davidson. Ngâm mẫu từ 24 – 72 giờ. Hoặc có thể cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và bỏ vào dung dịch Davidson, ngâm như với tôm post-larvae. Tỷ lệ chất cố định: mẫu =10:1 Bước 2: Xử lý mẫu. Rửa nước 1 – 2 giờ dưới vòi nước chảy. Sau đó xử lý theo quy trình như hình 3.2. Quy trình này được thực hiện bằng máy. Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ. Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu Bước 3: Đúc mẫu Đặt mẫu nằm sát đáy khuôn chứa nến có tỉ lệ parafin: sáp ong = 1:5, đậy cassette lên khuôn để khi nến đông lại và dính vào cassette. Quá trình này cần có bàn nóng và bình rót nến. Đặt khuôn lên bề mặt bộ phận làm lạnh, đợi đến khi khuôn mẫu lạnh, tách khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bề mặt làm lạnh sao cho mặt cắt lạnh cứng lại. Bước 4: Cắt mẫu: Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt microtome, kích thước mỗi lát cắt là 5 μl. Bước 5: Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 400C, dùng lam dương vớt lát cắt. Cồn 70% 30 phút Cồn 95% (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Cồn 95% (2) 30 phút Cồn 95% (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ 38 Giai đoạn 2: Nhuộm lát cắt theo phương pháp IHC Bước 1: Làm mẫu dính chặt vào lam: Đặt lam chứa mẫu vào bàn ấm ở nhiệt độ 45 0C đến khi khô hết nước và mẫu không di chuyển được. Bước 2: Khử paraffin cho mô Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần Nhúng trong Tris buffer pH 7,6 + NaCl 1 lần trong 5 phút. Bước3: Ngăn hoạt động của