Khóa luận Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất Vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam

ành phố trong cả nước. Theo Báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố (Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam Định, Đồng Tháp, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007 [6]. - Dịch bệnh tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng 3/2008. Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản đã được khống chế trên toàn quốc [6]. - Cúm gà 2010 và đầu năm 2011(chủ yếu là bệnh cúm thuộc chủng H5N1). Tại tỉnh Bắc Kạn từ ngày 19/3 đến ngày 6/4 năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 16 hộ chăn nuôi tại huyện Lương Phú. Tổng số gia cầm bị chết và tiêu hủy tại các hộ gia đình trên là 318 con [6]. Tại Quảng Ninh, ngày 29/3, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 4 hộ gia đình thuộc xóm 4 xã Tiền Phong của huyện Yên Hưng. Tính đến ngày 6/4 tổng số gia cầm chết và tiêu huỷ của 4 hộ trên là 1.554 con (trong đó có 1.504 vịt và 50 gà). Ở huyện Yên Hưng, Quảng Ninh, có hơn 3.000 con gà có biểu hiện mắc bệnh, số gia cầm bị chết là 1420 con [6].  Cả nước còn 6 tỉnh là Nghệ An, Khánh Hòa, Tuyên Quang, Bắc Ninh, Bến Tre và Quảng Ninh có dịch cúm gia cầm chưa qua 21 ngày. Số ca mắc cúm A/H5N1 trong những tháng đầu năm 2010 có thể nói là “bất thường” so với những năm trước đó chỉ trong 2 tháng đầu năm đã bằng tổng số ca mắc cả năm 2009. Đầu năm 2011 bệnh cúm A/H5N1 đã xảy ra ở một số tỉnh nhưng với số lượng ít và hầu như chưa bùng phát thành dịch: Ngày 17/2, chi cục thú y tỉnh Kon Tum đã xác địnht trên 2.000 con chim cút và trên 1.000 con gà bị chiễm cúm A. Ngày 12/3, TS Lê Hữu Hải, Trưởng phòng NN&PTNT huyện Cai Lậy (Tiền Giang), cho biết bảy đàn gia cầm, thủy cầm hơn 4.700 con ở các xã Nhị Mỹ, Tân Phú, Nhị Quý, Hội Xuân và Mỹ Phước Tây của huyện Cai Lậy đã phải tiêu hủy vì có các triệu chứng của bệnh cúm A/H5N1 [6]. Bảng 1.1. Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 19/6/2008 [12]. 1.2. Virus cúm A 1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc. * Đặc điểm hình thái: Hình 1.3: (A): Hình thái virus cúm; (B): Cấu trúc virus cúm; (C): cấu trúc RNA của virus cúm. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 – 120nm, đôi khi có dạng hình sợi. Khối lượng phân tử khoảng 250 Da. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [10]. * Đặc điểm về cấu trúc: Hạt virus: Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [2,17]. + Gai H giúp virut gắn lên thể thụ cảm trên bề mặt tế bào. + Gai N có tác dụng thoái biến thể thụ cảm của tế bào và giúp virus phóng thích tế bào bị nhiễm. - Vỏ bọc ngoài (envelope) - Lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand. RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA) là vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A, gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 [2]. 1.2.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng Hình 1.4. cấu trúc virus cúm A Tất cả các virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn. Trên bề mặt virus có protein ngây ngưng kết hồng cầu là HA và một loại enzyme NA có chức năng phá hủy thụ thể của tế bào vật chu và giải phóng virus. Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, hệ gen virus cúm A có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotit [16]. Các gen mã hóa cho các protein và chức năng của chúng như sau: - Phân đoạn 1: Là các gen mã hóa cho protein PB2 với kích thước 2341bp có vai trò trong quá trình sao mã: gắn mũ. - Phân đoạn 2: Liên quan đến quá trình sao mã: kéo dài, kích thước 2341bp, mã hóa cho protein PB1. - Phân đoạn 3: Mã hóa cho protein PA, kích thước 2233 bp, có vai trò trong quá trình sao mã. - Phân đoạn 4: Liên kết với tế bào thụ thể trên tế bào chủ gây ngưng kết hồng cầu, kích thước đoạn gen là 1778 bp mã hóa cho protein HA (Hemagglutinin). - Phân đoạn 5: Mã hóa cho protein NP, kích thước 1565 bp, nucleotit bám vào RNA, là thành phần trong phức hợp sao mã, vận chuyển ra vào nhân của vRNA. - Phân đoạn 6: Đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng của virus, kích thước 1413 bp, mã hóa cho protein NA (Neuraminidase). - Phân đoạn 7: Kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein M1 (Matrix protein), là protein nền, thành phần chính của virion và liên quan đến nhiều sự kiện quan trọng của virus. - Phân đoạn 8: Kích thước 890 bp, mã hóa NS1 với chức năng là protein không cấu trúc liên quan đến sự vận chuyển của RNA, ức chế interferon. Mã hóa prtein NS2 là protein không cấu trúc, chức năng chưa được biết rõ. Hình 1.5. Các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 [3]. * Độc lực gây bệnh của virus cúm A: Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên. - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế sức đề kháng của virus và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [4]. 1.2.3. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm A. HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt đặc biệt quan trọng nó quyết định độc lực cũng như khả năng nhân lên của virus. Hai kháng nguyên này cũng là mục tiêu tấn công đầu tiên của hệ thống miễn dịch vật chủ khi có sự xâm nhiễm của virus. * Kháng nguyên HA. HA là một glycoprotein có khối lượng khoảng 76.000 Dalton chứa 2 – 3 vị trí glycosyl hóa. Trên phân tử HA có ít nhất 5 domain kháng nguyên (A,B,C,D, và E) phân bố ở phần đầu của phân tử này. HA được cấu tạo bởi 2 tiểu phần là HA1 và HA2. Hai tiểu phần này được nối với nhau bởi một trình tự amino acid ngắn, đặc trưng cho từng bến thể H. Trình tự của đoạn peptit nối trong phân tử HA cũng chính là trình tự nhận biết và phân cắt của enzyme protease tế bào chủ đối với phân tử protein này. Sự phân cắt phân tử HA là bước đầu tiên trong quá trình thâm nhập vào tế bào chủ của virus cúm. Thông thường sự phân cắt này có tính giới hạn đối với các mô với sự có mặt của các protease thích hợp. Tuy nhiên đối với virus cúm độc lực cao (H5 và H7) đã tìm thấy sự có mặt của nhiều amino acid kiềm tính tại vị trí nhận biết của protease. Đặc tính này cho phép HA được nhận biết và phân cắt bởi nhiều loại protease có mặt ở nhiều loại tế bào khác nhau, dẫn đến sự mở rộng giới hạn các mô có thể bị xâm nhiễm bởi virus [14,15]. * Kháng nguyên NA. Cùng với HA, NA cũng là một kháng nguyên bề mặt vô cùng quan trọng, có tính chất quyết định đến khả năng nhân lên của virus. Chức năng chính của NA là phân cắt phân tử sialic acid (N-Acetyl neuramic acid), giải phóng virus khỏi tế bào nhiễm [8,5]. NA phân giải thụ thể tế bào màng nhày đường hô hấp bằng cách cắt đứt các liên kết glucosid giải phóng ra Neuramininic acid. Quá trình này cho phép virus đi qua màng nhày và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu của cơ thể vật chủ. NA cũng phá hủy các thụ thể dành cho HA trên bề mặt của tế bào hồng cầu, mặc dù các tế bào không phải là đối tượng gây nhiễm. Cùng với protease của tế bào chủ, NA tham gia tích cực vào quá trình phân cắt phân tử HA và phân cắt mối liên kết giữa thụ thể tế bào với HA. Nếu không có NA thì virus sẽ bị bất hoạt do gắn chặt vào thụ thể sialic acid của tế bào chủ, không được giải phóng ra khỏi tế bào và dẫn tới mất khả năng gây nhiễm tế bào. Vùng hoạt động của phân tử NA hoạt động ở đầu 5’ của phân tử này. Đối với các chủng H5N1 độc lực cao, NA đã biến đổi rất nhiều qua quá trình tiến hóa. Các đột biến đó đã giúp cho virus trở nên thích nghi và gây bệnh cho nhiều loại vất chủ khác nhau [9]. Ở dạng NA-N1 của các chủng độc lực cao, trên phân tử protein này có đoạn nhỏ gọi là vùng “đảo ngược” tạo ra một lỗ hổng (hollow pocket), cấu trúc này không có ở N2 và N9. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chính cấu trúc này đóng vai trò như một nhân tố ức chế tác dụng của một số thuốc kháng virus [13]. 1.3. Một số phương pháp phòng, chống bệnh cúm A/H5N1.: 1.3.1. Phòng bệnh bằng vaccine Hiện nay vaccine được coi là biện pháp chiến lược nhằm ngăn chặn dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng cúm trên người, tuy vaccine không ngăn ngừa hoàn toàn virus nhưng làm giảm được bệnh ở gia cầm qua đó làm giảm được sự phân hóa của virus từ gia cầm bị bệnh. Kháng thể đặc hiệu có thể sinh ra, đó chính là kháng thể kháng HA của virus đang nhiễm, nhưng thông thường động vật và người chết rất nhanh trước khi miễn dịch sinh kháng thể kháng HA. Có nhiều loại kháng thể nhưng chỉ có kháng thể kháng HA mới có vai trò trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở 2 loại chính là vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới [1]. - Vaccine truyền thống bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng. Vaccine vô hoạt đồng chủng (homonogus) là loại vaccine được sản xuất chứa cùng những virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa. Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous) là vaccine sử dụng virus có kháng nguyên NA dị chủng [1]. - Vaccine thế hệ mới: Vaccine được sản xuất có sử dụng kỹ thuật di truyền bao gồm: + Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên HA, NA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine. + Vaccine tái tổ hợp có chứa vecto đậu gia cầm dẫn truyền: Sử dụng virus đậu gia cầm làm vecto tái tổ hơp mang gen H5 và N1 chống virus type H5N1 và H7N1. + Vaccine tái tổ hợp có vecto adenovirus dẫn truyền: Sử dụng plasmit adenovirus dẫn truyền, lắp ghép virus adeno có chứa gen kháng nguyên H5 từ đó làm vecto tái tổ hợp H5 phòng chống virus type H5N1. + Vaccine từ sản phẩm plasmit tái tổ hợp có chứa gen HA, NA, NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen. + Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: Được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen trong đó gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuất di truyền. 1.3.2. Phòng bệnh bằng sử dụng hoá dược liệu. Một số dạng hóa dược đang được dùng trong các thuốc ức chế virus không đặc hiệu tác dụng ngăn cản quá trình giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm (ức chế NA), hoặc ức chế quá trình thoát vỏ (cởi áo) và bao gói của virus do ức chế vận chuyển protein NP vào nhân tế bào trong quá trình nhân lên của virus trong tế bào nhiễm [7]. Các chế phẩm chủ yếu là Rimantadine, Amantadine A/H5N1 đã xuất hiện sự kháng thuốc với hai thuốc này và Oseltamivir (Tamiflu) hoặc phác đồ hỗn hợp cả hai loại . Trong đó, Oseltamivir ức chế NA của mọi type virus cúm, được sử dụng uống dự phòng trong vòng 48 h sau tiếp xúc với mầm bệnh, và được sử dụng là thuốc dự trữ chiến lược phòng dịch cúm A/H5N1, tuy nhiên thuốc cũng có một vài tác dụng phụ trên người được ghi nhận như gây rối loạn tâm thần và có thể gây độc sau điều trị liều cao, cần chú ý khi sử dụng [1,7]. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu. Chủng virus cúm NIBRG-14 do viện Công Nghệ Sinh Học tiếp nhận từ Viện Quốc Gia về tiêu chuẩn và kiểm định sinh học (NIBSC, vương quốc Anh) là chủng được tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược. 2.1.2. Các hoá chất dùng trong nghiên cứu. Agarose, agar, EDTA, ethanol 70%, ethanol 100%, NaCl, cao nấm men, trypton, Amp, X-gal, MgCl2, SDS10%, chlorofrom, trizol, acetat natri, TAE, Sol I, Sol II, Sol III. 2.1.3. Các trang thiết bị: Bộ nguồn điện di, bộ điện di DNA, máy khuấy trộn Vortex, máy soi chụp ảnh gel, máy lắc ổn nhiệt 370C, máy khuấy từ, máy li tâm lạnh, tủ lạnh sâu - 250C, - 750C,máy li tâm, lò vi sóng, máy hút chân không, cân phân tích 10-4g, cân điện 10-2g, phòng thí nghiệm cấp độ 3, box cấy an toàn. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số - Virus bị bất hoạt bằng trizol với tỷ lệ 1:1, trộn đều bằng xi lanh (khoảng 20 lần). - Bổ sung dịch chloroform vào dịch huyền phù virus đã được bất hoạt trong trizol (1:1), đảo đều trong 15 giây. - Để trong nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong vòng 10 phút ở nhiệt độ thường. - Đưa dịch đã li tâm vào ống eppendorf mới. - Bổ sung 0,5 isopropanol,đảo đều trong nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. - Ly tâm 12.000 v/p trong vòng 30 phút ở 40C để thu tủa RNA. - Rửa tủa bằng 1ml ethanol 70%, ly tâm 12.000 v/p trong vòng 15 phút ở 40C. - Làm khô RNA trong box, hòa lại trong 20µl nước vô trùng đã loại RNase. 2.2.2. Kiểm tra RNA trên quang phổ kế Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các bazơ purin và pirimidin. Nồng độ RNA sợi đơn (µg/ml) sẽ được tính theo công thức: CRNA = A260 x 40 x d, với d là độ pha loãng mẫu cần đo. Cách tiến hành như sau: - Pha loãng dung dịch RNA pha loãng 20 lần trong nước vô trùng (5µl dung dịch RNA trong 95µl nước). - Dùng pipet chuyển dung dịch RNA đã pha loãng sang ống thạch anh của máy quang phổ Shimadzu và đo ở bước sóng 260nm. - Nồng độ RNA của mẫu đo sẽ được tính theo công thức trên với độ pha loãng là 20 lần. 2.2.3 Phương pháp tạo cDNA Tổng hợp sợi cDNA từ RNA của virus giai đoạn này cần có enzyme Reverse Transcriptase và mồi ngẫu nhiên. Phương pháp thực hiện như sau: Chuẩn bị hỗn hợp RNA và mồi trong ống 0,5ml vô trùng với các thành phần: Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp RNA và mồi. RNA tổng số (30-50mg) 5µl Mồi ngẫu nhiên (50ng /µl ) 3µ dNTP(10mM) 1µl H20 không có Rnase 1µl Tổng thể tích 10µl Chuẩn bị xong hỗn hợp ủ ở 650C trong 5 phút và đặt trên đá khoảng 1 phút. Tiếp tục chuẩn bị các thành phần khác bổ sung cho phản ứng: Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR. 10X RT Buffer 2 µl 25mM MgCl2 4 µl 0.1M DDT 2 µl Chất ức chế Rnase 1 µl Tổng thể tích 9 µl - Bổ sung 9 µl hỗn hợp thành phần trên vào mỗi ống chứa RNA và mồi đã sử lý ở 650C trong 5 phút, đảo nhẹ sau đó ly tâm 3000 v/p trong 30 giây. - Ủ phản ứng ở 250C trong 2 phút. - Sau đó bổ sung enzyme phiên mã ngược và mỗi phản ứng, đảo đều sau đó ủ tiếp chu trình nhiệt trong máy PCR như sau: 250C trong 10 phút 420C trong 50 phút 700C trong 15 phút Bảo quản ở 40C - Bổ sung 1 µl Rnase H vào mỗi ống và ủ ở 370C trong 20 phút để loại bỏ toàn bộ RNA. Mẫu chứa các sợi cDNA có kích thước khác nhau và cDNA sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp nên những đoạn DNA đặc hiệu bằng phương pháp PCR. 2.2.4. Nhân bản gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 chủng NIBRG-14 bằng phương pháp PCR Phản ứng giai đoạn này cần có đoạn mồi đặc hiệu cho gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm và sự có mặt của Taq polymerase. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR. H2O 16,1µl Buffer 10X 2,5µl dNTP 2µl Mồi 1 1µl Mồi 2 1µl cDNA 2µl Taq- polymerase 0.4µl Tổng thể tích 25µl Chu trình nhiệt: Bước 1: 940C/3 phút Bước 2: 940C/1 phút Bước 3: 500C/50 giây Bước 4: 720C/1 phút 30 giây Bước 5: Lặp lại 3 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4. Bước 6: 720C/8 phút Bước 7: 40C/ vô cùng 2.2.5. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di - Chuẩn bị gel agarose 1%: Cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch vào khay agarose điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút khi gel đã đông, gỡ lược ra đổ gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào để dung dịch ngập cách mặt gel từ 1 – 2 mm. - Tra mẫu: Lấy khoảng 5 µl sản phẩm trộn với 3 µl màu loadingdye 10X tra vào các giếng nhỏ trong gel. Chỉ thị phân tử là DNA đã được cắt phối bằng Hind III và EcoR I cũng được tra vào gel làm marker. - Chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, 400 mA, trong khoảng 2 – 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào cần ngừng điện di. - Nhuộm DNA bằng Ethidium bromide: Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch nhuộm này với nồng độ 2µl trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng của tia tử ngoại của máy soi chụp gel. 2.2.6. Phương pháp tách dòng. - Tách dòng đoạn DNA mã hoá cho kháng nguyên HA của virus cúm H5N1 được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR. H20 4µl Buffer for T4 ligase 1 µl Sản phẩm PCR 2 µl Vectơ PCR 2.1 2 µl T4 ligase 1 µl Tổng thể tích 10µl Ủ mẫu ở 140C trong khoảng 16 giờ. Sau khi sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E.coli chủng INV α F`. Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp và X-gal, sau đó đem mẫu đi ủ ở 370C qua đêm. Các khuẩn lạc E.coli chứa vecto PCR 2.1 tái tổ hợp mang sản phẩm PCR có màu trắng. 2.2.7. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào E.coli chủng INV αF`. Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmit trực tiếp vào tế bào thể nhận. Cơ chế biến nạp gồm việc làm thay đổi thành phần cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn để DNA plasmit dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA plasmit ngoại lai được gọi là tế bào khả biến. Quá trình biến nạp DNA vào tế bào E.coli được tiến hành như sau: - Lấy ống tế bào khả biến đặt trên đá 30 phút. - Trộn sản phẩm lai vào ống tế bào khả biến, cắm trên đá 30 phút. - Sốc nhiệt ở 420C, thời gian 45 giây, sau đó chuyển ống té bào đó trên đá và để 3 phút. - Bổ sung 250 µl môi trường lỏng LB, nuôi trên máy lắc trong máy lắc với tốc độ 200v/p, ở 370C trong 1 giờ. - Cấy trải 150 µl trên môi trường LB đặc có Amp và X-gal. - Ủ trong tủ ấm 370C qua đêm. 2.2.8. Tách chiết DNA plasmit Nhặt các khuẩn lạc trắng với 1 khuẩn lạc xanh, cấy vào mỗi khuẩn lạc 2 µl môi trường LB lỏng có chứa Amp, nuôi lắc qua đêm 370C trong 200v/p. - Lấy 1 µl dịch nuôi cho vào ống eppendorf đem ly tâm 6000v/p trong 5 phút để thu xác tế bào. - Bổ sung lần lượt 150 µl Sol I, trộn đều bằng máy vortex. - Bổ sung 150 µl Sol II, đảo nhẹ bằng tay 3 lần. - Bổ sung 150 µl Sol III, đảo nhẹ bằng tay 3 lần. - Bổ sung 450 µl chlorofrom, đảo nhẹ. - Ly tâm 10.000v/p trong 15 giây. - Dùng pipet hút khoảng 400 µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới. - Bổ sung 40 µl NaOAC 3M, pH 5,2 và 1 µl ethanol 100%. Để DNA plasmit tủa ở 13.000 v/p trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi thu cặn DNA. - Rửa cặn DNA bằng 500 µl cồn 70. - Ly tâm 13.000 v/p trong 15 phút, thu tủa. - Làm khô cặn DNA plasmit bằng máy Speed Vac trong 5 phút. - Hoà cặn DNA trong 40 µl TE có Rnase, búng đều sau đó ly tâm 3000 v.p trong 30 giây. - Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1 giờ để loại RNA. 2.2.9. Tinh sạch plasmit Để tinh sạch vecto plasmit tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự. Được tiến hành như sau: - Ly tâm 1,5 µl dịch nuôi cấy qua đêm để thu cặn tế bào. - Xác định tế bào được hoà tan lại trong 150 µl Resuspension Buffer nhờ Vortex. - Bổ sung 150 µl Lisisbuffer và đảo nhẹ 5-6 lần, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 phút. - Thêm 150 µl Precipitation Salt, đảo nhẹ 6-8 lần. - Ly tâm 13000 v/p trong vòng 5 phút. Trong lúc đợi ly tâm đặt cột S.N.A.P miniprep (A) vào trong ống (B). - Thu dịch nổi vào ống eppendorf vô trùng. - Thêm 600 µl Binding Buffer, đảo nhẹ 5-6 lần, cho toàn bộ dịch qua hệ thống cột A/B. - Ly tâm hệ thống A/B tại nhiệt độ phòng 2000 v/p trong 30 giây. - Loại dịch chảy qua. - Bổ sung vào cột 500 µl Wash Buffer. - Ly tâm cột A/B trong nhiệt độ phòng từ 2000 v/p trong 30 giây. - Thêm 900 µl Final Wash 1X và ly tâm 2000 v/p trong 30 giây. - Ly tâm hệ thống tại nhiệt độ phòng với tốc độ tối đa trong vòng 1 phút. - Chuyển cột A vào một ống eppendorf vô trùng, thêm 30 µl nước và ủ 3 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm cột ở nhiệt độ phòng tốc độ tối đa trong 1 phút. 2.2.10. Xác định trình tự gen bằng máy tự động Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc của Sanger có sử dụng các dideoxynucleotit. Trong kỹ thuật xác định trình tự bằng máy tự động, người ta không đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ mà bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Như vậy tất cả các oligonucleotit cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotit sẽ có cùng một màu. - Cho chạy phản ứng với các thành phần tham gia sau đó tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự. Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR. Big dye 3µl Mồi 1,275µl Buffer 2,5X 3µl DNA plasmit 3µl H2O khử ion vô trùng 4,725µl Tổng thể tích 15µl Chu trình nhiệt: Bước 1: 960C /1 phút Bước 2 : 960C/ 10 phút Bước 3: 500C/5 giây Bước 4: 600C/4 phút Bước 5: Lặp lại 25 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4. Bước 6: 40C trong vô cùng. Tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự: - Bổ sung 5 µl EDTA 125mM pH 8 vào mỗi ống sản phẩm. - Thêm vào 60 µl ethanol 100%. - Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. - Ly tâm tốc độ 12.000 v/p trong 30 phút. - Thu tủa, rửa tủa bằng 60 µl ethanol 70%. - Ly tâm tốc độ 10.000 v/p trong 10 phút. - Loại dịch thu cặn. - Làm khô DNA. - Thêm vào 15 µl hidiformamide. - Biến tính 3 phút ở 950C. - Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số. Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme có bản chất là các ribonuclease (RNase). Hơn nữa các Rnase lại có mặt khắp nơi (có mặt rất nhiều trên mồ hôi, trên tay của người làm thao tác). Vì vậy việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh bị nhiễm các RNase từ môi trường ngoài vào mẫu. Thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ hóa chất đều được sử lý bằng DEPC sau đó khử trùng bằng nhiệt với áp suất cao, khi thao tác phải đeo găng tay. Quá trình tách chiết RNA được tiến hành theo phương pháp sử dụng dung dịch Trizol. RNA dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao, không lẫn protein và DNA. Để đo nồng độ RNA cần dùng cho việc tạo cDNA, chúng tôi dã dùng phương pháp quang phổ kế để xác định độ hấp phụ ở bước sóng 260nm (A260). Hình 3.1. Kết quả tách RNA tổng số. Kết quả điện di ở hình 3.1 cho thấy RNA plasmit có băng đặc trưng sắc nét, không bị đứt gãy trong quá trình thao tác. RNA plasmit thu được đem pha loãng để làm khuôn cho các phản ứng RT- PCR. 3.2. Kết quả khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm H5N1. Sau khi tách chiết, 10ng RNA tổng số đã tách chiết được dùng làm sợi khuôn để nhân bản đoạn DNA đích bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng bộ sinh phẩm SuperScripTM One step RT-PCR của hãng Invitrogen. Vì vùng gen mã hóa cho các gen HA khá dài, để đảm bảo việc nhân bản gen thành công chúng tôi đã thiết kế hai cặp mồi khuếch đại gen theo hai đoạn riêng biệt nằm ở đầu 3’ và đầu 5’ của gen. Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen ở đầu 5’ của gen HA có trình tự: H55PI: ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTG; H55M14: GCATACTAGAGTTTATCGCCC. Sản phẩm RT-PCR với cặp mồi này có chiều dài theo lý thuyết là 917 bp. Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen ở đầu 3’ của gen HA có trình tự: H53P5: CATCAACACTGAACCAGAGATTGG; H53MS: TTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG. Sản phẩm PCR với cặp mồi này có chiều dài theo lý thuyết là 1055 bp. Phản ứng phiên mã ngược được thực hiện theo chu trình nhiệt 500C - 30 phút, 940C – 2 phút; 30 chu kỳ (940C – 15 giây, X0C* - 50 giây, 720C- 1 phút 30 giây); 720C – 8 phút, 40C – ∞. Sau đó chuyển sang giữ ở 40C. Sản phẩm PCR (8µ) được kiểm ta điện di trên gel agarose 1%. (hình 3.2) 1055 bp 917 bp 247 bp 147 bp M47 bp 947 bp Hình 3.2. kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của gen HA trên gel agarose 1% M: Thang DNA chuẩn. 1: Sản phẩm PCR đầu 3’. 2: Sản phẩm PCR đầu 5’. Đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên HA của virus cúm đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một băng DNA duy nhất, không có sản phẩm phụ. Sản phẩm PCR được đối chiếu với thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR này đúng theo dự đoán lý thuyết: sản phẩm PCR đầu 3’ có chiều dài khoảng 1055bp, sản phẩm PCR đầu 5’ có chiều dài khoảng 917bp. Kết quả này chứng tỏ chương trình thiết kế hoàn toàn hợp lý cả về mặt lý thuyết và kỹ thuật. 3.3. Kết quả tách dòng sản phẩm PCR Việc tách dòng