Luận án Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột của tôm nước lợ

y sự sai khác giữa các nhóm vi khuẩn A1, A3, B1, B2 khi so sánh với các chủng vi khuẩn chuẩn lần lượt bao gồm V. parahaemolyticus 428, V. vulnificus 509, V. cholerae non-01 và V. alginolyticus 552 (Buller, 2004), riêng đối với các chủng vi khuẩn thuộc nhóm A2 ghi nhận thấy có sự sai khác ở chỉ tiêu arginine và gelatine, các chỉ tiêu còn lại gần giống với chủng V. haveyii 581. Đối với các chỉ tiêu thuộc nhóm phản ứng lên men các loại đường cho thấy, nhóm glucose, mannose, inositol, sorbitol, rhamnose đều cho kết quả giống nhau giữa các chủng kiểm tra và các chủng chuẩn. Chỉ tiêu sinh hoá lên men các loại đường còn lại có sự khác biệt tuỳ loài. A B C D E 78 Nhìn chung, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý hoá cơ bản cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được đều có độ tương ứng cao khi so sánh với các chủng mẫu được nêu trong nghiên cứu về vi khuẩn lây nhiễm trên động vật thuỷ sản của Buller (2004). Sự sai khác ở một số chỉ tiêu có thể được giải thích do sự khác biệt về địa lý hoặc vật chủ lây nhiễm của chủng vi khuẩn đó. Vì vậy, để xác định được chính xác đến loài của các chủng vi khuẩn Vibrio spp. phân lập và tăng độ tin cậy. Nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự gene 16s rRNA để kiểm tra khẳng định loài của các chủng vi khuẩn. 4.5.2. Định danh thông qua kỹ thuật sinh học phân tử PCR 4.5.2.1. Kết quả ly trích đoạn gen 16S rRNA Sau khi kiểm tra các chỉ tiêu sinh hoá cơ bản và định danh sơ bộ bằng kit API 20E, 24 chủng vi khuẩn được tiến hành ly trích DNA nhằm định danh đến loài bằng phương pháp giải trình tự gen 16s rRNA. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch, ủ ở 28℃, sau 24 giờ, chọn khuẩn lạc thuần và tiến hành tách chiết DNA, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F-1492R, khuếch đại vùng 16S rRNA của vi khuẩn. Sản phẩm PCR có kích thước 1500 bp. Trong nghiên cứu này, 24 chủng vi khuẩn (STT 1-24) đều được nhận diện bởi đoạn gen 16S rRNA và cho kết quả tốt, các băng xuất hiện trên phổ điện di rõ, đồng nhất và không có sản phẩm phụ, kích thước sản phẩm khuếch đại là 1500 bp (Hình 4.21). Từ kết quả PCR, tất cả các dòng vi khuẩn được giải trình tự gen 16S rRNA. Hình 4.21. Sản phẩm khuếch đại vùng gene 16S rRNA của các chủng vi khuẩn trên gel agarose 1,5%. M: thang 100 bp; (+): mẫu đối chứng dương; (-) mẫu đối chứng âm; giếng 1-24 mẫu vi khuẩn nghiên cứu Theo Vaerewijck et al., (2001) vi khuẩn được định danh thông qua các phản ứng sinh hóa tương đối chính xác. Tuy nhiên, các qui trình kỹ thuật này khá phức tạp và tốn 79 kém, hơn nữa, một số loài vi khuẩn thường không được ghi nhận đầy đủ các đặc điểm sinh hóa khiến cho việc nhận diện chính xác trở nên khó khăn hơn (Khamis et al., 2003). Cho đến nay, với sự phát triển của kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 16S rRNA đã giúp việc định danh ngày càng đơn giản hóa và một cách đặc hiệu (Wang et al., 2003; Wu et al., 2006). 4.5.2.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của các dòng vi khuẩn Các mẫu được tiến hành giải trình tự gene và sử dụng phần mềm Blast Nucleotic để so sánh với trình tự DNA của các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả giải trình tự được thể hiện trong Bảng 4.4. Kết quả so sánh trình tự của các chủng vi khuẩn (1-24) với trình tự đoạn gene 16S rRNA có độ tương đồng 94-99% trên cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI cho thấy, có 08 chủng vi khuẩn (17-24) tương đồng với trình tự vi khuẩn V. alginolyticus; có 07 chủng vi khuẩn (10-16) tương đồng với trình tự vi khuẩn V. cholerae; có 02 chủng vi khuẩn (4-5) tương đồng với trình tự vi khuẩn V. harveyi; có 03 chủng vi khuẩn (1-3) tương đồng với trình tự vi khuẩn V. parahaemolyticus; có 04 chủng vi khuẩn (6-9) tương đồng với trình tự vi khuẩn V. vulnificus. Thông qua kết quả giải trình tự gen 16s rRNA của các chủng vi khuẩn Vibrio spp. phân lập trên tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu bệnh đường tiêu hoá cho thấy sự tương đồng cao của các chủng Vibrio đối với các chủng chuẩn trên ngân hàng gen. Ngoài ra, kết quả còn thể hiện sự giống nhau khi so sánh với định danh bằng phương pháp truyền thống bằng các chỉ tiêu sinh lý hoá, tuy nhiên độ tin cậy của phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử sẽ cao hơn do sự đặc trưng trong bộ gen của mỗi loài. Bảng 4.4. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn Vibrio spp. STT Mã vi khuẩn Loài vi khuẩn Độ tương đồng (%) Ký hiệu Genbank 1 CM1HPB1 V. parahaemolyticus 98 NR_118928.1 2 CM3HPA1 V. parahaemolyticus 94 NR_119058.1 3 BTIA1 V. parahaemolyticus 99 NR_119058.1 4 CM2IA2 V. harveyi 98 NR_119054.1 5 CM3HPA2 V. harveyi 98 NR_119054.1 6 CM1IA4 V. vulnificus 98 NR_118570.1 7 CM2HPA4 V. vulnificus 99 NR_117906.1 8 CM3IA4 V. vulnificus 99 NR_117906.1 9 BTIA4 V. vulnificus 99 NR_119061.1 10 CM2IB1 V. cholerae 99 NR_119051.1 11 CM3HPB1 V. cholerae 99 NR_119051.1 12 STIB1 V. cholerae 98 NR_115936.1 13 STHPB1 V. cholerae 98 NR_119302.1 14 STIB1.1 V. cholerae 99 NR_119051.1 15 BTIB1 V. cholerae 98 NR_119302.1 16 BTIB1.1 V. cholerae 99 NR_119302.1 17 CM3HPB2 V. alginolyticus 99 NR_113781.1 80 18 CM3IB2 V. alginolyticus 98 NR_122059.1 19 CM3IB2.1 V. alginolyticus 98 NR_121709.1 20 CM3HPB2.1 V. alginolyticus 99 NR_113781.1 21 CM3IC1 V. alginolyticus 98 NR_122050.1 22 CM2IB2 V. alginolyticus 99 NR_122060.1 23 CM2HPB2 V. alginolyticus 99 NR_118258.1 24 STIB2 V. alginolyticus 99 NR_118258.1 4.6. Kết quả nhận diện gen độc lực của các chủng vi khuẩn Vibrio spp. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen độc lực cho thấy V. parahaemolyticus BTIA1 có mang 3 gen PirBVP, toxR và toxRS. Kế tiếp, V. cholerae CM3HPB1 có mang gen PirBVP, tlh và không có sự xuất hiện của gen toxR và toxRS. Ngược lại, chủng vi khuẩn V. vulnificus CM2HPA4 có mang của gen toxR, toxRS nhưng không mang gen PirBVP và tlh. Chủng vi khuẩn V. alginolyticus CM3IC1 chỉ ghi nhận mang gen toxRS (Bảng 4.5) Bảng 4.5. Sự hiện diện của các gen độc lực trong các chủng Vibrio spp. gây bệnh TT Chủng vi khuẩn PirBVP tlh toxR toxRS 1 V. alginolyticus CM3IC1 - - - + 2 V. cholerae CM3HPB1 + + - - 3 V. vulnificus CM2HPA4 - - + + 4 V. parahaemolyticus BTIA1 + - + + Ghi chú: (+): biểu hiện độc lực; (-): không biểu hiện độc lực. Theo nghiên cứu của Quảng và ctv. (2020) thì 100% các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ mẫu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tại tỉnh Thừa Thiên Huế có chứa gen PirBVP và 50% đã được ghi nhận có mang gen toxR. Trong khi đó, gen tlh và toxR được ghi nhận hiện diện 100% ở các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ tôm bệnh AHPND. Kết quả giải trình tự gen của 4 chủng vi khuẩn cũng cho thấy độc lực khác nhau ở các gen. Gen toxR: Kết quả khuếch đại trình tự của các chủng vi khuẩn Vibrio spp cho thấy có hai trong bốn gen đều xuất hiện vạch DNA ở kích thước 367 bp (Hình 4.22). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu cuả Quảng và ctv., (2020) khi xác định các gen độc tố của các chủng Vibrio gây bệnh được 7/14 mẫu nghiên cứu, phân lập chứa vùng gen toxR. Gen toxRS: Có 3 trong 4 chủng vi khuẩn Vibrio spp phân tích dương tính với đoạn trình tự gen ToxRS. Kết quả khuếch đại trình tự DNA cho thấy kích thước băng đạt khoảng 1347 bp của đoạn gen toxRS (Hình 4.23). Kết qủa này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu xác định các gen độc tố của các chủng Vibrio gây bệnh của Supansa Bunpa et al., (2017). Gen tlh: Chỉ có chủng V. cholerae CM3HPB1 dương tính với đoạn trình tự gen tlh xuất hiện vạch DNA ở kích thước trên 450 bp (Hình 4.22). Kết qủa có sự khác biệt so với nghiên cứu của Mustapha et al., (2013), cụ thể các mẫu có phản ứng tại vị trí là số 81 (3) ba mẫu còn lại tại vị trí 1, 2, 4 không có băng màu xuất hiện điều này có thể giải thích do thực khuẩn thể kích hoạt gen gây độc tố của dòng vi khuẩn Vibrio spp. Hình 4.22. Sản phẩm PCR các gen độc tố của Vibrio spp. M (Ladder 100bp) 1: V. vulnificus CM2HPA4, 2: V. alginolyticus CM3IC1, 3: V. cholerae CM3HPB1, 4: V. parahaemolyticus BTIA1 Gen PirBVP: Tương tự với các gen mục tiêu toxR, toxRS, tlh. Gen độc lực primer B có kết quả khuếch đại trình tự chuỗi mục tiêu 392 bp của đoạn gen tdh ở dòng vi khuẩn Vibrio spp cho thấy trong bốn chủng phân tích có hai chủng có sự xuất hiện vạch DNA ở kích thước trên 392 bp (Hình 4.23). Kết qủa phù hợp với nghiên cứu của Quảng và ctv. (2020), tác giả cho rằng primerB và các gen toxR, toxRS, tdh đều có khả năng nhận diện độc lực của các vi khuẩn Vibrio. Hình 4.23. Sản phẩm PCR các gen độc tố của Vibrio spp. M (Ladder 1kb) 1: V. vulnificus CM2HPA4, 2: V. alginolyticus CM3IC1, 3: V. cholerae CM3HPB1, 4: V. parahaemolyticus BTIA1 Kết quả cho thấy V. parahaemolyticus có chứa hầu hết các gen gây độc ngoại trừ gen tlh, tương đồng với nghiên cứu của Fri et al., (2017), chỉ ra rằng hầu hết loài V. parahemolyticus (97,0%; 32/33) âm tính với gen tlh. Theo nghiên cứu của Asgarpoorv et al., (2018), trong số 70 mẫu tôm trong nghiên cứu chỉ có 2 (2,8%) dòng Vibrio mang gen tlh. Theo nghiên cứu của Lopatek et al., (2018), gen tlh chỉ được xác định ở 3 trong số 104 (2,9%) V. parahaemolyticus phân lập được phân tích. Từ sản phẩm Primer toxR Primer tlh 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 367bp 450bp 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 Primer pirBvp Primer toxRS 1347bp 392bp b 82 PCR cho thấy V. parahaemolyticus biểu hiện gen toxR với kích thước băng điện di khoảng 367 bp tương đồng với Cầm và ctv., (2020), nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của 30 dòng V. parahaemolyticus cho thấy tất cả các mẫu định danh đều có sự hiện diện của gen toxR. Trong nghiên cứu của Asgarpoorv et al., (2018) thì gen toxR xuất hiện ở 12/70 mẫu tôm được phân tích. Vibrio parahaemolyticus mang gen độc tố PirBVP là một trong những tác nhân gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp tính (AHPND) (Aranguren, 2020). Sản phẩm PCR cặp mồi PirBVP xuất hiện băng điện di khoảng 392bp phù hợp với công bố của Quảng (2020). Ở chủng vi khuẩn V. alginolyticus chỉ biểu hiện độc lực toxRS, một loại gen có khả năng sản xuất hemolysin, điều này khác biệt so với nghiên cứu của Xie et al., (2005) là trong 64 mẫu vi khuẩn V. alginolyticus đều không biểu hiện gen độc tố toxRS. Kết quả PCR cho thấy chủng vi khuẩn V. cholerae biểu hiện 2 độc lực tlh và PirBVP. Các gen gây bệnh tương đồng với V. parahaemolyticus và các yếu tố quyết định độc lực của V. cholerae được phân bố rộng rãi trong một số loài Vibrio (V. parahaemolyticus, V. cholerae non-O1, V. mimicus, V. hollisae, V. fluvialis và V. alginolyticus) (Nishibuchi et al., 1996; Sechi et al., 2000). Điều này lý giải cho việc có một số gen gây bệnh đặc trưng của một số chủng vi khuẩn lại hiện diện ở chủng khác trong cùng một loài. V. vulnificus là chủng vi khuẩn cơ hội gây nhiễm trùng huyết, chủng vi khuẩn này là nguyên phát khi bệnh nhân mẫn cảm ăn phải động vật giáp xác đã nhiễm V. vulnificus. Sự lây nhiễm thành công bởi vi khuẩn gây bệnh, nói chung, được thiết lập bằng cách phối hợp biểu hiện của các yếu tố độc lực khác nhau trong cơ thể sống (Lee et al., 2000). Vì vậy việc xác định các gen gây độc có mặt ở chủng vi khuẩn V. vulnificus là cần thiết. Kết quả PCR cho thấy dòng vi khuẩn V. vulnificus biểu hiện hai độc lực toxR và toxRS tương đồng với nghiên cứu của Lee et al., (2000). Nhóm nghiên cứu trên đã chứng minh rằng toxR được biểu hiện ở V. vulnificus ở kích thước mong đợi và cho thấy rằng toxRS có thể điều chỉnh sản xuất hemolysin V. vulnificus. 4.7. Xác định độc tính của các chủng Vibrio spp. Dựa vào kết quả định danh vi khuẩn và tỷ lệ xuất hiện của các nhóm vi khuẩn Vibrio spp. trên tôm bệnh đường ruột, đề tài tiến hành chọn đại diện 1 chủng vi khuẩn (V. cholerae CM3HPTB1, V. alginolyticus CM3IC1, V. vulnificus CM2HPA4 và V. parahaemolyticus BTIA1) cho mỗi loài vi khuẩn được phân lập từ tôm có dấu hiệu phân trắng để tiến hành gây cảm nhiễm và xác định khả năng gây bệnh. Các chủng vi khuẩn được phục hồi và tiêm cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng có trọng lượng từ 10-12 g với nồng độ vi khuẩn từ 103-106 CFU/mL, thí nghiệm theo dõi trong 14 ngày. Tỷ lệ sống của tôm ở nghiệm thức đối chứng là 100% trong suốt quá trình thí nghiệm cảm nhiễm, đều này chứng tỏ rằng hệ thống bố trí thí nghiệm ổn định, không có sự nhiễm chéo trong suốt quá trình thí nghiệm. Sau thời gian cảm nhiễm, giá trị độc lực 83 và dấu hiệu bệnh lý được theo dõi và ghi nhận có sự khác biệt phụ thuộc vào từng loài vi khuẩn được gây cảm nhiễm. Bệnh gây ra do vi khuẩn Vibrio spp. hay “Vibriosis” là một trong những bệnh phổ biến và gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm nói chung và nghề nuôi tôm nước lợ nói riêng. Trong đó, V. aginolyticus, V. cholerae, V. vulnificus và V. parahaemolyticus được xác định có liên quan đến các bệnh như hội chứng trên ấu trùng Zoae II, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, bệnh nhiễm trùng-hoại tử gan tụy, bệnh trên vỏ tôm, bênh hoại tử đuôi và bệnh đỏ thân trên tôm nước lợ. Bốn loài vi khuẩn này thường được tìm thấy trong quá trình phân lập vi khuẩn ở đường ruột trên tôm bị hội chứng phân trắng (Cao et al., 2015; Limsuwan., 2010; Truong et al., 2021). 4.7.1. Chỉ tiêu chất lượng nước ở thí nghiệm cảm nhiễm Trong suốt quá trình thí nghiệm cảm nhiễm, các chỉ tiêu môi trường nước như nhiệt độ, pH, NH3/NH4+ NO2 và độ kiềm ở các nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức gây cảm nhiễm với 4 chủng vi khuẩn đều nằm trong ngưỡng thích họp, không có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức. Điều này cho thấy các yếu tố môi trường không gây ảnh hưởng đến quá trình thí nghiệm cảm nhiễm (Bảng 4.6). Bảng 4.6. Các chỉ tiêu môi trường trong thời gian thí nghiệm Chỉ tiêu Nghiệm thức Đối chứng V. alginolyticus CM3IC1 V. cholerae CM3HPTB1 V. vulnificus CM2HPA4 V. parahaemolyticus BTIA1 Nhiệt độ (oC) 27,1- 30 27,3-29,9 27,3-29,7 27,2-29,6 27,2-30 pH 7,1-8,0 7,0-8,2 7,0-8,3 6,9-8,3 6,9-8,2 NH3/NH4+ (mg/L) 0 0-0,5 0-0,5 0-0,5 0-0,5 NO2 (mg/L) 0-2 0-2 0-2 0-2 0-2 Kiềm (mg CaCO3/L) 107,4- 125,3 107,4-143,2 107,4-143,2 107,4-143,2 107,4-143,2 4.7.2. Khả năng gây bệnh của V. cholerae trên tôm Chủng vi khuẩn V. cholerae CM3HPTB1 phân lập từ tôm mắc hội chứng phân trắng, bằng phương pháp tiêm sau khi gây cảm nhiễm 10 ngày, đề tài ghi nhận các biểu hiện bệnh lý giống nhau ở các nghiệm thức thí nghiệm như gan tụy sưng và nhạt màu, phân lỏng, ruột rỗng hay bị đứt đoạn. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn này không gây tôm chết, tỷ lệ chết của tôm ghi nhận là 0% ở tất cả các nghiệm thức cảm nhiễm khi so sánh với kết quả của một số các nghiên cứu cảm nhiễm V. cholerae với phương pháp hoặc giai đoạn tôm khác nhau (Hình 4.24). Theo Cao et al., (2015b). Khi cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng có trọng lượng 7,22g bằng phương pháp cho ăn thức ăn có bổ sung vi khuẩn V. cholerae chủng BB31 84 phân lập từ tôm bệnh phân trắng tại Trung Quốc, ở liều lượng 1×108 CFU/g thức ăn trong 18 ngày gây tỷ lệ chết lên đến 73,33%. Trên chủng V. chorelae phân lập từ tôm thẻ chân trắng bệnh vàng chân tại Trung Quốc ghi nhận được khả năng gây chết cao trên giai đoạn tôm thịt trọng lượng 11,26g và gây chết hơn 90% chỉ trong 7 ngày sau cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm ở nồng độ 5×106 CFU/mL (Cao et al., 2015a). Tôm thẻ chân trắng đoạn giai đoạn PL15-20 cũng thể hiện tính mẫn cảm cao với V. cholerae với giá trị LD50 là 4,6 × 104 CFU/mL khi thực hiện bằng phương pháp ngâm (Joseph et al., 2015). Qua đó cho thấy, chủng V. cholerae CM3HPTB trong nghiên cứu này có giá trị độc lực thấp trên tôm thẻ chân trắng giai đoạn thịt với nồng độ gây chết >106 CFU/mL khi thực hiện bằng phương pháp tiêm. Hình 4.24. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. cholerae phân lập từ tôm bị hội chứng phân trắng. Gan tụy sưng, nhạt màu, phân lỏng, có màu vàng nâu Vi khuẩn V. cholerae được ghi nhận hiện diện với tỷ lệ cao trên gan tụy và được xác định có khả năng gây bệnh trên một số loài tôm nuôi, với độc lực và khả năng gây bệnh của V. cholerae đối với tôm thẻ chân trắng phụ thuộc vào chủng vi khuẩn được phân lập theo từng nhóm dấu hiệu bệnh lý đặc trưng, giai đoạn phát triển của tôm và phương pháp cảm nhiễm được sử dụng (Albuquerque et al., 2013; Suzita et al., 2007; Joseph et al., 2015). Một trong những triệu chứng rối loạn tiêu hoá của bệnh đường ruột trên tôm thẻ chân trắng bị nhiễm Vibrio spp., (Schmidt et al., 1979; Faruque et al., 1998). Theo Gao et al., (2019) & Hannan et al., (2019), nguyên nhân dẫn đến dấu hiệu gan tụy sưng to, nhạt màu là do sự tấn công của vi khuẩn làm phá vỡ lớp nền của ống gan tụy, giảm các không bào, gây mất cấu trúc, hoại tử tế bào biểu mô và hình thành nên các ổ viêm. Các dấu hiệu tương tự cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Joseph et al., (2015) trên tôm thẻ chân trắng và tôm sú giai đoạn PL15-20 cảm nhiễm với chủng vi khuẩn V. cholerae 85 O139 phân lập từ tôm sú bệnh tại Ấn Độ. Các biến đổi trên rối loạn chức năng tiêu hóa và ảnh hưởng đến sức khỏe tôm nuôi dẫn đến tôm thường hoạt động yếu, lờ đờ, giảm hoặc bỏ ăn, thức ăn đường tiêu hóa thường không liên tục hoặc rỗng ruột (Hannan et al., 2019; Gao et al., 2019). Ở các nghiệm thức có mật độ vi khuẩn cảm nhiễm càng cao thì dấu hiệu bệnh lý càng rõ ràng hơn. 4.7.3. Khả năng gây bệnh của V. alginolyticus Chủng vi khuẩn V. alginolyticus CM3IC1 cũng được phân lập từ tôm mắc hội chứng phân trắng, theo dõi nghiệm thức sau khi gây cảm nhiễm tôm có các dấu hiệu như gan tụy sưng và nhạt màu, phân lỏng, ruột rỗng. Tuy nhiên, biểu hiện bệnh ở thời gian sớm hơn, chỉ sau 8 ngày sau cảm nhiễm (Hình 4.25) Hình 4.25. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. alginolyticus phân lập từ tôm bệnh phân trắng. Gan tụy sưng, nhạt màu, phân lỏng, có màu vàng nâu Tương tự như trong thí nghiệm với vi khuẩn V. cholerae, nồng độ gây chết V. alginolyticus CM3IC1 cũng được xác định nằm trong khoảng nồng độ > 106 CFU/mL khi thực hiện bằng phương pháp tiêm. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hsieh et al., (2008) & Chen et al., (2015), khi nồng độ gây chết tôm cảm nhiễm V. alginolyticus trên tôm thẻ chân trắng được ghi nhận trên các liều 105-5,6 × 105 CFU/g mà không ghi nhận được ở nồng độ thấp hơn. V. aginolyticus được xác định có liên quan đến nhiều bệnh khác nhau trên giáp xác, điển hình là hội chứng Zoae, hoại tử gan tụy do nhiễm khuẩn và bệnh có liên quan đến vỏ (Valete & Wan., 2021). Trong điều kiện phòng thí nghiệm, vi khuẩn V. alginolyticus được xác định gây chết và biểu hiện một số các dấu hiệu bệnh lý trên tôm càng xanh với các dấu hiệu đục cơ, hoại tử trên mang, mất phụ bộ, gan tụy sậm màu và mềm nhũn (Ajadi et al., 2019). Ngoài ra, còn gây chết liên tục trên tôm thẻ chân trắng 86 khi cảm nhiễm có biểu hiện đục cơ với các dấu hiệu đỏ phụ bộ (đuôi, vây râu và chân bơi) (Liu et al., 2004). 4.7.4. Khả năng gây bệnh của V. vulnificus Ở nghiệm thức cảm nhiễm với chủng V. vulnificus CM2HPA4, theo dõi tôm và ghi nhận một số các biểu hiện điển hình là đường ruột đứt khúc hoặc rỗng ruột kèm theo gan tụy biểu hiện nhạt màu, gan sưng to, mềm nhũn và có dịch (Hình 4.26). Hình 4.26. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. vulnificus phân lập từ tôm bệnh phân trắng. Gan tụy sưng, nhạt màu, ruột rỗng Chủng vi khuẩn V. vulnificus CM2HPA4 thể hiện khả năng gây chết cao trên tôm thẻ chân trắng khi cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm. Ở tất cả các nghiệm thức cảm nhiễm, tôm bắt đầu chết sau 12 giờ và tăng liên tục trong 5 ngày sau cảm nhiễm ở nghiệm thức tiêm nồng độ vi khuẩn 106 CFU/mL, trong 3 ngày ở nghiệm thức tiêm 105 CFU/mL và trong 2 ngày ở các nghiệm thức khác, sau đó dừng chết cho đến ngày 14. Kết thúc thí nghiệm, tôm chết 100% ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn 106 CFU/mL và giảm dần theo nồng độ vi khuẩn được tiêm với tỷ lệ 70%, 40% và 23,3% tương ứng với mật độ vi khuẩn từ 105-103 CFU/mL. Nồng độ gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn V. vulnificus trong thí nghiệm là 1,5 × 104 CFU/mL (Hình 4.27). Vi khuẩn V. vulnificus là loài vi khuẩn phổ biến thường xuất hiện nhiều ở các vùng cửa sông và vùng biển trên toàn thế giới, được xác định gây hiện tượng đỏ thân trên tôm sú giai đoạn PL20 và gây chết sớm hàng loạt trên tôm càng xanh (M. rosenbergii) giai đoạn zoea và hậu ấu trùng. Giá trị LD50 cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm trên tôm sú là 6,54 × 103 CFU/mL và theo thứ tự là 1,16 × 106 CFU/mL và 1,45 × 106 CFU/mL tương ứng với hai giai đoạn tôm càng xanh (Thakur et al., 2003; Li et al., 2019). Tuy nhiên, trên tôm thẻ chân trắng, các nghiên cứu về độc lực cũng như khả năng gây bệnh của loài vi khuẩn này vẫn còn nhiều hạn chế. 87 Hình 4.27. Tỉ lệ chết (%) trên tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm vi khuẩn V. vulnificus chủng CM2HPA4 sau 14 ngày. Control: đối chứng, V3-6: tiêm vi khuẩn nồng độ 103-106 CFU/mL Theo Alday et al., (2002), sau khi tiêm vi khuẩn V. vulnificus vào trong huyết tương, tấn công vào tế bào máu và các mô liên kết, sau đó di chuyển đến các vùng xung quanh các ống gan tụy, ruột giữa, manh tràng ruột giữa và cơ quan lympho. Tại đây, vi khuẩn sẽ tiếp tục tấn công và gây ảnh hưởng đến các cơ quan dẫn đến biểu hiện các dấu hiệu bệnh lý. Từ kết quả thí nghiệm cho ta thấy khả năng gây bệnh và giá trị độc lực cao của V. vulnificus CM2HPA4 được sử dụng trong nghiên cứu trên tôm thẻ chân trắng khi so sánh với chủng vi khuẩn V. vulnificus phân lập từ tôm bệnh phân trắng tại Ấn Độ trong nghiên cứu của Mastan & Begum (2016), không ghi nhận được dấu hiệu bệnh lý và tỷ lệ chết nào trên tôm khi tiêm ở liều 105 CFU/g. 4.7.5. Khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BTIA1 sau khi cảm nhiễm cũng ghi nhận dấu hiệu bệnh lý như gan tụy bị teo, ruột rỗng (Hình 4.28) Hình 4.28. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ tôm bệnh phân trắng. Gan tụy teo, dai, nhạt màu, ruột rỗng .00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 T Ỉ L Ệ C H Ế T ( % ) NGÀY CẢM NHIỄM Control V3 V4 V5 V6 88 Các dấu hiệu bệnh lý trên tôm sau cảm nhiễm tương tự như mô tả của Nguyễn Trọng Nghĩa và Oanh (2015) khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus BL2 phân lập từ tôm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. Đây là dấu hiệu cho thấy gan tụy tôm bị hoại tử, giảm các tế bào biểu mô, các tế bào bị thoái hóa, bong tróc và hình thành nên các ổ vi khuẩn được bao quanh bởi các tế bào máu. Ngoài ra, V. parahaemolyticus có thể gây ra các tổn thương cục bộ, đỏ thân và đỏ phụ bộ trên tôm thẻ chân trắng (Mastan & Begum., 2016). Giá trị LD50 trên tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm V. parahaemolyticus BTIA1 phân lập từ tôm mắc hội chứng phân trắng trong nghiên cứu được xác định là 2,7 × 105 CFU/mL. Không ghi nhận tôm chết ở nghiêm thức tiêm nồng độ 103 CFU/mL. Tuy nhiên, ở các nghiệm thức tiêm các nồng độ 104-106 CFU/mL, tôm bắt đầu chết sau 18 giờ cảm nhiễm và đồng loạt dừng chết sau 2 ngày cảm nhiễm đến khi kết thúc thí nghiệm. Tỷ lệ chết ghi nhận tương ứng với từng nồng độ cảm nhiễm là 13,3%, 23,3% và 53,3% (Hình 4.29). Hình 4.29. Tỉ lệ chết (%) trên tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus chủng BTIA1 sau 14 ngày. Control: đối chứng, P1-6: tiêm vi khuẩn nồng độ 103-106 CFU/mL Thông qua kết quả LD50 cho thấy chủng V. parahaemolyticus BTIA1 phân lập từ tôm nhiễm hội chứng phân trắng trong nghiên cứu thể hiện khả năng gây bệnh trên tôm và có giá trị độc lực cao hơn so với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus S05 được phân lập từ tôm thẻ chân trắng mắc hội chứng phân trắng tại Trung Quốc khi thực hiện bằng phương pháp bơm vi khuẩn ngược từ đường hậu môn (Wang et al., 2020). Tuy nhiên, các biểu hiện bệnh lý trên tôm cảm nhiễm V. parahaemolyticus BTIA1 trong nghiên cứu có sự tương đồng với thí nghiệm của Wang et al., (2020) trên V. parahaemolyticus S05 với dấu hiệu như ruột rỗng và gan tụy sưng, nhạt màu. Trong các trường hợp này gan tụy tôm cảm nhiễm bị mất cấu trúc hình sao, các tế bào B, R, F giảm số lượng hoặc tiêu biến, lòng ống gan tụy mở rộng và giảm độ dày của các tế bào biểu mô gan tụy. Theo nhận định của Jayasree et al., (2006), vi khuẩn V. parahaemolyticus là một trong những tác nhân gây nên bệnh Vibriosis và bệnh hoại tử cấp tính, gây thiệt hại đáng kể trên tôm nuôi nước lợ thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng trong những năm gần đây. .000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 70.000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 T Ỉ L Ệ C H Ế T ( % ) NGÀY THEO DÕI Control P3 P4 P5 P6 89 Nhìn chung, qua các thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh của 4 chủng vi khuẩn (thuộc 4 loài khác nhau) phân lập trên tôm mắc hội chứng phân trắng cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn này đều có khả năng gây ảnh hưởng đến đường tiêu hóa của tôm. Đề tài ghi nhận một số dấu