Khóa luận Xây dựng một phương pháp cho phép xác định nhanh và tương đối chính xác hàm lượng các axit amin và protein trong thực phẩm

ình ảnh thu được qua kính hiển vi điện tử. 1.5.4.3. Cấu trúc bậc 3: Cấu trúc này phản ánh tương quan trên phạm vi toàn bộ sợi polypeptit. Những aminoaxit nằm ở xa nhau và nằm trong những cấu trúc bậc 2 khác nhau lại thường hay tương tác tiếp cận với nhau trong cấu trúc bậc 3. Các liên kết và tương tác yếu có vai trò quyết định giữ ổn định cấu trúc bậc 3. Với liên kết này các phân tử có xu thế cuộn chặt lại, các gốc kỵ nước quay vào trong, các gốc ưa nước ở trên bề mặt phân tử. Khi biến tính phân tử protein bằng các tác nhân hoá học hoặc vật lý tức là phá vỡ liên kết Van đe Van, liên kết hiđro, khử cầu sunfua, phân tử protein sẽ bị duỗi ra đồng thời thay đổi một số tính chất của nó, đặc biệt là tính tan và hoạt tính sinh học. Sự biến tính này có thể thuận nghịch nếu như chúng có thể trở lại trạng thái cấu trúc ban đầu và không thuận nghịch nếu như vĩnh viễn không trở lại trạng thái cấu trúc ban đầu. Với nhiệt độ cao thường phá vỡ tất cả các liên kết làm cho phân tử protein bị biến tính hoàn toàn, ví dụ nấu riêu cua, canh trứng. Các dung môi hữu cơ, muối amoni, chất tẩy rửa thường tác động nhẹ nhàng hơn chỉ phá vỡ tương tác kỵ nước. Độ pH cũng làm thay đổi tổng điện tích của phân tử protein và phá vỡ một phần liên kết hiđro nên cũng được xem là một yếu tố gây biến tính. Biến tính nghịch (a) (b) Hình 8: Cấu trúc bậc 3 của phân tử protein tự nhiên (a) và biến tính (b) 1.5.4.4. Cấu trúc bậc 4: Rất nhiều protein chứa 2 hoặc nhiều sợi polypeptit còn gọi là phần dưới dơn vị (subunit) giống nhau hoặc khác nhau. Do vậy cấu trúc bậc 4 phản ánh tương tác không gian giữa các phần này trong phân tử protein, Đầu N Đầu C Đầu C Đầu N a b Hình 9: So sánh cấu trúc của myoglobin (a) và cấu trúc của hemoglobin (b) Cấu trúc bậc 4 Cấu trúc bậc 3 Cấu trúc bậc 2 Nhóm hem Cấu trúc bậc 1 Hình 10: 4 bậc cấu trúc của protein 1.6. MỘT SỐ TÍNH CHẤT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN. 1.6.1. Khối lượng và hình dạng phân tử protein. Protein có khối lượng phân tử tương đối lớn, có dạng hình cầu hoặc dạng sợi. Protein hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, rất hoạt động về mặt hoá học. Các protein hình sợi tương đối trơ về mặt hoá học, chủ yếu có chức năng cơ học. Ví du, colagen của da, xương, sụn, gân, răng; keratin của tóc, lông, fibroin của tơ, miozin của cơ... [1,2,3]. 1.6.2. Tính chất lưỡng tính của protein. Cũng như aminoaxit, protein cũng là chất điện ly lưỡng tính vì trong phân tử protein còn nhiều nhóm phân cực của mạch bên. Có thể điều chỉnh pH để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Khi pH = pI các protein dễ dàng kết tụ lại với nhau làm cho protein kết tủa [1,3,6]. 1.6.3. Tính chất dung dịch keo protein, sự kết tủa protein. Khi hoà tan, protein tạo thành dung dịch keo. Các phần tử keo có kích thước lớn, không đi qua màng bán thấm. Người ta sử dụng tính chất này để tinh sạch protein khỏi các chất phân tử thấp bằng phương pháp thẩm tách. Hai yếu tố đảm bảo độ bền dung dịch keo protein là: - Sự tích điện cùng dấu của các phân tử protein ở (pH # pI). - Lớp vỏ hyđrat bao quanh phân tử protein. Người ta thường dùng các muối vô cơ như (NH4)2SO4 hay các dung môi hữu cơ như axeton, etanol để tạo kết tủa protein nhưng phải tiến hành ở nhiệt độ thấp. Các yếu tố gây biến tính không thuận nghịch thường được sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch: dùng nhiệt, các axit mạnh, các kim loại nặng...[1,3,5,6]. 1.6.4. Khả năng hấp thụ tia tử ngoại của protein Dung dịch protein có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng có bước sóng 180-220nm và 250-300nm [3,6]. 1.6.5. Khả năng thuỷ phân của protein Các phân tử protein có thể bị thủy phân bằng axit, kiềm hay enzim cho các polypeptit và cuối cùng là các aminoaxit [1,3,6]. 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMINOAXIT VÀ PROTEIN. 2.1. Các phản ứng màu của axit amin và protein. 2.1.1. Phản ứng Biure. Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit. Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở nên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ tuỳ thuộc vào số lượng liên kết peptit nhiều hay ít. Các phản ứng xảy ra như sau: * Phản ứng tạo biure. * Phản ứng với protein. Cũng tương tự như trường hợp của biure, các liên kết peptit ở dạng enol (trong môi trường kiềm) của các phân tử protein tạo phức với Cu2+: Dạng phức hợp như trên (với bốn nguyên tử nitơ tham gia tạo liên kết phối trí) thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại ở bước sóng 520-535nm). Trong trường hợp chỉ có hai hay ba nguyên tử N tham gia tạo liên kết thì phức sẽ có màu tím hoặc màu xanh (hấp thụ cức đại ở những bước sóng tương ứng là 540-580 và 615-670nm). Vì vậy, thông thường sản phẩm phản ứng của các polypeptit khác nhau sẽ có màu thay đổi từ xanh tím đến đỏ tím. Phản ứng biure thường được ứng dụng để định lượng protein [1,3,6,9]. 2.1.2. Phản ứng với ninhiđrin. Các aminoaxit khi phản ứng với ninhiđrin ở nhiệt độ cao cho sản phẩm có màu xanh tím (hấp thụ cực đại ở khoảng bước sóng 570nm). Đây là phản ứng chung cho tất cả các aminoaxit có chứa nhóm NH2 ở vị trí Cỏ. Ngoài a-aminoaxit, các peptit, protein, muối amoni và amoniac cũng cho phản ứng này. Cơ chế phản ứng khá phức tạp như sau: Đầu tiên do tác dụng của các aminoaxit với ninhiđrin sẽ xuất hiện phức chất dạng bazơ-schiff. Sau đó xảy ra sự chuyển nhóm, tiếp theo là sự đề cacboxyl hoá và sự phân tách phức chất thành anđehit và aminođixetohiđrinden. Aminođixetohiđrinden lại ngưng tụ với một phân tử ninhiđrin khác và hình thành nên một hợp chất mới, đồng thời bị enol hoá và chuyển thành dạng có màu. Khi có các dung môi hữu cơ (axeton, etanol,piriđin … thường được dùng để pha ninhiđrin) thì sẽ xảy ra phản ứng sau: Sản phẩm của phản ứng này có chứa gốc R của aminoaxit ban đầu. Gốc này sẽ quyết định màu sắc khác nhau (xanh da trời, đỏ…) của các hợp chất khi phản ứng với ninhiđrin. Đặc biệt phức chất được tạo thành giữa prolin (có chứa nhóm imin) và ninhiđrin có màu vàng tươi, khác biệt hẳn với màu do các aminoaxit khác tạo nên trong phản ứng. Do vậy, ninhiđrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưng để phát hiện prolin: Phức màu vàng Phản ứng với ninhiđrin có độ nhạy cao, do đó thường được dùng để định tính và định lượng protein [1,3,6]. 2.1.3. Phản ứng với axit HNO2. Dưới tác dụng của HNO2, aminoaxit bị deamin hoá tạo thành nitơ ở dạng khí. Phản ứng này được sử dụng để định lượng các a-aminoaxit (phương pháp Van Slyke) [6]. Phản ứng xảy ra như sau: 2.1.4. Phản ứng Pauli để phát hiện histiđin và tirozin. Khi tác dụng với axit điazobenzensunfonic (thuốc thử diazo), histiđin tạo thành phức chất màu mận chín, còn tirozin tạo thành phức chất màu da cam [6]. Các phản ứng xảy ra như sau: * Sự tạo thành axit điazobenzensunfonic: * Phản ứng của tirozin: Phức màu da cam. 2.1.5. Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin. Thuốc thử Millon chính là muối thuỷ ngân nitrat trong HNO3 đặc. Khi cho thuốc thử Millon tác dụng với nhân phenol của tirozin sẽ tạo nên hợp chất nitrotirozin-thuỷ ngân có màu đỏ. Phản ứng xảy ra như sau: Phản ứng Millon được sử dụng để phát hiện tyrozin và các hợp chất phenol. Chú ý không cho quá nhiều thuốc thử Millon vì HNO3 có trong thuốc thử sẽ tác dụng với protein cho màu vàng [6]. 2.1.6. Phản ứng của các axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng Folia). Các axit amin chứa lưu huỳnh như xistin, xistein, methionin dưới tác dụng của kiềm bị phân huỷ tạo thành natri sunfua (Na2S): RSH + 2NaOH ® Na2S + ROH + H2O Thêm chì axetat vào Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sunfua (PbS) [6]. Na2S + Pb(CH3COO)2 ® 2CH3COONa + PbS¯ (kết tủa nâu đen) 2.1.7. Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho acginin. Đây là phản ứng dùng để phát hiện acginin. Khi cho acginin tác dụng với hipobromua (NaBrO) và ỏ-naphtol sẽ tạo thành sản phẩm có màu đỏ cam [6]. Phản ứng có thể được trình bày như sau: 2.1.8. Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho tryptophan. Trong môi trường axit, tryptophan phản ứng với nhiều loại anđehit tạo thành những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím đặc trưng [6]. Các phản ứng xảy ra như sau: 2.2.Định lượng axit amin và protein. 2.2.1. Xác định N-amin bằng phương pháp chuẩn độ focmol. Các aminoaxit có thể phản ứng với focmol trung tính để tạo thành metyl - aminoaxit. Focmol đã khoá nhóm amin (NH2) mang tính kiềm nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử aminoaxit bằng kiềm. Dựa vào lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ sẽ tính được lượng Nitơ của aminoaxit [6,9]. Phản ứng được biểu diễn như sau: 2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. Lượng nitơ tổng số trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường được xác định bằng phương pháp Kjeldahl. Đó là hàm lượng tổng của các dạng nitơ hữu cơ và vô cơ có trong phẩm vật nghiên cứu. Để định lượng nitơ protein, người ta thường xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng nitơ này rồi nhân với hệ số tương ứng [6,9]. Lưu ý: Các protein thực vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16.8%, do vậy trong trường hợp này hệ số nhân sẽ là 5.95 (100 : 16.8). Các protein động vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16%, do vậy trong trường hợp này hệ số nhân sẽ là 6.25 (100 : 16) [6]. 2.2.2.1. Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl. Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ (N) bị phân huỷ và bị oxi hoá đến CO2 và H2O, còn nitơ chuyển thành amoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sunfat. Quá trình được tiến hành qua các bước sau: * Vô cơ hoá nguyên liệu. R-CHNH2-COOH + H2SO4 ® CO2 + H2O + (NH4)2SO4 * Cất đạm. (NH4)2SO4 + 2NaOH ® Na2SO4 + 2H2O + 2NH3­ Phản ứng xảy ra trong bình hứng: 2NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng NaOH 0.1N. 2.2.2.2. Xác định nitơ phi protein. Để xác định N-phi protein cần dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng N-phi protein (ví dụ dung môi là etanol 70%). Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hoà tan trong quá trình chiết rút. Kết tủa protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: bằng etanol, axeton, các muối kim loại nặng, axit hoặc đun ở nhiệt độ cao … nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau đây: TCA 10-20%, poly nhôm clorua (PAC) với chất trợ keo tụ dạng âm A101, polyme C310H (keo tụ dương) Pb(CH3COO)2 10-15%, CuSO4 10% trong hỗn hợp với NaOH 10%, tỷ lệ 1 : 1 [5,6]. Sau khi đã loại bỏ kết tủa, dịch lọc chỉ còn chứa các dạng N-phi protein. Đem vô cơ hoá dịch này và tiếp tục tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl. 2.2.2.3. Định lượng protein trong nguyên liệu. N-tổng số bao gồm N-protein và N-phi protein. Muốn xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu phải xác định N-tổng số và N-phi protein. Hàm lượng protein trong mẫu được tính theo công thức sau: Protein (mg) = (Ntổng số - Nphi protein).6,25 Hoặc Protein (mg) = (Ntổng số - Nphi protein).5,95 2.2.3. Định lượng protein theo phương pháp Bradford. Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue - CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài mg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian [6,9] 2.2.4. Định lượng protein theo phương pháp Lowry. Protein tác dụng với thuốc thử Folin-Ciocalteux tạo thành sản phẩm màu xanh. Đây là sản phẩm khử của photphomolipđat-photphovolframat bởi phức chất Đồng-Protein và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ Protein trong một phạm vi cho phép. Dùng máy so màu quang điện để xác định cường độ màu trong các mẫu và so sánh với dịch protein tiêu chuẩn. Phương pháp Lowry sử dụng kết hợp phản ứng Biure (tác dụng lên liên kết peptit, mục 2.1.1.) và phản ứng với thuốc thử Folin (tác dụng lên các gốc Tyrozin, Tryptophan, Histiđin) để tạo phức có màu đặc trưng. Phương pháp có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định được đến nồng độ vài chục mg protein, do vậy được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein ở dạng tương đối tinh khiết. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là màu của phức chất bị ảnh hưởng nếu trong dung dịch có chứa một số chất như EDTA, sacarozơ, đệm Tris hay một số chất khử như xistein, ditiotreitol ... [4,6,9] 2.2.5. Định tính và định lượng aminoaxit bằng phương pháp sắc ký giấy. Phương pháp sắc ký phân bố trên giấy dựa vào sự khác nhau về hệ số phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn. Người ta mang lên một điểm ở đầu bản giấy sắc ký một giọt dung dịch nghiên cứu rồi nhúng đầu giấy có mang dung dịch nghiên cứu đó vào chậu dung môi hữu cơ linh động bão hoà nước (như rượu butilic). Trong quá trình di chuyển chậm của dung môi qua ống mao dẫn của giấy, các cấu tử riêng biệt của hỗn hợp sẽ chuyển dịch theo với vận tốc khác nhau, nhờ vậy mà hỗn hợp được phân chia ra thành các cấu tử thành phần. Sự chuyển dịch của các chất trong khi tiến hành sắc ký có thể giải thích như sau: Các sợi xenlulozơ của giấy có ái lực lớn đối với nước và hấp phụ nước trong dung môi hữu cơ bão hoà nước ( đóng vai trò là chất mang ). Ở đây pha tĩnh là nước, có chứa trong nước khoảng 20%, còn dung môi hữu cơ là chất lỏng linh động khi dung môi chảy qua phần giấy có chứa dung dịch nghiên cứu thì một phần các chất chuyển vào dung môi ( pha động ). Khi dung môi tới phần giấy không có chứa các chất phân tích thì ở đó lại xảy ra quá trình phân bố các chất giữa pha tĩnh là nước và pha động là dung môi hữu cơ. Lần này, các chất lại chuyển từ ( dung môi ) pha hữu cơ sang pha nước. Như vậy, nếu cho dung môi chuyển dịch liên tục qua giấy, các chất phân tích sẽ được chuyển từ điểm mang ban đầu đến một điểm khác trên giấy theo hưưóng chảy của dung môi do kết quả của quá trình tách phân bố liên tục giữa hai pha tĩnh và động. Quá trình phân tích này được tiến hành trong thiết bị kín bão hoà của dung môi và nước. Khi tuyến dung môi đã đi được đoạn đường 30 – 40 cm, người ta lấy giấy ra sấy khô và phun thuốc nhuộm màu, nhờ đó xác định được vị trí của các cấu tử trên dải giấy. Dải giấy sau khi hiện màu gọi là sắc ký đồ. Trong thực tiễn, hệ số vận tốc chuyển dịch (ký hiệu là Rf ) có ý nghĩa rất lớn. Hệ số vận tốc chuyển dịch Rf là tỉ số giữa quãng đường đi được của chất so với quãng đường chuyển dịch của dung môi. Rf = Quãng đường dịch chuyển của chất / Quãng đường dịch chuyển của dung môi. Rf: Là đại lượng đặc trưng và không đổi đối với mỗi chất trong những điều kiện xác định. Tuỳ thuộc vào hướng hoặc chiều chuyển dịch của dung môi, người ta phân biệt một số dạng sắc ký như sau: * Sắc ký nghịch: Khi dung môi chảy dịch từ dưới lên trên. * Sắc ký thuận: Khi dung môi chảy từ trên xuống. * Sắc ký vòng tròn: Khi dung môi chuyển dịch từ tâm ra xung quanh. Ngoài ra, người ta còn phân biệt: Sắc ký một chiều khi cho dung môi chuyển dịch theo một hướng nhất định. Sắc ký hai chiều khi cho dung môi chuyển dịch theo một chiều nào đó, sau đấy sấy khô và cho dung môi chảy theo một chiều khác vuông góc với chiều ban đầu. Phương pháp sắc ký giấy một chiều ( có thể thuận hoặc nghịch ) là phương pháp đơn giản nhất, chỉ dùng một hệ dung môi nào đó. Khả năng phân tích kém hơn sắc ký hai chiều. Trong sắc ký thuận, hệ số vận tốc chuyển dịch Rf lớn, nhưng các vết màu thu được không gọn, còn trong sắc ký nghịch đại lượng Rf nhỏ hơn, nhưng vết màu lại gọn hơn. Để định lượng các axit amin người ta thường sử dụng các phương pháp sau: * So sánh bằng mắt thường cường độ màu và diện tích các vết màu của hợp chất đã cho với cường độ màu và diện tích các vết màu của hỗn hợp đối chứng đã biết rõ nồng độ. * Đo chiết suất của dịch chiết chất màu từ sắc ký đồ bằng một dung môi thích hợp. Sai số của phương pháp này khoảng 3 – 6 %. * Dùng densitomet đo mật độ màu của các vết trong khi cho ánh sáng xuyên qua. Độ chính xác của phép đo tăng lên đến 10 – 15% [8,9] 2.2.6. Xác định aminoaxit và peptit bằng sắc ký lỏng pha ngược và sắc ký lỏng khối phổ ( thầy xem và sửa giúp em mục này) [10]. Phương pháp mới cho phép xác định nhạy các aminoaxit và peptit là sử dụng thuốc thử 2-(9-carbazole)-ethyl chloroformate (CEOC) với máy dò huỳnh quang (FL) đã được phát triển. Sự phát hiện ra các dẫn xuất đã được tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Nhóm mang màu trong thuốc thử 2-(9-fluorenyl)-ethyl chloroformate (FMOC) đã được thay thế bằng carbazole,dẫn đến một tác nhân dẫn xuất có tính nhạy quang là CEOC. CEOC có thể phân loại các peptit và aminoaxit dễ dàng và nhanh chóng. Chất dẫn xuất đủ bền để có khả năng phân tích bởi phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hiệu suất tạo dẫn xuất cực đại (gần 100%) được quan sát với số mol thuốc thử vượt quá 3-4 lần và nằm trong khoảng pH = 8.8 ¸ 10. Các dẫn xuất có độ nhạy quang mạnh cho phép bơm thẳng vào hỗn hợp phản ứng mà không làm xáo trộn đáng kể bởi sản phẩm phụ trong quá trình phân huỷ tác nhân nhạy quang như là 2-(9-carbazole)-ethanol và 2-(9-carbazole)-ethyl carbonate. Thêm vào đó, quá trình phát hiện sự phản ứng với dẫn xuất CEOC được so sánh với quá trình phát hiện sự phản ứng thu dược bằng FMOC. Tỷ lệ ACCEOC /ACFMOC = 1.00 ¸ 1.82 cho sự cảm ứng phát huỳnh quang (FL) và AC'CEOC /AC'FMOC = 1.00 ¸ 1.21 cho sự cảm ứng tử ngoại - cực tím (UV). Ở đây AC và AC' là sự cảm ứng tương ứng giữa FL và UV. Sự phân tách các chất dẫn xuất của peptit và aminoaxit dã được tối ưu hoá trên cột Hypersil BDS C18. Phương pháp này được sử dụng thành công để phân tích protein thuỷ phân từ len và từ dẫn xuất trực tiếp của bia. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ. 1.1. Chuẩn bị hoá chất. 1.1.1. Pha thuốc thử. * Thuốc thử Biure (còn gọi là tác nhân Gornal). Cân 5g CuSO4.5H2O hoà tan trong 495ml H2O ta được dung dịch A (dung dịch 5g CuSO4.5H2O 1%). Cân 10g KNaC4H4O6.4H2O (Kali Natri tactrat) hoà tan trong 490ml H2O ta được dung dịch B (dung dịch KNaC4H4O6.4H2O 2%). Cân 20.5g Na2CO3 và 4g NaOH hoà tan trong 1000ml H2O ta được dung dịch C (dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0.1N). Pha thuốc thử Biure (chỉ pha trước khi dùng): Lấy 1ml dung dịch A + 1ml dung dịch B + 98ml dung dịch C. Thuốc thử Biure có màu xanh nhạt. Thuốc thử Biure không dùng được trong môi trường có NH4+ vì NH4+ tạo phức với Cu2+ không màu, bền nên không tạo phức sinh màu được với polypeptit. * Thuốc thử Folin-Ciocalteux. Hoà tan 100g Na2VO4.2H2O và 25g Na2MoO4.2H2O vào 800ml nước cất. Thêm 50 ml dung dịch H3PO4 80% và 100 ml HCl đậm đặc. Đun sôi hỗn hợp trong bình cầu đáy tròn dung tích 2000 ml với ống sinh hàn ngược trong vòng 10 giờ. Có thể đun ngắt quãng, không cần phải đun liên tục, nhưng phải đun sôi đủ 10 giờ. Sau khi đun xong thêm vào hỗn hợp 150g Li2SO4, 50 ml nước cất và 5 giọt nước Br2. Đun sôi 15 phút không có ống sinh hàn ngược để loại trừ lượng Br2 dư. Dung dịch thuốc thử phải có màu vàng, không được có màu xanh. Nếu thuốc thử có màu xanh thì phải xử lí với Brôm lần thứ hai. Sau khi làm nguội dung dịch, thêm nước cất cho tới vạch mức trong bình định mức dung tích 1000 ml. Xác định nồng độ của thuốc thử bằng cách chuẩn độ dung dịch Folin - Ciocalteux pha loãng 10 lần với dung dịch NaOH 0.1N (dùng chất chỉ thị là phenolphtalein). Bảo quản thuốc thử Folin trong bình thuỷ tinh màu, để trong tủ lạnh. Sau 2-3 tháng dung dịch ngả màu xanh thì thêm vài giọt Brôm và lại đun sôi 15 phút, dung dịch có màu vàng trở lại. Trước khi dùng, pha loãng thuốc thử bằng nước cất sao cho nồng độ thuốc thử bằng 1N. Protein hiện màu tím - xanh trong môi trường kiềm do sự oxy hoá của volframat và molipđat các gốc tirozin và triptophan trong protein. Các chất ure (0.5%), guanidin (0.5%), vonphramat natri (0.5%), sunfat natri (1%), nitrat natri (1%), clorat (0.5%), tricloaxetat (0.5%), rượu etylic (5%), ete (5%), axeton (0.5%), sunfat kẽm (0.1%), hydroxit bari (0.5%), sunfatamon (0.15%) - không làm giảm màu của phản ứng. Glixin (0.5%) làm giảm đến 50% màu của phản ứng. Đệm phosphat từ 0.1M trở lên gây kết tủa phản ứng màu. * Pha dung dịch đệm phosphat có pH=8. Cân 11.8660g Na2HPO4 hoà tan trong 1000ml H2O ta được dung dịch E. Cân 9.0780g KH2PO4 hoà tan trong 1000ml H2O ta được dung dịch F. Tiếp theo, dùng pipet lấy chính xác 5.5ml dung dịch F cho vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch E vào bình cho tới vạch mức ta được dung dịch đệm phosphat có pH=8. 1.1.2. Pha dung dịch casein chuẩn. Cân 0.6250g casein (chứa 80% là protein) chuyển vào bình định mức 500ml, thêm dung dịch đệm phosphat có pH=8 vào bình. Đặt bình trên máy khuấy từ và giữ nhiệt độ trong khoảng 50-600C. Sau khi casein đã tan hết, dùng nước cất định mức tới vạch ta được dung dịch casein chuẩn có nồng độ 1 mgprotein/ml. Pha dung dịch casein chuẩn có nồng độ protein là 50mg/ml từ dung dịch casein chuẩn ở trên bằng cách dùng pipet hút chính xác 5ml dung dịch casein chuẩn 1 mg/ml cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất vào bình, lắc đều, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất. Bằng cách tương tự ta sẽ pha được các dung dịch casein chuẩn có nồng độ protein là 100, 150, 200, 300, 400, 500 mgprotein/ml. Các dung dịch casein chuẩn trên được dùng để lập đường chuẩn xác định hàm lượng các aminoaxit và protein trong thực phẩm. 1.1.3. Các hoá chất khác. Ngoài các hoá chấ trên, trong quá trình làm thực nghiệm còn dùng các loại hóa chất khác như: HCl đậm đặc, H3PO4 85%, Na2VO4.2H2O, Na2MoO4.2H2O, Li2SO4, NaOH 0.1N, nước Brôm … 1.2. Dụng cụ và thiết bị. * 10 ống nghiệm sạch, khô trong 1 giá gỗ. * 1 pipet 10 ml có chia vạch. * 1 pipet 5 ml có chia vạch. * 2 pipet 2 ml có chia vạch. * 4 pipet 1 ml có chia vạch. * 2 bình định mức 100 ml. * 1 bình định mức 500 ml. * 1 bình định mức 1000 ml. * 2 ống đong 100 ml. * 2 bình tam giác 250 ml. * 2 cốc dung tích 1000 ml. * 1 buret 25 ml. * 1 bình cầu 3 cổ + 1 bộ giá đỡ. * 1 sinh hàn hồi lưu. * 1 bếp điện. * Máy khuấy từ có điều chỉnh nhiệt độ. * 2 cuvet dày 1 cm. * Máy đo quang MC - 752. 2. Xác định hàm lượng axit amin và protein trong một số thực phẩm. Như đã trình bày ở phần tổng quan, các aminoaxit và protein phản ứng với hỗn hợp thuốc thử Biure + Folin-Ciocalteux tạo hợp chất màu xanh và được đo quang ở bước sóng 750 nm. Phương pháp này đã được hoàn thiện từ lâu, các điều kiện tối ưu đã được xác lập, vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này để xác định hàm lượng của các aminoaxit và protein trong một số loại thực phẩm. 2.1. Quy trình phân tích chung. Mẫu thật: Lấy chính xác vào ống nghiệm sạch, khô 0.5 ml dung dịch nghiên cứu, thêm vào 0.5 ml H2O và 2.5 ml thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm. Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein trong 1 ml dịch nghiên cứu, từ đó tính ra hàm lượng % protein trong nguyên liệu. Mẫu trắng: Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiếp tục làm như đối với mẫu thật.. 2.2. Dựng đường chuẩn xác định hàm lượng aminoaxit và protein. Để xác định được hàm lượng của các aminoaxit và protein trong thực phẩm ta phải xây dựng đường chuẩn. Dùng pipet lấy chính xác 1 ml các dung dịch casein chuẩn có nồng độ protein lần lượt là 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 mg/ml cho vào 7 ống nghiệm sạch khô. Thêm vào 2.5 ml dung dịch thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm được kết quả ở bảng được kết quả ở bảng 2. Bảng 2: Mật độ quang của các dung dịch protein chuẩn. Protein mg/ml 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.40 0.50 A750 0.124 0.136 0.147 0.159 0.178 0.209 0.231 So với mẫu trắng A750 = 0.106, ta được kết quả hiệu chỉnh như ở bảng 3. Bảng 3: Mật độ quang của các dung dịch protein chuẩn (đã hiệu chỉnh). Protein mg/ml 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.40 0.50 A750 0.018 0.030 0.041 0.053 0.072 0.103 0.125 Các kết quả trên được biểu diễn ở hình 11. Hình 11: Đường chuẩn xác định hàm lượng aminoaxit và protein. Khi xử lý trên máy tính theo phương trình hồi quy tuyến tính ta tìm được phương trình liên quan. A750 = 0.2381Cprotein + 0.0053 (1) Đường chuẩn thực tế khá thẳng nên phương trình (1) có thể sử dụng để tính nhanh kết quả khi phân tích các mẫu. 2.3. Phân tích nước mắm. 2.3.1. Quy trình phân tích nước mắm. Dùng pipet lấy chính xác 2 ml dung dịch nước mắm cần phân tích cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất vào bình, lắc đều, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất (dung dịch mẫu). Tiếp theo lấy 0.5 ml dung dịch mẫu cho vào một ống nghiệm sạch, khô. Thêm tiếp vào ống nghiệm 0.5 ml H2O +2.5 ml Biure + 0.25 ml Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm. Hàm lượng aminoaxit và protein trong nước mắm được tính theo công thức sau: Ghi chú: Hàm lượng protein tính theo phương trình đường chuẩn là số mg protein/ml và được tín