Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất Azometin, Oxim và Hydrazon

3 tuần ). Theo một số tác giả các tetracyclin đọng lại ở trong răng trong những giai đoạn đầu của sự calci hoá, có ái lực với Ca của xương, do đó trẻ em dưới 8 tuổi có thể bị hỏng men răng, phụ nữ có mang dùng tetracyclin thì có thể giảm sự phát triển của xương dài và các nụ răng của thai người. Nói chung các tetracylin có hoạt phổ tác dụng rộng, bao gồm nhiều loại cầu khuẩn và trực khuẩn Gram(+) và Gram(-), xoắn khuẩn, Rickettsia, Trichomonas, Amip, giun kim, Chlamydia, Mycoplasma, không có tác dụng trên trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn lao, Proteus, Candida albicans. Tuy vậy các tetracyclin có tác dụng mạnh yếu khác nhau trên một số vi khuẩn .Ví dụ như với tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu thì clotetracyclin có tác dụng tốt hơn tetracylin, oxytetracyclin nhưng đối với trực khuẩn lỵ thì nguợc lại. Các tetracyclin khác nhau cũng có thời hạn bán huỷ khác nhau, có mức độ liên kết với protein của huyết thanh khác nhau do đó có liều dùng và mục đích điều trị cũng khác nhau. Ví dụ như doxycyclin hấp thụ nhanh và gần như trọn vẹn, bài xuất lại rất chậm nên duy trì nồng độ trong máu khoảng 24 (h), trong khi đó tetracyclin lại bài xuất rất nhanh trong nước tiểu, do đó khi dùng doxycyclin chỉ nên dùng ngày 1 lần với liều lượng thấp và không nên dùng trong trường hợp nhiễm khuẩn đường niệu và bệnh nhân bị thiểu năng thận. Hai trường hợp này thì nên dùng tetracyclin có tác dụng ngắn hạn do bài xuất nhanh. 1.3. Tính chất chung của các Oxim - Hydrazon - Azometin. 1.3.1. Tính chất vật lí [15]. * Oxim. Được hình thành do sự kết hợp của hydroxylamin với aldehyd hoặc ceton. Oxim thường là các chất rắn kết tinh, có điểm chảy xác định, ít tan trong nước( Trừ acetoxim ), tan trong alcolethylic, ether, DMF. Oxim của các aldehyd thơm và các ceton không đối xứng RCOR’ tồn tại dưới 2 dạng đồng phân syn và anti. Dạng syn ( cấu hình cis ) là dạng có nhóm OH ở cùng phía với gốc R hoặc Ar liên kết với Cacbon trong nhóm còn dạng anti có cấu hình đối lập. Điểm nóng chảy của oxim dạng anti cao hơn dạng syn. * Azometin Là những chất có cấu trúc imin ( - CH = N - ) thường không bền do khuynh hướng polyme hoá, ngưng tụ hoặc thuỷ phân. Dạng mạch hở thường không bền, không thể tách ra thành dạng tự do. Các azometin có cấu trúc thế thì bền vững hơn azometin có cấu trúc không thế. Với các azometin thế ở N ( dãy N - alkyl hoá hoặc N - aryl hoá ) cấu trúc R - CH = N - R’ thì gốc R là mạch hở thường là chất lỏng và kém bền, trong đó cấu trúc CH2 = N - R’ tồn tại ở trạng thái trimer hoá song cấu trúc của nó là một dị vòng, các chất khác nhanh chóng bị trùng hợp hoá. Với gốc R thơm thì azometin là những chất rắn kết tinh, tồn tại dưới dạng đơn phân tử, có tính kiềm, ít tan trong nước, tan trong alcol, cloroform, benzen, DMF ..., không tan trong ether. *Hydrazon Phần lớn hydrazon thơm là chất kết tinh. Các hydrazon vừa mới điều chế thường có mầu vàng nhạt hoặc không mầu. Xác định điểm nóng chảy là một trong những cách để định tính các hợp chất carbonyl, tuy nhiên việc xác định điểm nóng chảy của các hydrazon có khó khăn do nó dễ bị phân huỷ bởi nhiệt. 1.3.2. Tính chất hoá học * Oxim + Phản ứng thuỷ phân Khi đun nóng oxim với dung dịch acid vô cơ trong nước nó bị thuỷ phân trở thành hợp chất carbonyl ban đầu và hydroxylamin. + H2O + H2N – OH + Phản ứng khử hoá oxim bị khử hoá tạo sản phẩm là amin bậc 1 bởi các tác nhân khử thường dùng như LiAlH4, ZnCl2, Natri trong alcol, ..., không nên dùng chất khử acid để tránh thuỷ phân. + [H] + H2O Oxim của cyclohexanon khi hydro hoá với xúc tác đen platin trong dung dịch alcol - nước và hydrocloric tạo ra cyclohexyl hydroxylamin + H2 Các aldoxim khi bị khử hoá cũng có thể tạo thành hydroxylamin và amoniac 3 H2 + H2O + NH3 + Các phản ứng alkyl hoá và acyl hoá Oxim tác dụng với methyl iodua trong môi trường trung tính sẽ tạo ra dẫn xuất N-methyl - + Trong môi trường kiềm phản ứng methyl hoá xảy ra ở nguyên tử Oxy + Ngoài những phản ứng trên oxim còn tham gia một phản ứng rất quan trọng nữa, đó là chuyển vị Beckmann Khi cho anhydrid acetic hoặc acetylclorid tác dụng với cetoxim đáng lẽ thu được dẫn xuất acetyl của oxim thì Beckmann(1886) lại thu được amid thế . Những amid đó là đồng phân của oxim ban đầu và được tạo thành bằng cách chuyển vị nội phân tử gọi là chuyển vị Beckmann * Các azometin Tính chất cơ bản của azometin là do liên kết đôi (-HC=N-) không tương tự như các liên kết đôi ethylenic(C=C) . Các hợp chất này được phân biệt bởi 3 tính chất cơ bản sau - Tính base - Phản ứng cộng hợp - Sự dễ dàng cắt mạch mà điển hình là phản ứng thuỷ phân a. Tính base Do trên nguyên tử N có cặp điện tử không chia sẻ nên N là một trung tâm base Lewis. Liên hợp (n,ế) có ảnh hưởng nhất định đến tính chất base của hợp chất azometin.Ngoài ra,các nhóm thế trên nhân thơm của phần amin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến tính base này. (+) Kết hợp với acid tạo muối (-) R - CH = N - R’ + HCl b. Phản ứng cộng - Cộng hợp hydro R-CH=N-R’ +H2R - CH2 - NH - R’ - Cộng hợp halogen Sản phẩm cộng hợp halogen vào azometin làm bão hoà dây nối đôi R-CH=N-R’ + Br2 R - CHBr - NBr - R’ - Cộng hợp các acid sulfurơ và các sulfit kiềm C6H5 - CH = N - C6H5 + H2SO3 C6H5 - CH - N - C6H5 H SO3H - Cộng hợp với acid cyanhydric : cho sản phẩm là nitril R - CH = N - R’ + HCN R - CH - NH - R’ CN - Cộng hợp với các hợp chất cơ magie Theo Busch và cộng sự, các hợp chất cơ magie có thể tham gia phản ứng cộng với các azometin là dẫn chất của aldehyd thơm với các amin thơm Ar - CH = N - Ar + RMgX Ar - CH - N - Ar R MgX Ar - CH - NHAr + MgX(OH) R - Cộng hợp với các ceton Các ceton có hydro linh động ở vị trí a sẽ cộng hợp được với các azometin tạo thành hợp chất b-aminoceton, phản ứng thường cần xúc tác acid. R - CH = N - R’ + H3C - CO - C6H5 R - CH - NH - R’ CH2 – CO – C6H5 c.Phản ứng cắt mạch - Phản ứng thuỷ phân các azometin thế Các azometin N-alkyl bị thuỷ phân bởi dung dịch NaOH 30%, trong khi đó các base azometin N-aryl thì bền vững trong kiềm và bị thuỷ phân dễ dàng ở nhiệt độ lạnh với sự có mặt của acid vô cơ tạo aldehyd và amin tương ứng R - CH = N - R’ + H2ORCHO + H2N - R’ d. Độ bền vững của các azometin Các azometin được tạo thành từ aldehyd thơm và amin thơm mới bền vững, còn tạo thành từ aldehyd mạch hở và amin mạch hở thì thường không bền, dễ bị trùng hợp ( đặc biệt nhiều chất dễ bị trimer hoá ) tạo hợp chất dị vòng. * Hydrazon + Phản ứng thuỷ phân Đun nóng với acid vô cơ loãng bị thuỷ phân thành hydrazin và hợp chất carbonyl. C6H5-CH2-NH = N = CH - R + H2O RCHO + C6H5 - CH2 - N = NH + Với sự có mặt của ZnCl2, arylhydrazon của một số lớn các hợp chất carbonyl bị chuyển thành indol và amoniac. Phản ứng được tiến hành bằng cách nung chảy ở 180oC trên bình cách dầu. + Phản ứng oxy hoá Một số hydrazon thơm tạo hợp chất azoic có màu không bền ( azoic có màu ) + Phản ứng khử hoá Các hydrazon bị khử hoá tạo amin bậc nhất. 1.4. Tổng hợp các dẫn chất Oxim - Azometin - Hydrazon 1.4.1. Phương pháp tổng hợp chung Tính hoạt động của nhóm carbonyl là do sự phân cực của liên kết luôn phân cực về phía oxy vì oxy có độ âm điện lớn hơn của carbon. carbon của nhóm carbonyl là trung tâm tiếp nhận tác nhân ái nhân. Do đó dựa trên tính chất của nhóm carbonyl có thể ngưng tụ với các hợp chất kiểu B - NH2 tạo sản phẩm kết tinh có điểm nóng chảy xác định. 1.4.2 Cơ chế phản ứng Thực chất đây là phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl tạo ra sản phẩm cộng trung gian rất không bền và bị tách nước ngay thành sản phẩm ngưng tụ. Cơ chế phản ứng được mô tả như sau: Đây là phản ứng thuận nghịch, cân bằng và tốc độ phản ứng phụ thuộc vào pH của môi trường. Bước cộng hợp trong môi trường trung tính hoặc base đều xảy ra nhanh và bước dehydrat hoá là bước quyết định tốc độ phản ứng. Bước dehydrat hoá luôn được xúc tác bởi acid nên thêm acid sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Nếu chỉ tính đến hợp chất carbonyl, phản ứng cộng hợp thuận lợi khi [H+] cao, nhưng tác nhân B - NH2 trong môi trường [H+] lớn sẽ bị proton hoá tạo B - N+H3 làm mất đôi điện tử của nó. Vì vậy điều kiện môi trường phản ứng tuỳ thuộc vào tính base của tác nhân B - NH2 và hoá tính của hợp chất carbonyl. 1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng a. Yếu tố điện tử Xét phản ứng cộng hợp ái nhân: Có 2 yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng + Mật độ điện tử trên B càng lớn ( càng có tính base mạnh ) thì tốc độ phản ứng càng lớn và ngược lại. + Điện tích dương ở carbon của nhóm carbonyl càng lớn thì tốc độ phản ứng càng lớn và ngược lại. * Các yếu tố ảnh hưởng đến mật độ điện tử trên phân tử amin + Gốc B Nếu gốc B có khả năng đẩy điện tử ( Hiệu ứng +I, +M ) sẽ làm tăng khả năng tham gia phản ứng. Do vậy khả năng tham gia phản ứng cộng ái nhân của phân tử amin tăng dần khi mật độ điện tử trên B càng lớn. Nếu gốc B có khả năng hút điện tử sẽ làm giảm mật độ điện tử trên N nên khả năng phản ứng của hợp chất giảm. + Sự có mặt và vị trí của các nhóm thế trên nhân thơm cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng. Nhóm thế loại I ( ankyl, -OH, -OCH3 ...) gây hiệu ứng +I, +M làm tăng mật độ điện tử trên N nên tham gia phản ứng cộng ái nhân AN dễ hơn anilin. Nhóm thế loại II ( -CHO, -NO2, -COOH ) cản trở phản ứng xảy ra. Ví dụ: Các amin thơm sau được sắp xếp theo khả năng phản ứng tăng dần. * Xét yếu tố ảnh hưởng lên điện tích dương của carbon trên nhóm carbonyl Nếu gốc R có khả năng hút điện tử ( -I, -M ) sẽ làm điện tích dương trên C của nhóm carbonyl tăng nên, làm tăng khả năng phản ứng cộng hợp ái nhân của hợp chất. Nếu gốc R có khả năng đẩy điện tử và khả năng này tăng lên theo số lượng nguyên tử C sẽ làm điện tích dương phần trên C của carbonyl giảm dẫn tới khả năng tham gia phản ứng cộng ái nhân càng giảm. Hiệu ứng liên hợp ( +M ) làm phân tử aldehyd thơm khó tham gia phản ứng cộng ái nhân hơn formaldehyd. Mặt khác sự có mặt và vị trí của các nhóm thế trên nhân thơm cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của hợp chất. Các nhóm thế loại I gây hiệu ứng +I, +M làm tăng mật độ điện tử trong nhân thơm và làm giảm điện tích trên C của nhóm carbonyl, làm khả năng phản ứng kém hơn benzaldehyd. Các nhóm thế loại II gây hiệu ứng -I, -M làm giảm mật độ điện tử trên nhân thơm và làm tăng tính phân cực của liên kết carbonyl, phản ứng cộng ái nhân dễ dàng xảy ra hơn b. Yếu tố không gian Hiệu ứng không gian gây ra bởi các nhóm thế cũng ảnh hưởng nhiều đến khả năng phản ứng. Trong phản ứng cộng ái nhân của nhóm carbonyl, gốc R càng cồng kềnh thì càng gây hiện tượng án ngữ không gian, giảm khả năng phản ứng. Mặt khác yếu tố không gian của phân tử amin cũng ảnh hưởng nhiều vì bước cộng hợp từ hợp chất carbonyl có cấu trúc tam giác phẳng ( I ) khi cộng hợp sẽ hình thành sản phẩm cộng hợp tứ diện ( II ) và các nhóm thế phải thu lại gần nhau hơn, vì vậy sự cộng hợp lại càng khó khăn HB: Tác nhân ái nhân ( amin bậc 1 ) c. Yếu tố xúc tác Phản ứng tổng hợp có thể dùng xúc tác acid, base hoặc không cần xúc tác. Điều này phụ thuộc vào tính ái nhân của tác nhân ái nhân. Nếu tính ái nhân yếu ( tính base yếu ) thì cần xúc tác acid mạnh ( HCl, H2SO4 ). Ngược lại với các hợp chất của N có tính base mạnh hơn thì phản ứng cộng hợp có thể xảy ra trong môi trường acid yếu, trung tính, thậm chí base yếu Cơ chế: Xúc tác base: B - NH2 + -OH àB - -NH + H2O Xúc tác acid: Vậy phản ứng xảy ra thuận lợi nhất tại một pH nhất định chứ không phải trong môi truờng acid hay base mạnh. Tại vị trí pH tối ưu này aldehyd được hoạt hóa mạnh đồng thời vẫn còn phần lớn thành phần ái nhân ở dạng tự do không bị proton hoá. Nói chung thường trong vùng trị số pK của tác nhân ái nhân. Có thể biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào pH theo sơ đồ sau v pH pH a b C% a : Nồng độ aldehyd được proton hoá theo pH b: Nồng độ amin dạng tự do theo pH d. Các yếu tố ảnh hưởng khác * Tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Đây là phản ứng đồng mol giữa aldehyd và amin, do đó khi dư: + Aldehyd: Aldehyd sẽ bị oxh tạo acid tương ứng. Đặc biệt aldehyd thơm rất dễ bị oxy hóa: Ar - CHO Ar - COOH + Amin: Sẽ cho sản phẩm phụ Các sản phẩm phụ này làm giảm hiệu suất tổng hợp và làm quá trình tinh chế khó khăn. * Thời gian phản ứng: Nên chọn sao cho phản ứng xảy ra gần như hoàn toàn mà không làm phân huỷ sản phẩm. * Nhiệt độ phản ứng: Nhiệt độ tăng làm tốc độ phản ứng tăng, tuy nhiên chỉ nên duy trì ở nhiệt độ phù hợp vì nhiệt độ cao gây phân huỷ sản phẩm. * Dung môi là rất quan trọng đối với phản ứng. Nếu các chất phản ứng là chất rắn phải hoà tan trong dung môi ( Hoặc hỗn hợp dung môi ) phù hợp để chúng có thể trộn đều. Ngoài ra dung môi còn ảnh hưởng đến tính phân cực của liên kết cũng như tính ái nhân ( Mật độ điện tử ) trên N làm phản ứng thuận lợi hoặc khó khăn.Phản ứng cộng hợp aldehyd với amin bậc I nếu chọn dung môi alcol sẽ làm sự phân cực của liên kết tăng giúp phản ứng được thuận lợi hơn. Phần 2. Thực nghiệm và kết quả 2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 2.1.1. Nguyên liệu a. Hoá chất Tetracyclin hydroclorid, natri carbonat. Hydroxylamin hydroclorid, semicarbazid, thiosemicarbazid, paranitroanilin; 2,4-dinitrophenylhydrazin. Ethanol tuyệt đối, methanol, cloroform, dimethylformamid. Acid acetic khan, acid sulfuric đậm đặc. b.Dụng cụ, máy móc Bình cầu 3 cổ dung tích 250ml, bình cầu cổ mài 100ml, sinh hàn hồi lưu, nồi đun cách thuỷ, máy khuấy từ có bộ phận nhiệt, cốc có mỏ dung tích 100ml, 200ml, bản mỏng sắc ký Silicagel Kieselgel 60F254 ( MERCK ) 2.1.2. Phương pháp thực nghiệm a. Nguyên tắc và sơ đồ phản ứng Chuyển tetracyclin hydroclorid thành tetracyclin base dưới tác dụng của natricarbonat. Sau đó thực hiện các phản ứng ngưng tụ loại nước giữa ceton ( ở đây là tetracyclin base ) với một amin trong môi trường khan nước. Sơ đồ phản ứng b. Điều kiện phản ứng Môi trường khan nước, sử dụng ethanol tuyệt đối. Nhiệt độ phản ứng duy trì ở nhiệt độ sôi của dung môi bằng đun hồi lưu cách thuỷ có theo dõi bằng nhiệt kế, chất xúc tác là acid acetic khan hoặc acid sulfuric đậm đặc. Theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM, hệ dung môi là cloroform :methanol với tỷ lệ thích hợp. c. Tinh chế sản phẩm Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp kết tinh lại, dung môi là ethanol tuyệt đối. 2.2. Tạo Tetracyclin Base 2.2.1. Nguyên tắc Kiềm hoá tetracyclin hydroclorid bằng natricarbonat, lọc tetracyclin base, sấy sản phẩm thu được trong tủ sấy chân không 2Tetracyclin.HCl + Na2CO3 = 2Tetracyclin Base+ CO2 + 2NaCl ( M = 480,9) (M = 444,9) 2.2.2. Thực nghiệm Cân khoảng 4,81g ( 0,01 mol ) tetracyclin hydroclorid hoà tan trong nước cất. Lọc qua phễu Buchner để loại cặn. Dịch lọc thu được đem thực hiện bước tiếp theo. Cân chính xác khoảng 0,53g Na2CO3 ( 0,005 mol ) cho từ từ vào dịch lọc thu được ở trên và khuấy cho đến khi hết sủi bọt. Tetracyclin base lắng xuống, để yên khoảng 20 phút. Lọc qua phễu Buchner, tủa thu được mang sấy khô trong tủ sấy chân không. Sản phẩm mang làm các phản ứng ngưng tụ. *Kết quả: Tetracyclin base có màu vàng sáng. Khối lượng tủa sau sấy : 4,00g. Hiệu suất phản ứng: 90% SKLM bản mỏng Silicagel, hệ dung môi triển khai cloroform :methanol ( 6:4 ), dung môi hoà tan là ethanol, soi đèn tử ngoại được vết rõ Rf = 0,64 2.3. Tổng hợp Oxim, Azometin và Hydrazon của Tetracyclin 2.3.1. Tổng hợp oxim của tetracyclin ( Chất I ) * Tiến hành: Trong bình cầu 3 cổ 100ml có lắp sinh hoàn hồi lưu hoà tan hoàn toàn 2,2g tetracyclin base ( 0,005 mol ) trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng. Trong cốc có mỏ 100ml cân chính xác khoảng 0,7g hydroxylamin hydroclorid ( 0,01 mol ) hoà tan trong 5ml nước cất, thêm từ từ khoảng 1,06g atricarbonat cho đến hết sủi bọt, cho từ từ vào bình phản ứng dung dịch trên. Lắc đều hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu cách thuỷ có khuấy trong 60 phút, theo dõi phản ứng bằng SKLM. Làm lạnh hỗn hợp bằng nước đá, dùng đũa thuỷ tinh cọ thành bình để kết tinh oxim, lọc lấy tủa bằng phễu Buchner. Tinh chế lại trong ethanol tuyệt đối. Sản phẩm mang sấy khô ở nhịêt độ 400C trong tủ sấy chân không. *Kết quả Sản phẩm dạng bột màu vàng trắng, có khối lượng 1,55g. Hiệu suất: 65,11% Nhiệt độ nóng chảy 192 - 1940C 2.3.2. Tổng hợp thiosemicarbazon của tetracyclin ( II ) * Tiến hành: Trong bình cầu 3 cổ 100ml có lắp sinh hoàn hồi lưu hoà tan hoàn toàn 2,2g tetracyclin base ( 0,005 mol ) trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng. Thêm từ từ vào bình phản ứng hỗn hợp gồm 0,92g thiosemicarbazid (0,01 mol ), 3g natriacetat đã hoà tan trong 5ml nước cất nóng. Lắc đều hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu cách thuỷ có khuấy trong 60 phút, theo dõi phản ứng bằng SKLM. Làm lạnh hỗn hợp bằng nước đá, xuất hiện kết tủa đặc, lọc lấy tủa bằng phễu Buchner. Tinh chế lại trong ethanol tuyệt đối. Sản phẩm mang sấy khô ở nhịêt độ 400C trong tủ sấy chân không. *Kết quả Sản phẩm dạng bột màu vàng xanh, có khối lượng 1,25g. Hiệu suất: 40% Nhiệt độ nóng chảy 182 - 1840C 2.3.3.Tổng hợp semicarbazon tetracyclin (III) * Tiến hành: Trong bình cầu 3 cổ 100ml có lắp sinh hoàn hồi lưu hoà tan hoàn toàn 2,2g tetracyclin base ( 0,005 mol ) trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng. Thêm từ từ vào bình phản ứng hỗn hợp gồm 1,12g semicarbazid ( 0,01 mol ), 3g natriacetat đã hoà tan trong 5ml nước cất nóng. Lắc đều hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu cách thuỷ có khuấy trong 60 phút, theo dõi phản ứng bằng SKLM. Làm lạnh hỗn hợp bằng nước đá. Kết tinh semicarbazon bằng cách cọ đũa thuỷ tinh vào thành bình, lọc lấy tủa bằng phễu Buchner. Tinh chế lại trong ethanol tuyệt đối. Sản phẩm mang sấy khô ở nhịêt độ 400C trong tủ sấy chân không. *Kết quả Sản phẩm dạng bột màu đỏ nâu, có khối lượng 1,4g. Hiệu suất: 45% Nhiệt độ nóng chảy 190 - 1940C 2.3.4. Tổng hợp 2,4 - dinitrophenylhydrazon tetracyclin ( IV) * Tiến hành: Trong bình cầu 3 cổ 100ml có lắp sinh hoàn hồi lưu hoà tan hoàn toàn 2g 2,4 - dinitrophenylhydrazin ( 0,01mol ) trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng, thêm từ từ vào bình phản ứng 5ml acid sulfuric đặc. Sau đó thêm từ từ vào bình phản ứng dung dịch của 2,2 g tetracyclin base( 0,005 mol ) đã hoà tan trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng. Lắc đều hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu cách thuỷ có khuấy trong 60 phút, theo dõi phản ứng bằng SKLM. Làm lạnh hỗn hợp bằng nước đá. Kết tinh 2,4 - dinitrophenylhydrazon tetracyclin bằng cách cọ đũa thuỷ tinh vào thành bình, rửa tủa bằng nước cất đến hết acid, lọc lấy tủa bằng phễu Buchner. Tinh chế lại trong ethanol tuyệt đối. Sản phẩm mang sấy khô ở nhịêt độ 400C trong tủ sấy chân không. *Kết quả Sản phẩm dạng bột kết tinh màu đỏ nâu, có khối lượng 2g. Hiệu suất: 46,2% Nhiệt độ nóng chảy 203 - 2050C 2.3.5. Tổng hợp azometin giữa tetracyclin và p-nitroanilin ( V ) * Tiến hành: Trong bình cầu có nút mài 100ml hoà tan 1,7g p-nitroanilin trong khoảng 15ml ethanol tuyệt đối nóng và 2ml acid acetic khan. Thêm từ từ vào bình cầu dung dịch của 2,2g ( 0,005 mol ) tetracyclin base đã hoà tan trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng. Đun cách thuỷ hồi lưu có khuấy, duy trì ở nhiệt độ sôi của dung môi khoảng 1 giờ , theo dõi phản ứng bằng SKLM. Làm lạnh, lọc kết tủa bằng phễu Buchner. Kết tinh lại trong ethanol tuyệt đối. Sấy khô sản phẩm trong tủ sấy chân không. *Kết quả: Sản phẩm có màu nâu đỏ,khối lượng sản phẩm sau sấy: 2,78 g Hiệu suất 63,2% Nhiệt độ nóng chảy 154 - 1560C 2.4. Kiểm tra cấu trúc các chất tổng hợp được 2.4.1. Tính chất vật lí a. Trạng thái , màu sắc Các chất tổng hợp được đều ở dạng bột mịn, có màu sắc vàng trắng, vàng xanh, vàng hoặc nâu đỏ. b. Độ tan Được mô tả chi tiết ở trong bảng 2. Bảng 2: Độ tan của các chất tổng hợp được Sản phẩm Dung môi I II III IV V H2O - + + - - Ethanol ++ ++ ++ ++ ++ DMF +++ +++ +++ +++ +++ Cloroform ++ + + ++ + Diethylether ++ ++ + + ++ Methnol ++ ++ ++ ++ ++ 2.4.2. Sắc kí lớp mỏng Dùng bản mỏng với chất hấp thụ là silicagel - Kieselgel 60F254 - MERCK với hệ dung môi là cloroform : methanol với tỷ lệ thích hợp. Phát hiện vết bằng soi đèn tử ngoại bước sóng l = 365nm hoặc hơi iod bão hoà. Kết quả thu được trong bảng 3. Bảng 3: Kết quả sắc kí lớp mỏng Chất Tỷ lệ dung môi Rf sản phẩm Rf Tetracyclin I Cloroform : Methanol ( 6:4 ) 0.55 0.64 II Cloroform : Methanol ( 7:3 ) 0.48 0.55 III Cloroform : Methanol ( 7:3 ) 0.5 0.55 IV Cloroform : Methanol ( 7:3 ) 0.7 0.55 V Cloroform : Methanol ( 7:3 ) 0.82 0.55 2.4.3. Phổ hồng ngoại IR Thực hiện phân tích quang phổ hồng ngoại các chất tổng hợp được trên máy BECKMAN Acculab TM2 với kĩ thuật viên nén KBr đo trong vùng 4000 - 6000 cm-1 tại phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội với sự giúp đỡ của TS. Đỗ Ngọc Thanh. Hình ảnh các phổ IR được in trong phần phụ lục. Qua đó chúng tôi nhận thấy mỗi chất tổng hợp được đều có các dải hấp thụ đặc trưng tại vùng tương ứng với những nhóm chức của cấu trúc dự kiến tổ hợp được. Kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại được ghi chi tiết trong bảng 4. Bảng 4: Kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại. Chất tổng hợp Nhóm chức (B) - OH Tetracyclin -O-H (alcol, enol, oxim 3401 3394 3360 3199 3360 3339 C=N 1656 1632 1632 1648 1632 1605 aromatic) 1603 1578 1594 1463 1592 1474 1505 C - O - enol -alcol 1042 1169 1181 1109 1232 1093 1181 1109 1139 1052 -CH3 das ds 1456 1397 1414 1474 1420 1456 1392 C=S 1258 NO2 nas ns 1474 1300 1399 1329 N - O ( oxim ) 948 2.4.4. Phổ tử ngoại ( UV ) Các chất tổng hợp được cũng đã tiến hành phân tích phổ tử ngoại trên máy SP8 - 300 UV/VIS trong vùng 200 - 400 nm tại phòng thí nghiệm trung tâm trường ĐH Dược Hà Nội. Kết quả được ghi chi tiết trong bảng 5. Bảng 5. Kết quả phân tích phổ tử ngoại. STT I - B: - OH 270 II - B : 243; 265; 372 III - B : 206; 230; 368 IV - B 211; 242; 273; 440 V - B : 229; 371 VI =N- B : = O 365; 272;223 2.5. Sơ bộ thăm dò tác dụng sinh học của các chất tổng hợp Đựoc sự giúp đỡ của tổ môn Vi nấm - Kháng sinh trường ĐH Dược Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thử một số tác dụng sinh học, cụ thể là khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, qua đó mong muốn tìm được mối liên quan giữa cấu trúc hoá học và tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được. 2.5.1. Nguyên tắc Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với các khoanh giấy tẩm chất thử. Khả năng ức chế được đánh giá bằng đường kính vòng vô khuẩn 2.5.2. Thực nghiệm a. Chủng vi sinh vật sử dụng * Gồm 4 chủng vi khuẩn Gram(+) - Bacillus pumilus: NCTC 8241 - Bacillus cereus: ATCC 9946 - Staphylococcus aureus: ATCC 12228 - Sarcina lutea: ATCC 9341 * 5 chủng vi khuẩn Gram(-) - Proteus mirabilis: BV 108 - Pseudomonas aeruginosa: VM 201 - Escherichia coli: ATCC 25922 - Salmonella typhi: DT 220 - Shigella flexneri: DT 112 * Một chủng nấm. - Candida albicans: ATCC 10231 b. Môi trường. * Gồm 3 môi trường - Môi trường cao thịt, cao men - Môi trường thạch thường - Môi trường Sabouraud c. Nuôi cấy vi sinh vật kiểm định. Các vi sinh vật kiểm định gồm có 4 chủng vi khuẩn Gram(+), 5 chủng vi khuẩn Gram(-) và một chủng vi nấm, trước khi tiến hành thí nghiệm được nuôi cấy và nhân giống lên các môi trường dinh dưỡng thích hợp ( Thạch thường cho vi khuẩn, Sabouraud cho vi nấm ) ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ. Sau đó làm thành nhũ dịch VSV với nồng độ 107 - 108 tế bào/1ml trong NaCl 0,9% để tạo ra vùng ức chế có ranh giới rõ ràng. d. Chuẩn bị chất thử Các mẫu thử ( Gồm 5 chất I, II, III, IV, V ) được pha thành nồng độ 0,5mg/1ml trong dung môi DMF, song song thử với các mẫu trắng ( Chỉ có dung môi ). Thấm dịch thử vào các khoanh giấy lọc đường kính N05, đường kính 7mm ( Đã tiệt trùng giấy ) với một lượng bằng nhau, để bay hơi dung môi, mỗi khoanh giấy chứa khoảng 5mcg chất thử. e. Tiến hành Sau khi chuẩn bị mẫu thử, VSV, môi trường, chúng tôi tíến hành thử tác dụng kháng khuẩn kháng nấm theo DĐVN III. Kết quả được chúng tôi ghi ở bảng 6. Bảng 6. Kết quả kháng nấm, kháng khuẩn của các chất tổng hợp được Chất thử VSV Kiểm định Đường kính vòng vô khuẩn Nồng độ 0,5mg/ml I II III IV V VI E. coli 18.4 12.3 16.2 10.3 10.3 18.3 S. aureus 24.5 21.3 22.2 17.8 22.4 22.7 S. lutea 13.0 14.2 13.8 12.7 15 16.7 B. cereus - - - - - - B. pumilus 17.9 18.4 18 18.2 18 20 P. aeruginosa - - - - - - S. typhi - - - - - - S. flexneri 24.5 21.2 22.4 18 13 21 P. mirabilis 20 20 21 21.5 22 22 C. albicans 16 15.5 15 - - - Ghi chú: ( VI ) tetracyclin base 2.6. Nhận xét và đánh giá 2.6.1. Tổng hợp hoá học Nguyên liệu ban đầu trong giai đoạn tổng hợp là tetracyclin hydroclorid rất ít tan trong ethanol là một dung môi rất thuận lợi cho các phản ứng ngưng tụ loại nước, do đó chúng tôi đã chuyển thành tetracyclin base, thuận lợi hơn cho quá trình tổng hợp. Từ tetracyclin base thực hiện phản ứng ngưng tụ loại nước chúng tôi đã tổng hợp được một hợp chất oxim, một azometin và 3 hợp chất hydrazon chưa thấy trong các tài liệu tham khảo được. Qua tiến hành kiểm tra cấu trúc các chất qua phổ UV, IR, chúng tôi nhận thấy các chất có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến. Dung môi tiến hành phản ứng là ethanol tuyệt đối, đây là một dung m