Khóa luận Ứng dụng phương pháp In Situ Hybridization để chẩn đoán mầm bệnh WSSV (White Spot Syndrome Virus) trên tôm sú (Penaeus monodon) và TSV (Taura Syndrome Virus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate) tạo phản ứng với enzyme alkalin phosphatase có gắn trên AntiDIG, sau phản ứng tạo kết tủa màu xanh khi nhìn dƣới kính hiển vi quang học. Trong một số quy trình, AntiDIG không đƣợc gắn với enzyme nên muốn phát hiện tín hiệu sau khi lai ta phải nhờ vào cộng hợp enzyme với kháng thể thứ cấp kháng lại AntiDIG. Hệ thống sử dụng Enzyme: Trƣớc hết mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase (DNA và các enzyme này hình thành một phức hợp bền vững). Sau quá trình lai, ngƣời ta cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất của hai enzyme và cơ chất đó có khả năng phát sáng khi bị biến đổi. Ánh sáng phát ra sẽ in dấu ấn lên một phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim. Hệ thống dùng chất phát quang bằng phản ứng hóa học: ngƣời ta dùng các chất hóa học có khả năng phát sáng để đánh dấu vào probe và phát hiện chúng bằng cách đo ánh sáng phát ra bằng một máy đo đặc hiệu. 23 Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc thể của nấm Thinopyrum ponticum Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Ngân hàng gen (tức tập hợp các dòng vi khuẩn tái tổ hợp) đƣợc trải trên mặt thạch của đĩa petri. Sau khi các khuẩn lạc đạt kích thƣớc xác định, ngƣời ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai lên mặt các khuẩn lạc. Trƣớc khi thực hiện thao tác này, cả đĩa thạch và màng lai đều phải đƣợc đánh dấu trƣớc để làm căn cứ đọc kết quả sau này. Khi áp màng lai lên mặt các khuẩn lạc, mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai. Màng lai sau đó đƣợc xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA. Việc cố định DNA trên màng lai và thao tác lai diễn tiến theo các bƣớc tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp lai trên pha rắn nhƣ Southern Blot và Northern Blot. Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên đĩa petri ban đầu. Dòng vi khuẩn này sau đó đƣợc thu nhận và thực hiện các phân tích khác. II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể Phƣơng pháp lai này cung cấp những thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình tự DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò (probe) chuyên biệt. 24 Các nhiễm sắc thể thƣờng có nguồn gốc từ các bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ đƣợc xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame. Sau công đoạn loại bỏ RNA bằng RNase và loại bỏ protein bằng Proteinase K, nhiễm sắc thể cố định trên lame đƣợc đem lai với probe có đánh dấu phóng xạ. Trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện phân tử lai, ngƣời ta phủ lên lame một huyền dịch nhạy cảm với tia xạ. Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lame đƣợc đem quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai. II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô Trong tế bào và mô, các DNA và RNA đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định. Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng nhƣ tƣơng tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô. Nghiên cứu trên DNA và RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể. Trong trƣờng hợp đó ngƣời ta thƣờng hay sử dụng phƣơng pháp lai trên tế bào và mô. Mô đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp mô học (cố định, khử nƣớc, tẩm paraffin, cắt thành từng lát mỏng, đính trên lame) và dùng để thực hiện lai. Thao tác xử lý mẫu lai và phát hiện phân tử lai tƣơng tự nhƣ lai trên nhiễm sắc thể. Kết quả đƣợc đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi quang học. Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp sau: Đối tƣợng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau nhƣ não bộ. Ở đây ngƣời ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của một DNA hay mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức. Các thông tin này sẽ góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó. Các phƣơng pháp miễn dịch tế bào cho phép phát hiện một protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trƣng của nó. Khi phối hợp phƣơng pháp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, ngƣời ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó. Từ đó xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen. 25 Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần nhƣ đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, ngƣời ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tƣơng tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống. Hiện nay kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn. Điều này đã tạo những bƣớc nhảy vọt lớn cho các phƣơng pháp lai tại chỗ, đặc biệt là cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau. II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH Phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phƣơng pháp tạo dòng. Định vị một gen xác định trên nhiễm sắc thể. Nghiên cứu sản phẩm phiên mã và dịch mã của một gen xác định trong mô hay tế bào, từ đó giúp ngƣời ta chẩn đoán đƣợc các bệnh nguy hiểm trên ngƣời nhƣ bệnh ung thƣ, bệnh viêm gan…Đây là một hƣớng ứng dụng rộng rãi nhất của phƣơng pháp ISH. II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura Mở đầu là công trình nghiên cứu về loại mô đích của virus gây bệnh đốm trắng do Lo và ctv thực hiện. Họ đã gây nhiễm nhân tạo virus gây bệnh đốm trắng WSBV (White spot baculovirus) trên tôm sú và đạt tỷ lệ nhiễm 100%. Sau 40 giờ nhiễm, họ phát hiện virus gây bệnh bằng phƣơng pháp In Situ hybridization và xác định đƣợc mang và gan tụy là cơ quan đích của virus này. Các kết luận sau đó cho rằng mô đích của virus đốm trắng chính là các mô có nguốn gốc trung bì (Lo và ctv, 1996). Một nghiên cứu khác của nhóm là sử dụng kỹ thuật PCR, Dot Blot và Southern Blot để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng cũng thu đƣợc nhiều kết quả tốt (Lo và ctv, 1996). Arun K. Dhar, Michelle M. Roux và Kurt R. Klimpel (2001) đã sử dụng kỹ thuật Real – Time Quantitative PCR và SYBR Green Chemistry để phát hiện và định lƣợng WSSV nhiễm trên Penaeus sp. Qua kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học 26 đã xác định đƣợc phƣơng pháp SYBR Green PCR phát hiện virus đốm trắng nhanh, nhạy và định lƣợng đƣợc lƣợng virus nhiễm vào tôm chính xác nhất. Các nghiên cứu về bệnh Taura và virus TSV thì tƣơng đối ít hơn, Nunan L.M., Poulos B.T., Lightner D.V, 1998 đã dùng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện virus TSV. Trong thí nghiệm này, họ đã sử dụng primer tạo ra từ một đoạn cDNA trên genome của TSV và khuếch đại đƣợc một gen có kích thƣớc 231 bp. Bằng kỹ thuật này, nhóm nghiên cứu đã phát hiện đƣợc TSV khi gây nhiễm thực nghiệm trên P. vannamei và P. stylirostris. Một nhóm nghiên cứu khác gồm Erickson H.S., Zarain-Herzberg M., Lightner D.V. đã thực hiện nghiên cứu các phƣơng pháp khác nhau để chẩn đoán và phát hiện TSV trên tôm thẻ nói chung. Qua thí nghiệm này nhóm đã đƣa ra các phƣơng pháp hiện nay có thể áp dụng để chẩn đoán TSV nhƣ RT – PCR, Western blot, Immuno – dot blot, Immunohistochemistry và In Situ hybridization (11 – 2002). II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản Trong thủy sản mà đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh nguy hiểm trên tôm, ngoài các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng trƣớc đây thì ISH đã phát huy đƣợc thế mạnh của một phƣơng pháp chẩn đoán mới, hiệu quả cao. Một loạt các thí nghiệm đã đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp ISH nhƣ phân biệt các dòng Baculovirus BP – type khác nhau (Durand S., Lightner D.V., Bonami J.R., 1998); phát hiện Piscirickettsia salmonis trên họ cá hồi (Venegas C.A., Contreras J.R., Larenas J.J. và Smith P.A., 2004); phân tích quần thể vi khuẩn cộng sinh với loài chình nuôi và đã xác định đƣợc 27 dòng Vibrio spp (Moreno Y., Arias C.R., Meier H., Garay E., Aznar R., 1999); phát hiện Macrobrachium rosenbergii nodavirus trên tôm càng xanh (Sri Widada J., Durand S., Cambournac I., Richard V., Bonami J.R. và ctv, 2003); phát hiện virus đốm trắng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm he, cua và tôm hùm (Poh-Shing Chang, Hsiao-Chao Chen, Yu-Chi Wang, 1998)… II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này Hiện nay, phƣơng pháp ISH đã đƣợc ứng dụng rộng rãi và đã đƣợc phát triển thêm một bƣớc mới, ngƣời ta có thể đồng thời phát hiện nhiều trình tự đích khác nhau trên cùng một mẫu mô hoặc tế bào bằng cách lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với nhiều tác nhân khác nhau. Các tín hiệu sau khi lai sẽ đƣợc phát hiện dựa vào các phản 27 ứng tạo màu khác nhau. Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp dùng nhiều probe này là các trình tự đích này nằm trùng với nhau trên mẫu mô nên rất khó khăn khi phân biệt, làm sao để phân biệt các tín hiệu tạo ra do nhiều probe cùng liên kết với cùng một vị trí trên mô. Để khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này, ngƣời ta gắn các chất nhuộm huỳnh quang vào các probe, các chất nhuộm huỳnh quang này phát ra tín hiệu ở các bƣớc sóng khác nhau, dựa vào đó ngƣời ta phát hiện các probe sau khi lai (Paddock, 2001). CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm  Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005.  Địa điểm thực hiện thí nghiệm tại phòng Mô học Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ (TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB) trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh. III.2 Vật liệu sinh học 1. Đối tƣợng thí nghiệm là P. monodon và P. vannamei ở các dạng sau: Tôm thƣơng phẩm Tôm giống Postlarvae 2. Các mẫu tôm sú P. monodon đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định dƣơng tính với WSSV. 3. Các mẫu tôm TCT P. vannamei đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định dƣơng tính với TSV. 4. Các mẫu tôm sú và TCT ở dạng postlarve hay thƣơng phẩm có các dấu hiệu bệnh lý đƣợc lấy từ các trại giống và các ao nuôi thƣơng phẩm ở các tỉnh ĐBSCL và Phú Yên. Các mẫu này đƣợc thực hiện chẩn đoán đồng thời ba phƣơng pháp mô học, PCR và ISH. III.3 Hóa chất thí nghiệm III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ 28 Đệm PBS đậm đặc 10 lần (10X PBS Buffer) Proteinase K (dạng bột) Đệm PBS 1 lần (1X PBS Buffer) Đệm PBS/Glycine đậm đặc 10 lần (10X PBS/Glycine Buffer) Dung dịch lai (Hybridization Solution) Đệm SSC đậm đặc 30 lần (30X SSC Buffer) Dung dịch đệm ngăn ngừa phản ứng dƣơng tính giả đậm đặc 10 lần (10X Blocking Buffer) Dung dịch kháng Digoxigenin (Anti – Digoxigenin/AP Conjugate Solution) Đệm TBS đậm đặc 10 lần (10X TBS Buffer) Dung dịch phát triển màu (Development Solution) Đệm dừng phản ứng (Stop Buffer) Mẫu đối chứng dƣơng Mẫu đối chứng âm Trong đó, thành phần của dung dịch lai gồm: Probe đánh dấu DIG (Digoxigenin) SSC 4X (Sodium Chloride/Sodium Citrate) buffer Formamide 50% Denhardt’s (Bovine Serum Albumin, Ficoll 400, PVP) Dextran Sulfate 5% DNA cá hồi 0,5 mg/l Thành phần bộ kit chẩn đoán WSSV và TSV hầu nhƣ giống nhau chỉ khác nhau ở thành phần của dung dịch lai. Đối với bộ kit chẩn đoán WSSV, dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh đốm trắng và bộ kit chẩn đoán TSV thì dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh Taura. III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng không có trong bộ kit chẩn đoán 29 Cồn tuyệt đối, xylene hoặc chất thay thế xylene, nƣớc cất hai lần, chloroform, paraffin, formalin, formaldehyde 37%, acid acetic nguyên chất, paraformaldehyde dạng bột, Bismark Brown Y dạng bột, keo dán (Boume du Canada). Các loại hóa chất này mua từ công ty Prolabo và Merck, có độ tinh khiết cao. III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm III.4.1 Thiết bị thí nghiệm Máy xử lý mẫu tự động, bình rót paraffin, Electrothermal, bàn lạnh, máy cắt mẫu Microtome, bể nƣớc ấm có chỉnh nhiệt độ, bàn ấm cố định mẫu trên lame kính, tủ ấm có chỉnh nhiệt độ, buồng ẩm chuyên dụng cho lai tại chỗ Slide Moat, tủ lạnh âm 20 0C và tủ mát 40C – 70C, kính hiển vi quang học. III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm Cassette chứa mẫu có nắp đậy, khung inox dùng để đúc mẫu, lame và lamelle, ống eppendorf, bếp điện và nồi cách thủy, nhiệt kế, cân phân tích, hủ nhuộm mẫu, micropipette loại có thể tích 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl, tip có đầu lọc 100µl và 1000 µl, các loại pipette có thể tích 1ml, 5 ml, 10 ml, giấy lọc Whatman #1, lame dƣơng và các dụng cụ cần thiết khác. III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit III.5.1 Chuẩn bị hóa chất Pha loãng các hóa chất có trong bộ kit về nồng độ làm việc nhƣ PBS 1X, PBS/Glycine 1X, SSC 2X, SSC 1X, SSC 0,5X, Blocking buffer 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, cồn 95%, cồn 80%, cồn 50%. Tất cả các dung dịch trên đƣợc pha loãng trong nƣớc cất hai lần. Chuẩn bị Proteinase K bằng cách dùng pipette hút 1 ml đệm PBS 1X có sẵn trong bộ kit cho vào lọ Proteinase K nguyên chất rồi hút 1 ml của lọ Proteinase K cho vào lọ đựng đệm PBS 1X, trộn hai hóa chất này hòa đều vào nhau. Sau cùng ta phân dung dịch vừa thu đƣợc vào các eppendorf và trữ ở -200C, 1 ml cho mỗi eppendorf. Pha dung dịch paraformaldehyde 0,4% bằng cách thêm 0,2 gram bột paraformaldehyde vào 50 ml đệm PBS 1X, khuấy đều dung dịch ở 370C cho đến khi nào paraformaldehyde hòa tan hoàn toàn. Sau đó trữ dung dịch ở 2 – 70C và dùng trong 2 tuần. 30 Pha dung dịch Bismark Brown Y 0,5% bằng cách thêm 0,5 gram bột Bismark Brown Y vào 100 ml nƣớc cất, hòa tan bột rồi lọc qua giấy Whatman#1. Trữ dung dịch này trong bình xám ở nhiệt độ phòng. Các dung dịch PBS 1X, PBS/Glycine 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, Blocking buffer 1X, paraformaldehyde 0,4% trữ ở 2 – 70C dùng trong 2 tuần. Cồn đã pha loãng và các dung dịch SSC có thể giữ đƣợc một tháng ở nhiệt độ phòng. III.5.2 Chuẩn bị mẫu III.5.2.1 Cố định mẫu Mẫu tôm tiến hành thí nghiệm là tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm. Mẫu tôm dùng để phân tích phải còn sống hoặc đang còn trong tình trạng hấp hối.  Để phát hiện WSSV thì mẫu tôm phải đƣợc cố định trong dung dịch Davidson, thành phần gồm: Cồn 95% 330 ml Formalin 220 ml Acid acetic glacial 115 ml Nƣớc cất 335 ml  Để phát hiện TSV thì mẫu tôm phải đƣợc cố định trong dung dịch không acid R-F (RNA – friendly): Formaldehyde 37% 349ml Cồn 95% 407 ml Nƣớc cất 244 ml Chỉnh pH = 7 Ngâm mẫu cố định từ 12 – 24 giờ, sau đó lấy mẫu ra khỏi dung dịch cố định, rửa với nƣớc 1 – 2 giờ và đem xử lý mẫu. III.5.2.2 Cách xử lý mẫu: Mẫu sau khi rửa, ta tiến hành xử lý theo quy trình sau: 31 Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trƣớc khi thực hiện chẩn đoán Tổng thời gian xử lý mẫu: 12,5 giờ Paraffin đƣợc dùng trong quy trình xử lý mẫu này là hỗn hợp với sáp ong theo tỷ lệ 5 paraffin : 1 sáp ong. III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin Đặt mẫu đã xử lý vào khuôn inox, dùng bình rót paraffin (5 paraffin : 1 sáp ong) vào khuôn chứa mẫu, cố định các mẫu sao cho nó nằm yên dƣới đáy và tách rời nhau. Sau đó đặt khuôn inox chứa mẫu và paraffin lên bề mặt của dụng cụ làm lạnh, đợi khuôn lạnh khối paraffin chứa mẫu đã cứng và tách khối paraffin ra khỏi khuôn. III.5.2.4 Cắt mẫu Dùng máy cắt Microtome cắt mẫu thành từng lát dày 5 – 6 m. Mẫu cắt đƣợc trải lên lame, nhỏ vài giọt cồn 70% lên mẫu rồi cho mẫu qua bể chứa nƣớc 400C để làm căng bề mặt mẫu. Sau đó đính mẫu lên lame dƣơng và giữ ấm ở 400C trong 4 – 6 giờ mới thực hiện chẩn đoán. III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit III.5.3.1 Ngày thứ nhất Cố định lát cắt mô trên lame kính bằng cách ủ lame ở 600C trong 30 phút. Xử lý mẫu trƣớc khi lai  Dùng xylene để khử paraffin trong mẫu, loại bỏ xylene trong mẫu bằng cồn tuyệt đối. Sau đó, ta giảm dần độ cồn và rửa lại nƣớc cất nhiều lần để đảm bảo mẫu tinh sạch. Cồn 70% 30 phút Cồn 95% (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Cồn 95% (2) 30 phút Cồn 95% (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ 32  Sau đó tiến hành xử lý mẫu với PBS 1X, tạo điều kiện cho Proteinase K hoạt động tốt.  Dùng enzyme Proteinase K để xử lý mô, phân hủy màng tế bào và màng nhân vì enzyme này chỉ có khả năng phân cắt protein có trong mẫu mô đã cố định trên lame và không ảnh hƣởng gì đến acid nucleic trong mẫu.  Rửa mẫu với dung dịch PBS/Glycine 1X để loại bỏ các enzyme còn thừa.  Sau đó cho mẫu vào trong hủ nhuộm sạch có chứa paraformaldehyde 0,4%, ủ 10 phút ở 40C giúp sợi DNA duỗi thẳng ra thuận lợi cho quá trình bắt cặp bổ sung. Tiến hành lai: Mẫu dò hay probe trong dung dịch lai trƣớc đó đã đƣợc biến tính bằng cách đun 10 phút ở 950C, làm lạnh nhanh và giữ lạnh ở 40C. Sau đó, ta cho dung dịch lai lên lame và biến tính mẫu mô ở 950C trong 6 phút. Phản ứng lai giữa hai thành phần trên xảy ra ở 420C trong 12 – 18 giờ (ủ qua đêm). 33 Xylene 5 phút, lặp lại 3 lần Thấm dung dịch trên lame nhƣng không đƣợc để khô mô (Đối với tất cả các bước trong kỹ thuật này) Hút lƣợng dung dịch lai cần thiết vào tube chịu đƣợc nhiệt độ cao, đun dung dịch lai trong 10 phút ở 950C. Sau đó cho ngay tube vào khay nƣớc đá 40C. 500 l Pro.K/lame 15 phút, ở 600C Dung dịch PBS 1X 5 phút, RT Dung dịch PFA 0,4%/PBS 1X, 10 phút, 40C Dung dịch PBS 1X/glycine 5 phút, RT 1. Hút 75 l dung dịch lai/lame, đậy lamelle lại 2. Đặt lame lên bàn lai ở 950C trong 6 phút 3. Tiếp tục cho lame vào phòng ẩm, ủ qua đêm ở 420C Mẫu trên lame ủ 60 0C trong 30 phút Cồn tuyệt đối 2 lần, 1 phút/lần Cồn 95% 2 lần, 1 phút/lần Cồn 80% 2 lần, 1 phút/lần Cồn 50% 1phút 1 lần Nƣớc cất 5 lần Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ nhất III.5.3.2 Ngày thứ hai  Sau bƣớc ủ lai ngày thứ nhất, mẫu trên lame kính đƣợc rửa dung dịch lai để loại bỏ lƣợng mẫu dò thừa bằng một loạt dung dịch đệm Sodium Chloride/Sodium Citrate có nồng độ giảm dần.  Ủ mẫu với dung dịch Blocking buffer 1X, chất blocking trong dung dịch sẽ khóa các phân tử lai không đặc hiệu lại.  Ủ mẫu với dung dịch Anti – Digoxigenin (Anti – DIG) có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti – Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Sau bƣớc này, những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc gắn thêm Anti – DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. 34 Dung dịch SSC 2X 5 phút/lần, 2x Dung dịch SSC 1X 5 phút/lần, 2x Dung dịch SSC 0,5X 5 phút/lần, 2x Dung dịch Blocking buffer 1X 1ml, 10 phút Dung dịch Anti-DIG/AP conjugated, 10 phút Dung dịch TBS 1X 5 phút/lần, 2x Dung dịch phát triển màu 2 giờ, ủ trong tối Dung dịch stop buffer1X, 5 phút Thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, 60 giây Rửa màu thừa bằng nƣớc cất. Cồn 95% 1 phút, 3x Cồn 99,5% 1 phút, 3x Xylene 1 phút, 3x Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ hai  Rửa mẫu với dung dịch TBS 1X để loại bỏ những phân tử Anti – DIG gắn AP thừa.  Ủ mẫu với dung dịch phát triển màu 2 giờ, trong tối ở nhiệt độ phòng.  Kết thúc phản ứng hiện màu bằng dung dịch Stop buffer 1X.  Nhuộm màu bổ sung bằng thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, mẫu mô – những vùng không có phân tử lai dƣới kính hiển vi quang học có màu vàng nâu. Rửa sạch màu thừa bằng nƣớc cất hai lần. Chúng ta có thể quan sát kết quả lai dƣới kính hiển vi quang học ngay sau bƣớc này. Nếu muốn giữ mẫu lâu thì tiếp tục cho lame mẫu qua cồn 95%, cồn tuyệt đối, xylene và dán keo cytoseal 60. III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu Mẫu đƣợc thu theo từng đợt ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và mẫu nhận hàng ngày tại TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Cách thu mẫu đƣợc tiến hành nhƣ sau: 35 Đối với tôm Postlarvae: Đối với tôm Postlarvae thu khoảng 100 con/bể, thu ở nhiều nơi trong bể giống, sau đó trộn lại với nhau và thu khoảng 100 con cho trực tiếp vào dung dịch cố định. Ngoài ra, chúng ta có thể dùng nƣớc ngọt hoặc formol gây sốc tôm trong khoảng 10 – 15 phút, nồng độ formol 200 – 300 ppm, sau đó thu những con yếu và chìm dƣới đáy. Mẫu sau khi thu đƣợc chia thành hai phần cho vào hai lọ chứa dung dịch cố định khác nhau, một lọ có chứa cồn 950C để làm PCR và lọ còn lại có chứa dung dịch Davidson (đối với tôm sú) hoặc R-F (đối với TCT) để làm mô học và In situ hybridization. Khi thu mẫu thì tôm còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối là tốt nhất. Đối với tôm thƣơng phẩm: Đối với tôm lớn thu mẫu bằng cách lấy tôm sống hoặc đang hấp hối, cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa mang và gan tụy), dùng dung dịch cố định (hai loại dung dịch: dung dịch cố định cho PCR và dung dịch cố định chung cho cả mô học và ISH) tiêm vào gan tụy và vùng xung quanh gan tụy. Lƣợng dung dịch cố định dùng từ 0,1 – 10 ml, thay đổi tùy theo kích thƣớc tôm. Sau đó cho mẫu vào lọ có chứa dung dịch cố định tƣơng ứng. Số tôm thu từ 5 – 10 con/ao. Tỷ lệ hóa chất dùng cố định mẫu là hóa chất : mẫu = 10 : 1. III.6.2 Bố trí thí nghiệm Chẩn đoán theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp. Thay đổi một số bƣớc trong quy trình để đƣa ra một quy trình tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Thí nghiệm để so sánh độ ổn định, độ chính xác và hiệu quả giữa phƣơng pháp ISH vừa tìm đƣợc với mô học và PCR. Các bố trí cụ thể nhƣ sau: III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei A. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm phƣơng pháp Để thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT của phƣơng pháp ISH, chúng tôi thực hiện thí nghiệm theo quy trình bộ kit đã nêu ở mục III.5 trên ba mẫu tôm dƣơng tính với TSV, một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm. Vì chúng 36 tôi không thu đƣợc những mẫu dƣơng tính điển hình nên thực hiện thí nghiệm này trên các mẫu cũ, đƣợc lƣu lại trong phòng thí nghiệm mô học từ năm 2004. Các mẫu tôm này dƣơng tính với TSV khi xét nghiệm bằng mô học và PCR, thực hiện thí nghiệm lặp lại 2 lần. B. Bố trí thí nghiệm để tìm quy trình ISH tối ƣu cho TSV trên Penaeus vannamei Sau khi thực hiện thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT, chúng tôi thực hiện một số thí nghiệm tiếp theo để tìm ra quy trình ISH tối ƣu cho TSV trên TCT trong phòng thí nghiệm, các thí nghiệm đó là: (a) Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu thích hợp Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này trên 10 mẫu tôm TCT đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV (5 mẫu tôm thƣơng phẩm và 5 mẫu postlarvae) và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên năm nghiệm thức sau: Nghiệm thức I: probe và mẫu đƣợc biến tính chung trên lame ở 950C trong 6 phút, thực hiện trong buồng ẩm. Nghiệm thức II: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 800C trong 6 phút. Nghiệm thức III: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 700C trong 6 phút. Nghiệm thức IV: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 600C trong 6 phút. Nghiệm thức V: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 500C trong 6 phút. (b) Thí nghiệm tìm thời gian cắt thích hợp với Proteinase K Ở đây, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai đối tƣợng là tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm để tìm ra thời gian tối ƣu áp dụng trên từng đối tƣợng đó, mỗi đối tƣợng thực hiện 5 mẫu và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Các mẫu 37 dùng trong thí nghiệm này đều đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV. Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên 5 nghiệm thức sau: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút. (c) Thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai sử dụng tốt nhất Nếu theo quy trình của bộ kit thì dùng thể tích dung dịch lai là 75 l/mẫu có nồng độ probe là 1 – 2 ng/ml dung dịch lai. Vì trong khi thực hiện lai có biến tính probe ở 950C trong 10 phút, sau khi cho dung dịch lai đã biến tính lên mẫu rồi thực hiện biến tính mẫu