Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định Macrobrachium rosenbergii Noda Virus (MrNV) và Extra Small Virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)

chium rosenbergii nodavirus (MrNV) là Extra small virus (XSV) (Qian và cộng sự, 2003). 8 Hai virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) vừa đƣợc tìm thấy liên quan đến bệnh trắng đuôi (Bonami và Widada, 2003). Hiện nay chƣa có một biện pháp điều trị nào cho bệnh trắng đuôi. Vì vậy, các nông trại và bể ƣơng phải đƣợc quản lý tốt để giảm thiểu sự lan rộng của bệnh trắng đuôi. Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh MrNV có dạng lập thể 20 mặt (icosaherdral), trần không có vỏ bọc, thƣờng định vị trong tế bào chất của tế bào chủ, phát triển trong tất cả các bộ phận của tôm càng xanh bị bệnh ngoại trừ gan và tụy tạng, MrNV có kích thƣớc lớn hơn XSV và có đƣờng kính 20 - 30 nm đƣợc quan sát trong kính hiển vi điện tử (Acier và cộng sự,1999). MrNV có vật liệu di truyền là hai sợi đơn RNA (RNA -1 và RNA - 2), với kích thƣớc tƣơng ứng là 2,9 kb và 1,3 kb, và tham gia cấu trúc capsid với một chuỗi polypeptide có kích thƣớc 43 kDa. Dựa vào đặc tính và kết quả giải trình tự đoạn RNA1 của MrNV, Bonami và cộng sự (2005) đề nghị MrNV là thành viên của họ Nodaviridae, nhƣng khác biệt với hai loài Alphanodavirus và Betanodavirus. 9 Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirius (Bonami và cộng sự, 2005). Họ Nodaviridae chia làm hai nhóm: Alphanodavirus gây bệnh chủ yếu cho côn trùng và Betanodavirus gây nhiễm cho cá. Thể virus này không có màng bao, hình đa mặt, đƣờng kính 25 - 30 nm, bộ gen gồm hai sợi RNA(+) đơn. Trong đó, RNA - 1 (3,1 kb) mã hoá cho một protein không cấu trúc có kích thƣớc 100 kDa với chức năng nhƣ là RNA polymerase. RNA - 2 (1,4 kb) mã hoá cho hai phân tử protein vỏ lớn có kích thƣớc lớn khoảng 43 kDa và 41 kDa đƣợc hình thành do quá trình đồng sao chép một chuỗi polypeptide. Một RNA - 3 cũng đƣợc phát hiện trong các tế bào bị nhiễm nhƣng không tồn tại trong thể virus. Hiện nay, sản phẩm của RNA phụ này (0,4 kb) vẫn chƣa xác định chức năng (Mori và cộng sự, 1992). XSV là một satellite virus có kích thƣớc nhỏ hơn virus MrNV với đƣờng kính 15 nm, có vật liệu di truyền là RNA với chiều dài khoảng 0,8 - 0,9 kb (Qian và cộng sự, 2003). Sau khi giải trình tự bộ gen của XSV cho thấy virus có chiều dài sợi đơn RNA dài 796 nucleotide và đuôi ngắn poly (A) khoảng 15 - 20 nucleotide kết thúc ở đầu 3’(GenBank acc.no.AY247793). Phân tích protein bằng SDS - PAGE cho thấy thể XSV chứa hai polypeptide là capsid 17 kDa (CP - 17) và capsid 16 kDa (CP - 16) (Qian và cộng sự, 2003). So sánh trình tự của CP - 17 của XSV với cấu trúc protein của họ satellite virus đã biết từ trƣớc, kết quả cho thấy có sự khác biệt rất xa với họ satellite virus (Ban,1995; Zhang và cộng sự, 1991). Sự hiện diện đồng thời của XSV và MrNV trong bệnh trắng đuôi đặt ra giả thuyết là vai trò mỗi virus nhƣ thế nào trong việc phát triển cũng nhƣ trong sự phát SjNNV AhNNV GNNV beta-nodaviruses MrNV1B5A PaV alpha-nodaviruses FHV BoV NoV o V BBV 10 sinh mầm bệnh. Theo Widada và Bonami (2004) giả thuyết rằng XSV không có gen mã hoá cho RNA polymerase. Vậy yếu tố nào cung cấp và cần cho XSV cộng hƣởng. Hay XSV cộng hƣởng và làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Sự cộng hƣởng này ít thấy trong những virus. Những virus cộng hƣởng (dependovirus) này vừa đƣợc biết trong khoảng thời gian gần đây (Van Regenmortel và cộng sự, 2000), và chúng phụ thuộc vào hiệu quả sự sao chép của những virus giúp đỡ (helper virus) nhƣ adenovirus hoặc herpes virus. Những virus giúp đỡ này có đƣờng kính 20 nm, có vật liệu di truyền là ss - DNA (4,7 kb), chứa một gen DNA polymerase. Một nhóm virus khác là thể satellite virus, nhóm virus này thì sống sót khi thiếu một gen polymerase cần cho sự sao chép của chúng (Van Regenmortel và cộng sự, 2000). Điều này cho thấy là XSV sử dụng enzym RNA polymerase của MrNV nhƣng XSV sẽ mã hoá một chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầm bệnh của MrNV thì không biết đƣợc (Widada và Bonami, 2004). Nhƣng XSV thiếu một enzym sao chép thì XSV thật sự là một satellite virus (Widada và Bonami, 2004). XSV liên quan gần phân nhóm 2 (tobacoo nercrosis satellite virus - like) hơn là phân nhóm 1 (chronic bee - paralysis associated satellite virus - like) của satellite virus. Đến bây giờ các nhà khoa học chỉ quan sát đƣợc những satellite virus trong những ký chủ là thực vật. XSV là kiểu virus satellite đầu tiên đƣợc báo cáo là gây bệnh trong động vật. XSV cũng đƣợc ghi nhận là satellite-nodavirus cộng hƣởng đầu tiên (Widada và Bonami, 2004). 2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐUÔI TRẮNG DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG XANH 2.3.1. Phƣơng pháp mô học. Mẫu phải đƣợc cố định trong Davidson trong 24 giờ. Cắt thành từng lát mỏng rồi đặt trên lam kính, nhuộm bằng Pryonin methyl green, đậy lam và quan sát tiêu bản trên kính hiển vi thấy thể vùi của virus có hình mắt lƣới trong mô tế bào kế cận của tất cả các cơ quan và các mô (Tung và cộng sự, 1999). Thể vùi của virus MrNV nằm trong nhân tế bào hồng cầu bắt màu xanh với thuốc nhuộm Pryonin methyl green (Tung và cộng sự, 1999). 11 2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot - blot Probe sử dụng trong phƣơng pháp lai Dot - blot là một đoạn DNA thu đƣợc từ RNA - 1 của MrNV. Đoạn DNA đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp PCR với tác nhân digoxygenine. Probe này lai với đoạn RNA - 1 từ mô bị nhiễm hoặc từ dịch chiết virus. Mỗi mẫu (1 l) là mỗi điểm trên màng lai. Sau khi qua các công đoạn xử lý bằng dung dịch lai (hybridization) và tiền lai (prehybridization), mẫu dò đƣợc thêm vào để quá trình lai xảy ra, rửa phần mẫu dò không lai ra khỏi màng lai. Tiếp đó thêm vào phản ứng kháng thể kháng DIG (anti digoxygenine antibody) có gắn enzyme alkaline phosphatase, ở quá trình này nếu có sự hiện diện của mẫu dò thì kháng thể sẽ kết hợp với mẫu dò. Cuối cùng loại bỏ phần kháng thể không phản ứng và thêm cơ chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng lai. Phản ứng dƣơng tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi có RNA của MrNV trên màng lai (Widada và cộng sự, 2003). 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) Mẫu tôm càng xanh đƣợc cố định Davidson và đƣa vào trong paraffin. Mẫu tôm đƣợc cắt khoảng 7 m và đƣợc đặt trên lam kính và đƣợc làm khô trong tủ sấy ở (60 0C). Lát cắt qua nhiều bƣớc xử lý, cho lai với mẫu dò DNA đƣợc đánh dấu digoxigenin có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti - Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Sau bƣớc này những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc gắn thêm Anti - DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. Sau bƣớc rửa Anti - DIG thừa và nhuộm màu, quan sát dƣới kính hiển vi thấy những tế bào kết tủa màu tím đen, màu này cho biết sự hiện diện tƣơng ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính có màu vàng cam sau quá trình lai. Việc kết tủa đã đƣợc quan sát trong tế bào chất, vài phản ứng dƣơng thì cũng đƣợc quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử. Không có dấu hiệu của virus đƣợc quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mô ống tiêu hoá và biểu bì cơ (Widada và cộng sự, 2003). 12 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV (Widada và cộng sự, 2003). Hình a: tổng thể phần đầu ngực của tôm postlarvae bị nhiễm MrNV. Phần 1a: vùng mang không bị nhiễm có màu vàng cam. Phần 2a: vùng đầu ngực bị nhiễm MrNV có màu tím đen. Phần 3a: vùng tụy tạng không bị nhiễm có màu vàng cam Hình b: lai dƣơng tính với những sợi cơ. phần 1b: vùng cơ bị nhiễm MrNV có màu tím đen. 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) Kỹ thuật này phát triển bởi Romestand và Bonami (2003) để chẩn đoán bệnh trắng đuôi của tôm càng xanh, nguyên nhân gây ra bởi MrNV. Kháng thể đa dòng sản xuất bằng gây sự miễn dịch trên chuột Balb/C và sau đó tinh sạch dung dịch nổi của virus và kháng thể kháng MrNV, dịch nổi chứa kháng thể kháng MrNV đƣợc tinh sạch từ dịch tràng ở màng bụng của chuột. Kháng thể đầu tiên bắt kháng nguyên và kháng thể thứ hai có gắn cơ chất, dƣới tác dụng của enzym avidin - peroxidase conjugate phản ứng với cơ chất tạo màu, sự tạo màu này cho thấy phản ứng xảy ra. Đây là một phƣơng pháp chẩn đoán bệnh trắng đuôi nhanh, độ đặc hiệu và độ nhạy cao. 2.3.5. Phƣơng pháp PCR 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR 2a 3a 1a 1b 13 Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 cho phép làm tăng bội DNA cần đƣợc nghiên cứu. PCR đƣợc thực hiện in vitro theo con đƣờng enzyme (Bùi Trang Việt, 2002). Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase. Thực vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ngƣợc (antisnes primer). 2.3.5.2. Phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính cao hơn Tm của phân tử; thƣờng là 94 - 950C trong 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách thành mạch đơn. Bƣớc 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây. Bƣớc 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ đƣợc tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bƣớc này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Một phản ứng PCR không vƣợt quá 50 chu kỳ. Vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lƣợng bản mẫu ban đầu. 2.3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 14 DNA mẫu: Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Ngoài ra phƣơng pháp PCR còn có một số ƣu điểm là có thể khuếch đại cả những mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt. Enzyme Taq - polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. Enzym này không bị phá huỷ bởi nhiệt biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Tth polymerase là một enzym tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động nhƣ một enzym phiên mã ngƣợc khi có mạch RNA khuôn và ion Mn++, nhƣng với sự hiện diện của của DNA khuôn và ion Mg ++ , Tth - polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA. Enzym này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. Nồng độ enzyme tối ƣu trong khoảng 1 -> 5 đơn vị trên một phản ứng. Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng, chuyên biệt và có đặc hiệu cao. Việc chọn mồi phải tuân theo một số nguyên tắc:  Trình tự của mồi đƣợc chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác nhau của một mồi.  Nhiệt độ nóng chảy của mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, không cách nhau quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp G - C lặp lại quá nhiều lần.  Các mồi chọn cần phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Trình tự nằm giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc” không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ƣu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb. 2.3.5.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. 15 Mg 2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg2+ ảnh hƣởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ tối ƣu Mg2+ phải đƣợc xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 2.3.5.5. Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR. Trong thực tế sử dụng, số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR không vƣợt quá 40 chu kỳ do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp thƣờng có khuynh hƣớng kết hợp với nhau, kết quả là hiệu quả khuếch đại càng về sau càng giảm vì những nguyên nhân sau:  Sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng.  Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng.  Các bản sao kết hợp với nhau. 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) Phƣơng pháp RT - PCR là sự kết hợp giữa phƣơng pháp phiên mã ngƣợc và phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này có thể phát hiện các mRNA tồn tại với lƣợng rất thấp, mà không thể phát hiện bằng phƣơng pháp nhƣ Northern blot. Ngoài ra, RT-PCR kết hợp với kỹ thuật RFLP có thể dễ dàng phát hiện ra các đột biến và sự đa hình trong đoạn khuếch đại và xác định độ dài của gen biểu hiện khi một mRNA quan tâm biểu hiện ở mức độ rất thấp. Nhờ RT - PCR sẽ khuếch đại mRNA bình thƣờng và mRNA đột biến tạo thành các DNA, sau đó dùng cùng loại men cắt giới hạn, DNA bình thƣờng phân biệt với DNA đột biến qua sự sai biệt trọng lƣợng phân tử (Bùi Trang Việt, 2002). Do Taq polymerase sử dụng trong bƣớc PCR không hoạt động trên RNA nên trƣớc hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Sau đó cDNA sẽ đƣợc nhân bản nhờ Taq polymerase (Walker, 2000). Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm đƣợc nhận biết qua điện di trên gel agarose. 16 Các phương pháp khuếch đại RNA bằng PCR  Oligo (dT) bắt cặp với đuôi poly (A) trên mRNA của động vật hữu nhũ , có thể dùng nhƣ mồi ngƣợc không đặc hiệu để tổng hợp sợi cDNA đầu tiên. Sau đó, phản ứng khuếch đại bằng PCR sẽ rất có hiệu quả khi bổ sung thêm một hoặc nhiều mồi xuôi đặc hiệu cho vùng gen mong muốn (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Sự tổng hợp sợi cDNA đầu tiên có thể đƣợc thực hiện bằng một đoạn mồi oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu (gene - specific priming, GSP) với vùng đã đƣợc chọn trên sợi RNA hoặc mRNA đặc trƣng GSP đƣợc gọi là mồi ngƣợc, sự khuếch đại sau đó sẽ đƣợc bổ sung thêm một mồi xuôi tƣơng thích với trình tự đặc hiệu trên cDNA (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Một đoạn gồm 6 nucleotide ngẫu nhiên có thể dùng làm mồi để tổng hợp cDNA tại nhiều điểm dọc theo sợi RNA mẫu, tạo ra nhiều đoạn bản sao khác nhau trên toàn bộ phân tử RNA. Phƣơng pháp này rất hữu dụng để khuếch đại sợi RNA quá dài hoặc chứa nhiều cấu trúc bậc hai không thể tổng hợp bằng oligo (T) hoặc GSP (Lee và Caskey, 1990). Trong việc chẩn đoán bệnh trắng đuôi, phƣơng pháp Single - Step RT - PCR dùng để khuếch đại RNA của hai virus ở trong cùng dung dịch tách chiết (Widada , 2003, 2004 ; Sahul Hameed, 2004a và cộng sự). Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành bằng cách phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn gen mong muốn trong một ống phản ứng đơn cho mỗi virus (single reaction tube) bằng một chu kỳ nhiệt không liên tục. Kỹ thuật này phát hiện MrNV bằng cách sử dụng một cặp mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R đặc hiệu cho RNA - 2 của MrNV đƣợc thiết kế từ trình tự của bộ gen MrNV (Genbank accession no. AY222840) (Widada, 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). Phát hiện XSV bằng cách cặp mồi XSV - F và XSV - R đƣợc công bố (Widada và cộng sự, 2004). Nguyên tắc phản ứng giống (hình 2.4) sử dụng hai mồi MrNV - RNA2 - R và XSV - R là hai mồi ngƣợc sẽ bắt cặp với tƣơng ứng với RNA của từng virus, sau đó sẽ tạo cDNA trong một thời gian, rồi gia nhiệt để bất hoạt enzym phiên mã ngƣợc, chu kỳ tiếp tục đƣợc thực hiện cùng với hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R và XSV - F và XSV - R cho từng virus. Kích thƣớc sản phẩm khuếch đại 681 bp là MrNV và 500 bp là XSV. 17 18 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR ( Dieffenbach và Dveksler, 1995;Widada , 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). RNA tách chiết Tổng hợp cDNA MrNV XSV Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tiếp tục chu kỳ Tiếp tục chu kỳ 681 bp 500 bp 19 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR (Widada, 2003, 2004; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a) trên mẫu tôm càng xanh bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.  Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR nhƣ phƣơng pháp tách chiết, nồng độ mồi, nhiệt độ lai của mồi.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa. 3.1.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Thời gian nghiên cứu: từ 7/3-7/8/2005. Địa điểm thực hiện: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.2. VẬT LIỆU 3.2.1. Mẫu tôm Các mẫu tôm càng xanh gồm: 30 mẫu ấu trùng, 2 mẫu postlarvae và 10 mẫu tôm mẹ thu tại trại Thực Nghiệm Thủ Đức, 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL. Trong các mẫu chúng tôi thu đƣợc có 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae có triệu chứng lâm sàng bệnh trắng đuôi . Các mẫu tôm càng xanh đƣợc bảo quản trong tủ âm - 700C. 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình Mồi đƣợc thiết kế bởi tác giả Yoganandhan và cộng sự (2005) dựa trên trình tự của RNA virus (MrNV: Ac No. AY222840; XSV Ac No). Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR Virus Primer Trình tự GenBank AC Kích cỡ sản phẩm MrNV MrNV-RNA2-F 5’-GATACAGATCCACTAGATGACC-3’ AY222840 681 bp MrNV-RNA2-R 5’-GACGATAGCTCTGATAATCC-3’ XSV XSV-F 5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’ 500 bp XSV-R 5’-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3’ 20 3.2.3. Hạt bead RT - PCR: READY - TO - GO (Chế phẩm sử dụng ngay) Sản phẩm này do công ty Amersham pharmacia biotech, Mỹ sản xuất. Đây là chế phẩm có sẵn các thành phần để thực hiện phản ứng RT - PCR, khi sử dụng ta chỉ cần thêm bản mẫu và mồi sử dụng . Mỗi loại hạt Bead đƣợc thiết kế cho một phản ứng với thể tích cuối 50 µl. Thành phần của hạt bead gồm:  2 đơn vị Taq DNA polymerase  10 nM Tris - HCL (pH 9, nhiệt độ phòng)  60 nM KCl  1.5 mM MgCl2  20 M mỗi loại dNTP  M - MulV Reverse Transcriptase  RNA guard TM  Ribonuclease Inhibitor và chất ổn định không chứa Rnase/DNase 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit. Bộ Kit này do công ty Bio - Rad sản xuất, dùng để tinh sạch RNA từ những tế bào vi khuẩn và mô động vật. Thành phần của Bộ Kit gồm :  RNA Lysis Solution  Protein/DNA Precipitation Solution  RNA Hydration Solution 21 3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III STT vạch Kích thƣớc (bp) 1 1353 2 1078 3 872 4 603 5 310 6 281 7 271 8 234 9 194 10 118 11 72 3.2.6. Hoá chất khác Trizol Phenol (pH 4) Guanidine thiocyanate 0,8 M Ammonium thiocyanate 0,4 M Sodium acetate, pH 5, 0,1 M Glycerol 5%  Ethanol 75%  Isopropanol 100%  Chloroform  DEPC (Diethyl Prycacbonat)  Ethidium bromide  Dung dịch đặt mẫu (bromophenol blue 0,25%, glycerol 40%, Tris HCL 200 mM, EDTA 200 mM)  Agarose.  TBE 1X (Tris - boric acid 40 nM, EDTA 0,1 mM). 22  Nƣớc cất 2 lần có sử lý DEPC 1% (DEPC - H2O) 3.2.7. Dụng cụ và thiết bị  Tủ cấy vô trùng (Laminar-Box)  Tủ lạnh - 200C (Liebherr)  Tủ sấy dụng cụ 1500C (Gallenkamp)  Máy Vortex (Zx3 Velp)  Máy ly tâm lạnh 15000 vòng/ phút (certrifuge 5415 C)  Máy PCR (Thermocycle - Biorad)  Bộ điện di (Biorab Hybaid)  Bàn đọc UV (White/UV Transillminator)  Pipetteman các loại 0,5 - 1000 l  Eppendorf các loại 0,2 - 0,5 ml.  Cân phân tích  Kéo, đèn, cồn, chày nhựa sử dụng một lần. 3.3. PHƢƠNG PHÁP 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus 3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số bằng Trizol theo Peter Walker và cộng sự (2000). Nghiền khoảng 100 mg mô trong 1ml Trizol. Ủ nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm vào 200 l Chloroform. Vortex 20 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi có chứa RNA vào ống eppendorf 1,5 ml khác (hút khoảng 600 l cho mỗi ống).Thêm vào mỗi ống 600 l Isopropanol lạnh. Ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút (qua đêm - 200C hay để - 700C trong 1 giờ). Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Rửa cặn RNA bằng 1 ml Ethanol 70%. Vortex, ly tâm 7500 vòng trong 5 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Làm khô cặn RNA ở 550C. Hòa cặn RNA trong 50 l H20 - DEPC. Sau đó bảo quản - 20 0 C. 23 3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio - Rad) Lấy 5 - 10 mg mô tƣơi. Nghiền mẫu trong eppendorf với 300 l RNA Lysis. Thêm vào 100 l dung dịch Protein - DNA để phá vỡ tế bào. Đảo ngƣợc ống 10 lần và ủ trên nƣớc đá 5 phút. Ly tâm lạnh (40C) ở 13000 vòng trong 6 phút, kết tủa protein và DNA sẽ có màu trắng. Hút dung dịch nổi chứa RNA (loại bỏ lớp dƣới) vào eppendorf 1,5 ml sạch chứa 300 l 100% Isopropanol (trên đá). Đảo ngƣợc ống 20 - 25 lần. Ly tâm 13000 vòng trong 6 phút (40C) (RNA sẽ thấy dƣới dạng kết tủa sáng). Đổ bỏ dung dịch nổi và làm ráo nƣớc trên giấy thấm, cho vào 300 l 70% ethanol và đảo ống vài lần để rửa RNA. Ly tâm ở 13000 vòng trong máy ly tâm khoảng 2 phút (40C). Đảo và làm ráo nƣớc trên giấy thấm sạch và cho không khí làm khô 10 - 15 phút. Thêm 50 l dung dịch RNA Hydration. Ủ 30 phút trên nƣớc đá (hoặc trữ - 700C -> - 800C đến khi sử dụng). Trƣớc khi sử dụng vortex mạnh 5s và spin down hoặc trộn mẫu lên xuống vài lần. 3.3.2. Phƣơng pháp SINGLE - STEP RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV Trƣớc khi tiến hành phiên mã ngƣợc, RNA bản mẫu phải biến tính ở 700C trong 10 phút nhằm phá vỡ toàn bộ cấu trúc bậc một và hai cho RNA của từng virus. Tiếp đó, quá trình phiên mã ngƣợc đƣợc tiến hành cho hai Mix riêng biệt của MrNV, XSV trong eppendorf có bổ sung hạt Bead ở điều kiện 520C trong 30 phút. Thành phần hai Mix sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV: Bảng 3.3: Thành phần hai Mix của phản ứng Single - Step RT - PCR Hai virus Thành phần của hai Mix Tổng Thể tích ( 50 l ) MrNV H20 – DEPC 43 l MrNV -RNA2-F (20 pmol/ l) 1 l MrNV-RNA2-R (20 pmol/ l) 1 l Bản mẫu 5 l XSV H20 – DEPC 43 l XSV - F (20 pmol/ l) 1 l XSV - R (20 pmol/ l) 1 l 24 Bản mẫu 5 l Kết thúc quá trình phiên mã ngƣợc, dung dịch phản ứng đƣợc biến tính ở 940C trong 2 phút nhằm ức chế enzym phiên mã ngƣợc. Sau đó thực hiện quá trình khuếch đại acid nucleic bằng phƣơng pháp PCR hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R cho MrNV, XSV - F và XSV - R cho XSV trong 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm:  Giai đoạn biến tính: 940C trong 40s  Giai đoạn bắt cặp: 550C trong 40s  Giai đoạn kéo dài mạch: 680C trong 1 phút  Hỗn hợp cuối của phản ứng đƣợc duy trì ở: 680C trong 10 phút Sản phẩm tạo thành có kích thƣớc 681 bp của MrNV và 500 bp của XSV. 3.3.3. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI ACID NUCLEIC TRÊN GEL AGAROSE Phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic trong dung dịch. Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của acid nucleic phụ thuộc phần lớn vào hai chỉ tiêu: kích thƣớc của acid nucleic và nồng độ của chất cấu thành gel. Gel agarose thƣờng rất thông dụng để phân tách một đoạn có kích thƣớc khoảng 0.5 - 10 Kb. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau. Để đọc kết quả điện di ng