Khóa luận Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây xuân hoa (Pseudranthemum palatiferum)

độ gây ức chế thấp nhất để tránh gây tác dụng phụ. Sử dụng lá hay bột Xuân Hoa có thể cải thiện những thông số đo lƣờng nói trên và kết quả có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Trƣớc tiên, lá Xuân Hoa chứa một tỉ lệ cao protein thô (30,8% DM: dry matter), so sánh với cỏ voi (18,6% DM) và cây sắn dây (18,4% DM). Ảnh hƣởng của liều sử dụng sẽ rất nhỏ bởi vì tỉ lệ nhỏ của nó trong khẩu phần. Thứ hai, lá Xuân Hoa có hàm lƣợng cao một số loại khoáng nhƣ: Ca (6,5% DM), K (4,4% DM), Mg (6,3% DM), Fe (0,3% DM). Hàm lƣợng Fe, đặc biệt trong các chất khoáng cao gấp 4 lần đậu nành và 3 lần gan heo. Fe trong cây sẽ góp phần cải thiện tình trạng sinh lý máu bởi vì Fe cần thiết cho heo để thúc đẩy hồng cầu, đặc biệt hemoglobin có chức năng nhƣ một thể mang oxy và cacbonic, vì thế nó đƣợc biết nhƣ một sắc tố hô hấp và giải thích tình trạng của hồng cầu. Thứ ba, trong lá có chứa một protein ổn định nhiệt đƣợc gọi là pseuderantin (0,4% trong protein thô) có hoạt tính mạnh trong việc tiêu hoá casein và do đó việc tiêu hóa sữa sẽ đƣợc cải thiện nếu bổ sung lá. Thứ tƣ, một số hợp chất hoá học trong lá và một vài tác nhân kháng khuẩn có thể ảnh hựởng tới sự phát triển và miễn dịch của heo. Kết luận: Sử dụng bột lá Xuân Hoa với 0,2 g/kg thể trọng cho 30 ngày đối với heo chƣa cai sữa và đã cai sữa đã cải thiện sự tăng trọng và ngăn ngừa bệnh dịch tả, cho nên cây trồng này có nhiều triển vọng thay thế hoặc giảm sử dụng kháng sinh trong tƣơng lai. 2.3. Thành phần hoá học [4, 5] 13 Hiện nay trên thế giới chƣa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Xuân Hoa, chỉ có một số công trình nghiên cứu bƣớc đầu về cây này ở Việt Nam nhƣ Trần Công Khánh (1998), Phan Phƣớc Hiền (2005), Huỳnh Kim Diệu (2003). Các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác. Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng nhƣ Cd, Pd, As, Cr. Đáng chú ý là hàm lƣợng Vanadi khá cao (3,75 mg/100 g lá tƣơi). Ngoài ra, lá Xuân Hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lƣợng tổng số khá cao (751-1365 mg%). Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi cơ thể. Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh. Lá Xuân Hoa còn giàu Valin (29-1001 mg%). Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi. Valin còn ảnh hƣởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hoá quan trọng. Trong các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Xuân Hoa ngƣời ta đã tìm thấy -Sitosterol, Phytol, 3-O-( -D glucopyranosyl)-Sitosterol, hỗn hợp gồm hai đồng phân epime stigmasterol và poriferasterol, n-pentacosan-1-ol và hỗn hợp của kaumpferol 3-methyl ether 7-O- -glucoside và apigenin 7-O- -glucoside [4]. Nguyễn Văn Hùng và cộng sự (2004) [4], đã phân lập đƣợc tiếp theo là: 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, acid palmitic và acid salicylic. - Triacontanol: Là chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 87-880C, là một Ancol no bậc một, không phân nhánh với công thức là : C30H62O. 1-triacontanol là một chất điều hòa sinh trƣởng thực vật. Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy 1- triancontanol có hoạt tính kháng viêm, ức chế các quá trình peroxy hóa các chất béo có cũng nhƣ không có sự tham gia của các enzyme và làm giảm mỡ trong máu. - Glycerol 1-hexadecanoate: Dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 65-670C, là một mono-ester của glycerin với acid Palmitic và công thức phân tử là C19H38O34. 14 - Acid palmitic: Là chất rắn màu trắng, nóng chảy ở 48-510C, có đặc trƣng của một acid béo no mạch thẳng. - Acid Salicylic: Thu đƣợc dƣới dạng tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 140-142 0C và công thức phân tử là: C7H6O3. Acid salicylic có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn. Acid salicylic tổng hợp đƣợc sử dụng trong nhiều loại chế phẩm dựa vào tính chất này. Với các họat tính nêu trên, sự có mặt của 1-triancontanol và acid salicylic trong lá cây Xuân Hoa có thể góp phần giải thích các hoạt tính đã đƣợc phát hiện thấy trong các công trình nghiên cứu trƣớc đây cũng nhƣ giải thích tác dụng chữa bệnh của cây Xuân Hoa theo kinh nghiệm sử dụng trong dân gian. Tám hợp chất Dotriacontan, phytol, squalen, 24-metylencycloartanol, loliolide, - sitosterol, -sitosterol 3 -O-D-glucopyranosid và stigmasterol 3 -O-D-glucopyranosid lần đầu tiên đƣợc cô lập trong lá cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum(Nees) Radlk, họ Ô rô (ancathaceae) của Trần Kim Thu Liễu và cộng sự (2006). 2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên [ 7 ]. 2.4.1. Alcaloid Là những hợp chất thiên nhiên với nhiều dạng cấu trúc khác nhau và có hoạt tính sinh học rõ rệt. Đa số alcaloid hiện diện trong loài cây hạt kín, cây có hoa nhƣng cũng tìm thấy trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật và thực vật hạ đẳng. Đa số alcaloid không màu, ở dạng kết tính rắn, có nhiệt độ nóng chảy hoặc nhiệt độ phân hủy xác định. Vài alcaloid ở dạng keo, vô định hình và alcaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) hoặc có màu (berberin màu vàng; betanidin màu đỏ). Các alcaloid ở dạng bazơ tự do thƣờng hoà tan đƣợc trong dung môi hữu cơ, tuy nhiên các alcaloid ở dạng bazo tứ cấp thì chỉ hòa tan trong nƣớc. Muối của đa số alkaloid thì 15 hòa tan trong nƣớc. Độ hòa tan của alkaloid và các muối của chúng giữ vai trò quang trọng trong kỷ nghệ dƣợc phẩm; trong việc trích ly chúng ra khỏi cây cỏ và trong việc bào chế alcaloid thành các dạng thuốc phù hợp. Đa số alcaloid có tính kiềm, điều này khiến cho alcaloid cực kỳ nhạy cảm, dễ bị thủy phân khi gặp ánh sáng hoăc nhiệt độ. Nhiều alcaloid đã đƣợc sử dụng để làm thuốc trị bệnh. Alcalid có tác dụng kích thích thần kinh nhƣ: strychnine, cafein, lobelin…có khả năng diệt ký sinh trùng và các nguyên sinh động vật nhƣ: emetin, quinin, conessin, berberin. Các alcaloid có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ƣơng nên đƣợc dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẩu hoặc khi bị bệnh ung thƣ giai đoạn cuối: morphin và các dẫn xuất của morphin nhƣ: heroin, codein (tuy nhiên các hợp chất này có thể gây ra tình trạng uể oải, buồn ngủ, khó thở và nghiện thuốc). Có alcaloid đƣợc bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanolol. Một số alcaloid nhƣ: berberin, palmatin, taspin…có khả năng ức chế con men sao chép ngƣợc (reverse trancriptase) đây là con men chủ yếu của retrovirus mà các loại thuốc kháng HIV tập trung tiêu diệt. 2.4.2. Flavonoid Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa…Phần lớn có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng đƣợc xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sƣờn. Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glicosid. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhamnose; L-Arabinose… Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glicisid flavonol nhƣ: rutin, quercitrin, daempherol. Kaempherol rất thƣờng xuyên hiện diện. Antocyanidine dạng glicosid thí 16 dụ nhƣ: pelargonidin; cyanidin; delphinidin…tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái. Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và thƣờng có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam-đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dƣơng tạo màu cho nhiều loại hoa và trái. Quercetin ở môi trƣờng kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhƣng ở môi trƣờng acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng Salmonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật. Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid nhƣ rotenon (trích từ dây thuốc cá Derris elliptica Benth, họ Đậu) có tính độc đối với cá và côn trùng nhƣng không độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng nhƣ hợp chất pyrethrin (trích từ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc). 2.4.2. Tinh dầu Nói chung, tinh dầu trích ly từ thực vật có cấu trúc terpenoid. Từ 2000 năm trƣớc ngƣời ta đã biết sử dụng turpentine để trị ho. Mentol là alcol terpen trích từ tinh dầu bạc hà có khả năng gây tê cục bộ, nên góp phần vào đặc tính trị ho của nó. Các gia vị nhƣ: hồ tiêu, gừng, nhục đậu khấu, đinh hƣơng…bên cạnh mùi vị làm chúng có giá trị trong ngành ăn uống, chúng còn có tác dụng kháng khuẩn. Nhiều tinh dầu có khả năng kháng khuẩn mạnh nhƣ: tinh dầu rau ngỗ Enhydra fluctuans; tinh dầu hồi Illicium verum; tinh dầu quế Cinhamomum; tinh dầu long não Cinnamonium campho; tinh dầu gừng Zingiber officinalist; tinh dầu nghệ Curcuma longa… 2.4.3. Saponin Là một loại glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trƣng: khi hòa tan vào nƣớc sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết. Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thƣờng cao từ 200oC trở 17 lên và có thể trên 300oC. Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormone steroid có hoạt tính cao. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn. 2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột [8, 12] 2.5.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đƣờng ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có men oxidase, lên men đƣờng glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không, nhƣng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào. 2.5.2. Hình thể Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-). Kích thƣớc trung bình 2-4 m x 0,4-0,6 m. Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột không bao giờ sinh nha bào. Mộ số có vỏ, có thể quan sát đƣợc bằng kính hiển vi thông thƣờng. 2.5.3. Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột có thể mọc đƣợc trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Trong môi trƣờng lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trƣờng, có thể phát triển thành váng trên bề mặt, nhƣng cũng có thể vừa làm đục môi trƣờng vừa có cặn ở dƣới đáy ống. Trên môi trƣờng đặc có 3 dạng khuẩn lạc: - Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. - Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thƣờng gặp khi nuôi cấy giữ chủng. - Dạng M: Hình thức phát triển này thƣờng gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thƣớc lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hƣớng hòa vào nhau. 2.5.4. Đặc tính sinh hoá Những đặc tính sau đây thƣờng đƣợc xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đƣờng ruột: 18 - Di động hoặc không di động. - Lên men hoặc không lên men một số loại đƣờng. Hai loại đƣờng thƣờng đƣợc xác định nhất là glucose và lactose. - Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đƣờng. - Có hay không có một số enzym. Hai enzym thƣờng đƣợc xác định nhất là urease và tryptophanase. - Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lƣu huỳnh. - Phát triển đƣợc hay không phát triển đƣợc trên một số môi trƣờng tổng hợp. Ví dụ: khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trƣờng Simmons. 2.5.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng hình thành nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trƣờng. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100oC và bởi các hoá chất sát khuẩn thông thƣờng. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trƣờng. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 2.5.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đƣờng ruột đều có nội độc tố. Bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ đƣợc giải phóng khi tế bào bị li giải. Nội độc tố có khối lƣợng phân tử từ 100000 đến 500000 dalton. Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhƣng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ). Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không đƣợc điều trị tích cực kịp thời, để chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100oC trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc. 19 Một số thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sinh ngoại độc tố nhƣ S.Shiga, E.Coli loại Enterotoxigenic E.Coli (ECET). Ngoại độc tố của S.Shiga làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đƣờng ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. - Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân của vi khuẩn. đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết địng tính độc. Không bị phá huỷ ở 100oC trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhƣng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết, gọi là “hiện tƣợng ngƣng kết O” với các hạt ngƣng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tƣợng ngƣng kết O có thể bị che lấp bới kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thƣờng đƣợc dùng để phân loại vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên O ngƣời ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh. - Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Có bản chất là protein, để phá huỷ ở 100oC hoặc trong cồn 50% nhƣng không bị phân huỷ trong formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra “hiện tƣợng ngƣng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tƣợng ngƣng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tƣơng ứng sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể đƣợc sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tƣơng ứng. Để có kháng nguyên O, ngƣời ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H ngƣời 20 ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá huỷ, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. - Kháng nguyên K: Là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dƣới dạng một lớp vỏ dày, quan sát đƣợc bằng kính hiển vi quang học thông thƣờng (nhƣ ở Klebsiella) hoặc dƣới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (nhƣ ở S.Typhy). Kháng nguyên K nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngƣng kết không xảy ra. Trong trƣờng hợp này cần phải phá huỷ kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải đƣợc nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra đƣợc kháng nguyên này. 2.5.8. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đƣờng ruột, trƣớc hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa. Họ vi khuẩn đƣờng ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thƣơng ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tuỳ theo từng giống, từng loài. Ngoài đƣờng tiêu hóa, các vi khuẩn đƣờng ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác nhƣ tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đƣờng tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột. 2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm 2.6.1. Staphyllococcus aureus - Là vi khuẩn gram dƣơng, không giáp mô, không tạo bào tử. - Sức đề kháng: nhạy cảm với Penicillin, Authromycin và Ampicilin. - Khả năng gây bệnh: o Sƣng mủ trên da, niêm mạc. o Gây ung nhọt, áp xe. 21 o Viêm vú ở bò cừu. o Gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi, viêm thận cấp, viêm tuyến sữa và viêm tủy xƣơng. 2.6.2. Pseudomonas aeruginosa - Là vi khuẩn gram âm, có tiêm mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh. - Khả năng gây bệnh: o Gây bệnh mủ xanh ở động vật và ngƣời. o Viêm bàng quang, viêm tai có mủ ở ngƣời. 2.6.3. Escherichia coli (E.coli) - Là vi khuẩn gram âm, không bào tử - Sức đề kháng: Nhạy cảm với chloraphenicol, Streptomycin, Sunfamid, Trimethroprim. - Khả năng gây bệnh: E.coli có sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm thì E.coli mới gây bệnh: o Gây tiêu chảy o Bệnh phù thủng ở heo con o Viêm ruột 2.6.4. Salmonella - Salmonella là trực khuẩn dài 0,6 – 0,8 µm, có nhiều lông xung quanh thân, rất di động, không có vỏ, không sinh nha bào, nhuộm Gram bắt Gram âm. - Vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ thích hợp 37oC nhƣng có thể phát triển đƣợc từ 6 – 42oC, pH thích hợp là 7,6; phát triển đƣợc ở pH 6,9. o Trên môi trƣờng lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục môi trƣờng, sau 18 giờ môi trƣờng đục đều. o Trên môi trƣờng thạch thƣờng: Khuẩn lạc tròn lồi, bóng, thƣờng không màu hoặc màu trắng xám. 22 o Trên môi trƣờng phân lập SS: Khuẩn lạc có màu hồng; Trên môi trƣờng Istrati khuẩn lạc có màu xanh. - Độc tố: o Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt hoặc chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy ruột non xung huyết, mảng Payer bị phù nễ, đôi khi hoại tử. Nội độc tố có vai trò quyết định trong tính chất gây bệnh của Salmonella. o Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố có thể điều chỉnh thành giải giải độc tố. - Khả năng gây bệnh: o Sốt thƣơng hàn – phó thƣơng hàn. o Ngộ độc thức ăn. 2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH [3] Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từ thực vật nhƣ là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu khí đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng oxy để đạt năng lƣợng. Trong quá trình hô hấp chúng đã tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: anion superoxide (O2), hydroxyl (OH), chất oxy hóa nhƣ H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này cũng nhƣ các sản phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học nhƣ DNA, lipid, protein… Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm điều hòa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này nhƣ superoxide dismutase, catalae, glutathione peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn trong giới hạn cho phép của anion superoxide, H2O2 và các hydroperoxide hữu cơ tƣơng ứng, chúng đƣợc xem là các enzyme khử độc chính trong cơ thể. Đôi khi hệ thống bảo vệ trên bị quá tải, không khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại…các loại oxy hoạt tính cao này vƣợt quá 23 giới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa cho sinh vật. Các chất chống oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy hóa không mong muốn nhƣ các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…và các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. 24 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Vật liệu  Vật liệu: Lá cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum).  Nguồn gốc lấy mẫu: Lá Xuân Hoa đƣợc lấy từ 2 nguồn: - Tại doanh nghiệp tƣ nhân trà 7 Nga (Tây Ninh). - Vƣờn thực nghiệm trƣờng đại học Cần Thơ. 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện  Địa điểm Tại phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng đại học Nông Lâm.  Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện qua 2 phần: Phần 1: Tiến hành tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa và khảo sát tính kháng khuẩn. - Giai đoạn 1: Tiến hành chiết Soxhlet lá Xuân Hoa để thu các loại cao. Thời gian tiến hành từ ngày 1/4/2007 đến 27/4/2007. - Giai đoạn 2: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại cao để xác định cao có hoạt tính mạnh nhất. Từ ngày 29/4/2007 đến ngày 6/5/2007. - Giai đoạn 3: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên cao chloroform để tách các phân đoạn. Thời gian thực hiện từ ngày 8/5/2007 đến ngày 23/6/2007. 25 - Giai đoạn 4: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn để xác định phân đoạn kháng khuẩn. Thời gian thực hiện từ ngày 25/6/2007 đến ngày 2/7/2007. - Giai đoạn 5: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên phân đoạn kháng khuẩn để tách chất sạch. Thời gian thực hiện từ ngày 5/7/2007 đến ngày 19/7/2007. - Giai đoạn 6: Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học, Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội. Phần 2: Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ 23/7/2007 đến ngày 30/7/2007. 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ  Dùng cho các thử nghiệm sinh hóa: Tủ sấy. Máy xay mẫu. Bộ soxhlet. Máy cô quay. Bình lắc. Bình lắc quả lê. Phễu. Giấy lọc. Ống chạy sắc cột. Bình tam giác 50ml. Bình triển khai. Máy lắc. Bồn đánh siêu âm. 26 Micropipette loại 100 – 1000 µl. Đầu tipe loại 1000µl. Cân phân tích. Máy làm đá. Máy đo nhiệt độ nóng chảy. Máy đo OD. Ống nghiệm. Giấy bạc. Parafirm. Pipette Pasteur. Đèn cồn. Cây kẹp.  Dùng cho thử nghiệm vi sinh: Ống nghiệm. Đĩa petri. Đèn cồn. Tủ ấm. Tủ sấy. Tủ hấp autoclave. Bông không thấm. Micropipette loại 100-1000 µl. Micropipette loại Đầu tipe loại Que cấy vòng. Tâm bông vô trùng. 3.3.2. Hóa chất  Dùng cho thử nghiệm sinh hóa: 27 Methanol (Trung Quốc, Merck). Ethanol (Trung Quốc). Chloroform (Trung Quốc). Ete dầu hỏa. Acetone. H2S04 98%. Hạt silicagel kích thƣớc 0,063 – 0,2 mm. Bản mỏng silicagel (TLC) loại 25DC – alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F254, Merck. Vitamin C. DPPH (1, 1- diphenyl- 2-picrylhydrazyl).  Dùng cho thử nghiệm vi sinh: Cồn. Nƣớc cất. Muối. Môi trƣờng BHI. Môi trƣờng TSA. Môi trƣờng thạch máu. DMSO (dimethylsulfoxid). 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Xử lý nguyên liệu Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu. 28 3.4.2. Điều chế các loại cao Tiến hành chiết soxhlet với 670 g bột mẫu khô trong 120 giờ với EtOH 70%, thu lấy dịch lọc, cô quay để loại bỏ dung môi. 3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa - Cho dịch lọc trên vào bình lắc quả lê, thêm 200 ml nƣớc cất vào, sau đó cho ete dầu hỏa vào. - Dịch lắc chia làm 2 pha: Pha ete dầu hỏa và pha nƣớc, hứng lấy dịch trích ete dầu hỏa, sau đó cô cạn bằng máy cô quay với áp suất thấp thu đƣợc cao ete dầu hỏa: 23 g - Tổng thể tích ete dầu hỏa dùng: 1,5 lít. Pha ete dầu hỏa Pha nƣớc Rửa sạch lá tƣơi Xuân Hoa Để khô tự nhiên Sấy khô đến trọng lƣợng không đổi ở nhiệt độ 40ºC Xay mẫu thành bột mịn 29 3.4.2.2. Điều chế cao chloroform - Lấy pha nƣớc ở trên cô quay để loại bỏ dung môi. - Cho chloroform vào lắc, dịch lắc chia làm 2 pha, thu lấy dịch chloroform, sau đó cô cạn bằng máy cô quay để loại dung môi chloroform thu đƣợc cao chloroform: 42 g - Tổng thể tích chloroform sử dụng: 2,5 lít. 3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol - Phần còn lại sau khi đã trích với chloroform đƣợc tiếp tục tận trích với n – butanol. - Dịch trích thu đƣợc đem cô quay thu đƣợc cao n-butanol:16 g - Tổng thể tích n-butanol sử dụng: 1,3 lít. 3.4.2.4. Điều chế cao nƣớc Phần còn lại đem cô quay thu đƣợc cao thô nƣớc. Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao. Dịch trích Ete dầu hỏa Bột khô 670 g chiết soxhlet với EtOH 70% Dịch trích EtOH Bã Pha nƣớc cô quay, chiết với ete dầu hỏa 30 3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao. - Chủng vi khuẩn: E.coli, Salmonella đƣợc lấy từ bệnh xá thú y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Pha loãng liên tiếp để xác nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại cao có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn. - Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để tiến hành thử nghiệm vi sinh vật là môi trƣờng BHI và TSA. 31 - Ph