Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

giới thiệu một số nghiên cứu định lượng cefixim. 1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang - Định lượng cefixim trong viên nén khi đánh giá độ hòa tan tại λ = 288 nm, mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 7,2 (6,8 g KH2PO4, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6], [22]. 1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC  Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch - Cột: C18 (0,125 m x 4 mm, 5µm) - Pha động: ACN : dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,4 M pH = 6,5 (chỉnh pH bằng dung dịch H3PO4 1,5 M) (1:3) - Detector: UV λ = 254 nm - Tốc độ dòng: điều chỉnh cho thời gian lưu của cefixim khoảng 10 phút [6], [13], [22]. 8  Mẫu dịch sinh học  Phạm Thu Trang: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng dung dịch acid HClO4 20% - Điều kiện phân tích: o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40 o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH2PO4 12,5 mM, KH2PO4 5 mM; TBAH 0,06 mM) = 35 : 65, tốc độ dòng 1,5 ml/phút o Detector: DAD λ =285nm [10].  Abbas Khan và cộng sự: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng acid tricloroacetic - Điều kiện phân tích: o Cột Supelco Discovery HS C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 50 o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic(19:81), tốc độ dòng 2 ml/phút o Detector: UV λ = 285 nm [16].  Joy A. McAteer và cộng sự: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng ACN - Điều kiện sắc kí: o Cột Altex Ultrasphere C8 (150 x 4,6 mm, 5 µl) o Pha động: MeOH : dung dịch đệm phosphat pH 2,6 = 20:80, tốc độ dòng 2 ml/phút o Detector: UV λ = 254 nm [19].  Emirhan Nemutlu và cộng sự: mẫu huyết tương và nước ối - Chiết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X) - Điều kiện sắc kí: o Cột Xterra C18 (250 x 4,6 mm, 5 µl), nhiệt độ cột 32 o Pha động: dung dịch đệm phosphat 40mM pH = 3,2 và MeOH, gradient, tốc độ dòng 0,85 ml/phút o Detector: DAD λ = 285 nm [20]. 9  Mẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước uống đã được công bố - Chiết pha rắn cột SPE: Isolute EVN 100 mg - Điều kiện sắc kí: o Cột Luna C18 (250 x 2 mm, 5 µm) o Pha động: Acid formic 0,1% : ACN : MeOH, gradient thành phần pha động, tốc độ dòng 0.2 ml/phút o Detector: MS-MS [23]. Nhận xét Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được sử dụng trong nhiều trường hợp.Vậy nên cefixim là một trong những kháng sinh được quan tâm nghiên cứu nhiều. Các nghiên cứu về cefixim rất phong phú đa dạng từ định lượng cefixim trong chế phẩm, huyết tương tới định lượng trong nước thải. Các dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về cefixim [6], [13], [22]. Nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương cũng rất được quan tâm chú ý. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng riêng cefixim hay định lượng cefixim đồng thời với các chất khác [16], [19], [20]. Tại Việt Nam, cũng đã có những nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương [10]. Tuy nhiên những nghiên cứu về cefixim trong nước thải nhà máy còn khá ít. Các quy trình định lượng cefixim trong chế phẩm và huyết tương không thể áp dụng cho định lượng cefixim trong nước thải nhà máy. Chúng tôi mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng cefixim trong nước thải nhà máy [17]. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lí mẫu bằng chiết pha rắn. Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp. Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay chưa phổ biến tại Việt Nam. Trong khi đó, hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam. Vì vậy chúng tôi xây dựng quy trình phân tích cefixim trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng. 10 1.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.4.1 Khái niệm HPLC là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]. 1.4.2 Nguyên tắc Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha này là một chất lỏng được cho qua cột chứa các hạt pha tĩnh một cách liên tục. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng [1], [2]. 1.4.3 Phân loại Các kĩ thuật sắc kí lỏng: sắc kí phân bố, sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, sắc kí loại cỡ, sắc kí ái lực, sắc kí các đồng phân quang học. Trong khuôn khổ của đề tài tôi xin trình bày chi tiết về sắc kí phân bố. Sắc kí phân bố là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay. Có thể phân thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh: - Sắc kí lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự phân bố giữa 2 pha lỏng. - Sắc kí pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn ví dụ như silica, alumina... [1], [2]. 1.4.4 Các thông số đặc trưng * Hệ số phân bố K Trong đó CS 11 CS : nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh. CM: nồng độ mol của chất tan trong pha động. K càng lớn, sự di chuyển của các chất của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [1]. * Thời gian lưu tR Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích đến derector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định. Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất [1]. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: - Bản chất của pha tĩnh - Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động - Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan - Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH pha động. * Hệ số dung lượng k’ k’ = = K. Trong đó: K: hệ số phân bố VS: thể tích pha tĩnh VM: thể tích pha động Cần chọn cột, pha động... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu [1]. * Hệ số đối xứng của pic AF AF = Ở đây: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic, : Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic 12 Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 AF 2 [1]. * Số đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N: Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột. 2 2/1 2 54,516       =   = W t W tN RR Trong đó : W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh [1]. * Độ phân giải - Độ phân giải đánh giá khả năng tách hai chất trên sắc ký đồ cho 2 pic liền kề. AB RARB AB RARB S WW tt WW ttR 2/12/1 )(18,1)(2 + − = + − = - Trong đó : tRA, tRB : Thời gian lưu của 2 pic liền kề WA, WB : Độ rộng của pic đo ở các đáy pic. W1/2A, W1/2B : Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic. Các giá trị tRA, tRB ,WA, WB , W1/2A, W1/2B phải tính theo cùng đơn vị [1]. - Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5. 1.4.5 Ứng dụng của HPLC - Định tính : - Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc kí đồ của chuẩn và thử là cơ sở của phép định tính. Trên các máy HPLC hiện đại với detector mảng diod ta có thể quét phổ UV-VIS của chất phân tích trên sắc kí đồ mẫu chuẩn và mẫu thử rồi chồng phổ với nhau để xác định sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI- similarity index). - Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn. - Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao. - Hệ số Match 0,990 : hai phổ tương tự nhau. - Hệ số 0,900 Match 0,990 : hai phổ có những điểm tương đồng. - Hệ số Match 0,900 : hai phổ khác nhau. - Định lượng : 13 Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ chất phân tích trong dung dịch (diện tích pic hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc kí là cơ sở của phép định lượng Các phương pháp định lượng có thể áp dụng là : - Phương pháp dùng chuẩn ngoại. - Phương pháp dùng chuẩn nội. - Phương pháp thêm chất chuẩn. - Phương pháp chuẩn hóa diện tích. Trong đó phương pháp dùng chuẩn ngoại được sử dụng nhiều. Đây cũng là phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này. Vì vậy sau đây chúng tôi xin trình bày chi tiết về phương pháp chuẩn ngoại dùng trong định lượng bằng HPLC. * Phương pháp dùng chuẩn ngoại Phương pháp dùng chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản. Trong đó cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc kí trong cùng một điều kiện. Nguyên tắc : so sánh diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu thử với diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu chuẩn để tính nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm.  Chuẩn hóa 1 điểm : Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức : CX = CS . SX/SS Trong đó : CX : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử CS : nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn SX (HX) : diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử SS (HS) : diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn  Chuẩn hóa nhiều điểm :Tiến hành qua các bước như sau : Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc kí. Các đáp ứng thu được là diện tích pic hoặc chiều cao pic của mỗi dung dịch chuẩn. 14 Để tính toán nồng độ của chất phân tích có thể sử dụng 1 trong 2 cách sau : - Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Từ diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử và đường chuẩn đã xây dựng sẽ suy ra được nồng độ của chất thử. - Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định. Y = a. CX + b Trong đó : Y : Diện tích pic b : Giao điểm của đường chuẩn với trục tung a : Độ dốc của đường chuẩn CX : Nồng độ chất thử Dựa vào phương trình hồi quy tính nồng độ chất thử : CX = (Y-b)/a Lưu ý : Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1], [2]. 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Sử dụng nước thải nhà máy dược phẩm của công ty Mediplantex – một trong những công ty có dây chuyền sản xuất các cephalosporin trong đó có cefixim làm nền mẫu trong nghiên cứu này. Tiến hành lấy mẫu nước thải của công ty Mediplantex vào ngày không sản xuất cefixim, thêm cefixim chuẩn để từ đó xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải nhà máy. 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu : Các chất chuẩn : - Cefixim : Chuẩn quốc gia, SKS : 0105192, hàm lượng 98,88%, độ ẩm 10,57%, nơi sản xuất VKNTTW. - Cefuroxim natri, cephadroxil, cefdinir, ceftazidim, cefotaxim, cefoperazon : chuẩn làm việc. Thuốc thử, dung môi sử dụng trong nghiên cứu như sau : - ACN, MeOH loại tinh khiết dùng cho HPLC, nơi sản xuất Merck, Đức. - Dicloromethan, cloroform, diethyl ether, natri dihydrophosphat, acid phosphoric loại PA, nơi sản xuất Merck, Đức. - Giấy thử pH, nơi sản xuất VKNTTW 16 a.Hệ thống HPLC Merck - Hitachi b.Một số chất chuẩn – hóa chất c.Mẫu nước thải của nhà máy Mediplantex Hình 2.1. Hóa chất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ 2.2.2. Thiết bị - dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ tại Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương (được chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP ) gồm có : - Máy lắc siêu âm LK 106 (Đức) - Cân phân tích Metler Toledo (d=0,01 mg, e = 0,1 mg) (Thụy Sĩ) - Máy li tâm Hettich zentrifugen (Đức) - Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Merck – Hitachi với detector DAD, phần mềm Multi-system manager, Interface D700, Nhật Bản - Dụng cụ thủy tinh các loại 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu - Mục đích: tìm được loại dung môi, tỉ lệ dung môi xử lí mẫu có hiệu suất cao, loại được nhiều tạp chất. - Tiến hành xử lí mẫu thử chứa cefixim bằng các cách khác nhau. Định lượng hoạt chất theo quy trình đã lựa chọn. Đánh giá và tìm ra cách xử lí phù hợp. 2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc kí Nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí về cột sắc kí, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu trên thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector DAD nhằm lựa chọn được điều kiện sắc kí phù hợp nhất để định lượng cefixim. 2.3.3. Đánh giá phương pháp Xử lí các mẫu nghiên cứu theo phương pháp xử lí đã xây dựng, tiến hành sắc kí các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.  Độ thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liên tiếp. Yêu cầu: RSD% về thời gian lưu và diện tích pic < 2% [15].  Độ đặc hiệu :Trên sắc kí đồ, mẫu trắng phải không có pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn [15].  Độ tuyến tính: Kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử. Xây dựng đường chuẩn 6 điểm (X1 đến X6) của dung dịch có chứa chất chuẩn cefixim ở trong khoảng nồng độ phù hợp. Tiến hành sắc kí theo điều kiện đã chọn. Tiêm 3 lần mỗi mẫu. Tính giá trị trung bình. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan r của cefixim. Yêu cầu: r > 0,997 [15]. 18  Độ đúng: sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận. Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích trên mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng. Tiến hành trên 3 điểm nồng độ: 2 - 3 lần LLOQ, 40 - 60% ULOQ, 70 – 90% ULOQ. Tính tỉ lệ chuẩn thu hồi lại được và lượng chuẩn thêm vào để có được độ đúng của phương pháp. Yêu cầu: - Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: độ thu hồi từ 80 – 110 % [21]. - Nồng độ từ 10 – 100 ng/ml: độ thu hồi từ 60 – 115 % % [21].  Độ chính xác: sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả. Độ chính xác có thể chia làm 3 cấp độ: Độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp. Chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian. - Độ lặp lại: tiến hành cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Yêu cầu: Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: RSD% từ 11 – 15% [21]. - Độ chính xác trung gian: thực hiện trong cùng một phòng thí nghiệm, thực hiện ở hai ngày khác nhau. Yêu cầu: Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: RSD% từ 11 – 15% [21]. - Gộp kết quả 2 ngày: FTN < FLT Với FTN = (FTN > 1) FLT (0,05,5,5)  Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Giới hạn phát hiện (LOD) của cefixim được xác định dựa vào hệ số góc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của đáp ứng. - Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện [15]. 2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu Các kết quả thống kê được tính dựa vào các hàm trong Microsoft Excel. 19 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu Qua tham khảo tài liệu chúng tôi tiến hành xử lí mẫu bằng cách kết tủa protein và loại tạp bằng dung môi trước khi phân tích HPLC vì phương pháp này đơn giản, kinh tế, tiết kiệm thời gian. Chúng tôi khảo sát để lựa chọn dung môi xử lí mẫu và lượng dung môi để tìm ra quy trình xử lí mẫu sạch nhất, hiệu suất cao, dễ thực hiện. Kết quả khảo sát được đánh giá qua hiệu suất xử lí mẫu : lượng cefixim tính được trong mẫu sau xử lí so sánh với lượng cefixim thêm vào mẫu nước thải. 3.1.1.1 Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu Cefixim có giá trị log Poctanol/nước = -0,64 nên việc chuyển cefixim từ pha nước (nước thải) sang pha dung môi là khá khó khăn. Chúng tôi tiến hành xử lí mẫu với mục đích loại tạp chất tan trong dung môi hữu cơ, cefixim vẫn ở trong pha nước. Do đó cần lựa chọn dung môi ít hòa tan cefixim nhất. Chúng tôi khảo sát xử lí mẫu nước thải chứa cefixim với 3 dung môi : dicloromethan, diethyl ether, cloroform với cùng tỉ lệ mẫu thử : ACN : dung môi = (5 : 1 : 3) Chuẩn bị các mẫu thử và mẫu chuẩn : - Mẫu chuẩn gốc (cefixim 50 µg/ml trong nước cất): Cân chính xác khoảng 25 mg cefixim hòa tan trong vừa đủ 500 ml nước cất. - Mẫu thử: pha loãng chính xác 2 ml mẫu chuẩn gốc trong vừa đủ 200 ml mẫu nước thải trắng. - Mẫu chuẩn: pha loãng mẫu chuẩn gốc trong nước cất để được nồng độ cefixim 500 ng/ml.  Tiến hành: - Lần lượt xử lí mẫu thử với từng dung môi trong 3 dung môi dicloromethan, cloroform, diethyl ether. - Dung dịch thử: mẫu thử được acid hóa với HCl 1N đến pH khoảng bằng 3, thử bằng giấy chỉ thị màu pH. Lấy chính xác 5 ml dung dịch thử vào các ống nghiệm, thêm 1ml ACN, lắc xoáy trong 30s, đem ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút 20 trong 3 phút, lấy dịch trong nổi phía trên. Thêm 3 ml dung môi chiết lắc trong 5 phút, để cho tách lớp. Lấy lớp nước (đối với dicloromethan, cloroform lấy dịch phía trên, đối với diethyl ether lấy dịch phía dưới) ly tâm nếu cần, lọc qua màng lọc 0,45 µm. - Dung dịch chuẩn: mẫu chuẩn được lọc qua màng lọc 0,45 µm . - Tiến hành sắc kí theo điều kiện sắc kí đã chọn mục 3.1.3. Kết quả thu được như hình 3.1 và bảng 3.1. Bảng 3.1.Khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu Chuẩn Chiết với dicloromethan Chiết với cloroform Chiết với diethyl ether Diện tích pic(mAu.s) 153672 124109 75993 64927 Hiệu suất chiết (%) - 80,76% 49,45% 42,25% Hình 3.1.Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu b.Xử lí mẫu với cloroform c.Xử lí mẫu với diethyl ether a.Xử lí mẫu với dicloromethan 21 Nhận xét : - Cả 3 dung môi đều dễ tách lớp, không bị nhũ hóa trong quá trình xử lí mẫu. Quá trình xử lí mẫu tương đối dễ dàng và tốn ít thời gian. - Mẫu xử lí với dicloromethan cho hiệu suất cao nhất. - Mẫu xử lí với dicloromethan và diethyl ether tương đối sạch, trong khi đó mẫu chiết với cloroform vẫn còn nhiều tạp chất. Do đó dựa trên tiêu chí về thời gian xử lí mẫu, hiệu suất, độ sạch tạp chất của mẫu, độ đơn giản chúng tôi chọn dicloromethan là dung môi xử lí mẫu. 3.1.1.2. Lựa chọn tỉ lệ dung môi xử lí mẫu Chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ thể tích của mẫu thử, ACN, dicloromethan để lựa chọn tỉ lệ dung môi hợp lý nhất. Chuẩn bị các dung dịch thử và chuẩn như phần 3.1.1.1  Tiến hành : - Xử lí mẫu thử với tỉ lệ dung môi dicloromethan khác nhau. Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 tỉ lệ về thể tích của mẫu thử, MeCN, dicloromethan như sau : + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :2) + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :3) + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :4) - Các bước tiến hành như mục 3.1.1.1 - Kết quả thu được như ở hình 3.2. 22 Hình 3.2 Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn lượng dung môi xử lí mẫu Nhận xét: - Với cả 3 tỉ lệ dung môi xử lí mẫu khác nhau, các mẫu đều không bị nhũ hóa, dễ dàng tách lớp. - Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:2), nền mẫu vẫn còn nhiều tạp chất, hiệu suất thấp. - Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:4), nền mẫu sạch tuy nhiên hiệu suất thấp. - Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:3), nền mẫu sạch, hiệu suất tương đối cao 80,76%. a.Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :2) c. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :4) b. Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :3) 23 Do đó dựa trên tiêu chí về độ sạch tạp chất trong mẫu, hiệu suất cefixim sau xử lí mẫu chúng tôi lựa chọn tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5: 1 :3) để tiến hành xử lí mẫu trước khi phân tích. Như vậy, qua quá trình khảo sát lựa chọn dung môi, lượng môi dung xử lí chúng tôi lựa chọn quy trình xử lí mẫu cụ thể như sau: “ Acid hóa mẫu thử bằng HCl 1N đến pH khoảng bằng 3, thử bằng giấy chỉ thị màu pH. Lấy chính xác 5 ml mẫu thử và 1ml ACN cho vào ống nghiệm, lắc xoáy 30s, ly tâm 3000 vòng trong 3 phút, lấy dịch nổi phía trên. Thêm 5 ml dicloromethan, lắc trong 5 phút, để yên cho tách lớp. Lấy lớp nước phía trên (ly tâm nếu cần), lọc qua màng lọc 0,45 µm”. 3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích Một nhà máy sản xuất cephalosporin thường sản xuất đồng thời nhiều cephalosporin, do vậy điều kiện sắc kí đòi hỏi phải định lượng được cefixim khi có mặt các cephalosporin khác trong nền mẫu. Chúng tôi tiến hành khảo sát thay đổi điều kiện sắc kí về cột sắc kí, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu nhằm tìm ra điều kiện sắc kí tối ưu nhất có khả năng tách được cefixim trong hỗn hợp gồm 6 cephalosporin khác: cephadroxil, cefdinir, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, cefoperazon. Tiến hành: pha một hỗn hợp gồm cefixim và 6 cephalosporin kể trên có nồng độ 500 ng/ml trong nước cất, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến hành sắc kí. Qua quá trình khảo sát chúng tôi lựa chọn được điều kiện sắc kí như sau: Cột: Cột Luna C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) Detector DAD: λ = 285 nm Thể tích tiêm mẫu: 200 µl Nhiệt độ cột: 32°C Pha động: methanol – dung dịch đệm phosphat pH = 3,2 (NaH2PO4 40 mM, chỉnh pH bằng H3PO4) Pha động và tốc độ dòng: gradient 24 Thời gian (phút) MeOH (%) Đệm phosphat (%) Tốc dộ dòng (ml/phút) 0 18 82 1,0 10 45 55 1,0 16 55 45 0,85 18 18 82 0,85 Để lựa chọn được điều kiện sắc kí như trên chúng tôi đã tiến hành khảo sát chọn cột sắc kí, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu, quét phổ dung dịch chuẩn tìm λmax như sau: 3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí - Chúng tôi đã tiến hành khảo sát trên 3 loại cột Hypersil C18 BDS (250 x 4.6mm, 5µm), cột Zorbax SB (300 x 4.6mm, 5µm), cột Luna C18 (250 x 4.6mm, 5µm) với các điều kiện khác như mục 3.1.3. Kết quả như hình 3.3 25 Hình 3.3 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí Nhận xét: - Sắc kí đồ tiến hành trên cột Hypersil C18 BDS và cột Zorbax SB18 pic của cefixim không tách khỏi pic của các cephalosporin khác và không cân xứng. - Sắc kí đồ tiến hành trên cột Luna C18, pic cefixim tách khỏi pic của các cephaloporin khác, pic cân xứng. Thứ tự rửa giải các cephalosporin lần lượt như sau cephadroxil, ceftazidim, cefdinir, cefixim, cefuroxim, cefotaxim, cefoperazon. Do đó chúng tôi lựa chọn cột Luna C18 để tiếp tục nghiên cứu. 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng Chúng tôi tiến hành khảo sát 2 chương trình pha động và tốc độ dòng. Các điều kiện sắc kí khác như mục 3.1.3. Chương trình pha động và tốc độ dòng khảo sát như sau: a. Cột Hypersil C18 BDS b. Cột Zorbax SB18 c. Cột Luna C18 26 - Chương trình 1: chương trình đẳng dòng pha động + Pha động: hỗn hợp ACN : MeOH (50:50) : dung dịch acid trifluoroacetic(19:81) + Tốc độ dòng: 2ml/phút + Nhiệt độ cột: 50 C + Các điều kiện khác như mục 3.1.3. - Chương trình 2: chương trình gradient pha động Các điều kiện sắc kí của chương trình gradient pha động như mục 3.1.3. Kết quả thu được như hình 3.4 Hình 3.4 Sắc kí đồ khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng Nhận xét: - Sắc kí đồ khảo sát chương trình đẳng dòng pic cefixim không tách khỏi các cephalosporin khác và pic không cân xứng. - Với sắc kí đồ khảo sát chương trình gradient pha động pic cefixim tách khỏi các cephalosporin khác, pic cân xứng. Vì vậy chúng tôi sử dụng chương trình gradient để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2.3. Khảo sát thể tích tiêm mẫu Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các thể tích tiêm mẫu: 20 µl, 50 µl, 200 µl. Các điều kiện sắc kí khác như mục 3.1.3. a.Chương trình đẳng dòng pha động b.Chương trình gradient pha động 27 Kết quả thu được như sau: - Về khả năng tách cefixim khỏi các cephalosporin khác: với cả 3 thể tích tiêm mẫu, pic cefixim đều tách khỏi pic của các cephalosporin khác, pic cân xứng. - Về diện tích pic của cefixim kết quả được ghi lại trong bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu Thể tích tiêm mẫu (µl) 20 50 200 Diện tích pic (mAu.s) 32501 66860 148302 Hình 3.5 Mối liên quan giữa thể tích tiêm mẫu và diện tích pic Với thể tích tiêm mẫu 200 µl, pic cefixim vẫn tách khỏi pic các cephalosporin khác, pic cân xứng, tăng đáp ứng diện tích pic. Do vậy, chúng tôi chọn thể tích tiêm mẫu 200 µl để tiến hành nghiên cứu tiếp. Tiến hành sắc kí theo điều kiện mục 3.1.3 dung dịch chuẩn pha như mục 3.1.1.1 từ λ = 220 – 400 nm thu được λmax = 285 nm. Vì vậy, chọn bước sóng phát hiện tại λ = 285 nm. 3.1.3 Quy trình phân tích Từ những kết quả khảo sát ở trên, chúng tôi đưa ra quy trình định lượng cefixim trong nước thải cụ thể như sau:  Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn: