Luận án Một số gen mã hóa carbapenemase và mối liên quan với mức độ kháng carbapenem của acinetobacter baumannii tại Việt Nam

mặt của môi trường MHA đã được ria cấy với huyền dịch E. coli ATCC 29522 (có độ đục tương đương 0,5 McFaland), để 15 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó ủ ở 350C trong 18-24 giờ. Hình 2.6. Hình ảnh kết quả của kỹ thuật CIM [131]. Đọc kết quả (Theo hường dẫn của CLSI [131]): - Carbapenemase dương tính: khi vùng ức chế từ 6–15 mm (Hình 2.6.A) hoặc có mặt của các khuẩn lạc trong vùng 16-18 mm (Hình 2.6.B) - Carbapenemase âm tính: Khi vùng ức chế ≥ 19 mm (Hình 2.6.C) - Không xác định được carbapenemase dương/ âm tính: Nếu vùng ức chế có đường kính 16-18 mm. Cần kiểm tra lại chất lượng kỹ thuật và lặp lại kỹ thuật CIM cho các chủng thử nghiệm và chủng QC. Kiểm tra chất lượng kỹ thuật với chủng: Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705 (chứng dương) và Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1706 (chứng âm). 2.6. XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU Số liệu được quản lý bằng phần mềm Excel. Tính tỷ lệ (%) và kiểm định Khi bình phương hoặc Fisher's exact test được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các tỷ lệ. Kết quả được thể hiện qua các bảng và biểu đồ. Phần mềm Bio-Numeric 6.6 (Applied Math) được sử dụng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen PFGE của các chủng A. baumannii. Các kết quả được trình bày dưới dạng cây phả hệ. 60 2.7. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU Nghiên cứu này là thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, không can thiệp vào quá trình điều trị, không ảnh hưởng đến kết quả điều trị và tâm lý người bệnh. Chỉ sử dụng các thông tin vào mục đích nghiên cứu. Nghiên cứu đã được Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Trường Đại học Y Hà Nội (mã số IRB00003121 được cấp bởi Bộ Y tế và Dịch vụ nhân sinh Hoa Kỳ, ngày 16 tháng 6 năm 2009 được cấp lại ngày 18 tháng 02 năm 2016) thông qua theo Chấp thuận số 187/HĐĐĐĐHYHN ngày 20 tháng 02 năm 2016. 61 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CARBAPENEM VỚI CÁC CHỦNG A. BAUMANNII 3.1.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Bảng 3.1. Phân bố chủng nghiên cứu theo bệnh viện và vùng miền TT Vùng miền Bệnh viện Số lượng Tỷ lệ (%) 1 Miền bắc (n = 67) Trung ương Quân đội 108 15 10,4 46,6 Xanh Pôn 17 11,8 Thanh Nhàn 22 15,3 Bắc Giang 13 9,0 2 Miền Trung (n = 48) Trung ương Huế 23 16,0 33,3 Đa khoa Nghệ An 10 6,9 Đa khoa Hà Tĩnh 15 10,4 3 Miền Nam (n = 29) Chợ Rẫy 14 9,7 20,1 Nhi Đồng 1 15 10,4 Tổng 144 100 144 chủng A. baumannii được thu thập trên bệnh nhân từ 9 bệnh viện thuộc 3 miền của Việt Nam. 4 bệnh viện ở miền Bắc có số mẫu nhiều nhất (46,6%), tiếp đến là 3 bệnh viện ở miền Trung (33,3%), 2 bệnh viện ở miền Nam (20,1%). 62 Bảng 3.2. Phân bố số chủng nghiên cứu theo loại mẫu bệnh phẩm TT Loại mẫu bệnh phẩm Số lượng Tỷ lệ (%) 1 Dịch tiết đường hô hấp 113 78,5 2 Ngoài da và mô mềm 19 13,2 3 Máu 8 5,5 4 Nước tiểu 4 2,8 Tổng 144 100 Trong 144 chủng nghiên cứu, tỷ lệ mẫu bệnh phẩm dịch tiết đường hô hấp là chủ yếu (78,5%), tiếp đến là mẫu bệnh phẩm ngoài da và mô mềm, mẫu bệnh phẩm máu và nước tiểu chiếm tỷ lệ thấp hơn hẳn. 3.1.2. Xác định MIC của carbapenem với các chủng A. baumannii Bảng 3.3. Tỷ lệ A. baumannii đề kháng với carbapenem Số lượng Tỷ lệ (%) Nhạy cảm với carbapenem 24 16,7 Đề kháng với carbapenem 120 83,3 Tổng 144 100 Chú thích: Kháng sinh carbapenem thử nghiệm gồm: IPM, MEM, DOR 144 chủng nghiên cứu, có 120 chủng (83,3%) đề kháng với carbapenem và 24 chủng (16,7%) nhạy cảm với carbapenem. Tất cả các chủng khi nhạy cảm hoặc đề kháng với 1 loại carbapenem thì cũng nhạy cảm hoặc đề kháng với cả 3 loại carbapenem thử nghiệm. 63 Bảng 3.4. Giá trị MIC của kháng sinh với các chủng A. baumanni Kháng sinh Dải MIC (µg/ml) (n=144) Điểm gãy (µg/ml) MIC50 (µg/ml) (n=144) MIC90 (µg/ml) (n=144) Tỷ lệ (%) S R R I S Imipenem 0,025 ->64 ≤2 ≥8 64 >64 83,3 0 16,7 Meropenem 0,06 - 64 ≤2 ≥8 32 64 83,3 0 16,7 Doripenem 0,015 ->64 ≤2 ≥8 32 64 83,3 0 16,7 Ceftazidime 8 - >128 ≤8 ≥32 128 >128 85,4 1,4 13,2 Cefepime 2 - >128 ≤8 ≥32 128 >128 84,0 1,4 14,6 Amikacin 0,5 ->256 ≤16 ≥64 >256 >256 70,8 7,6 21,6 Levofloxacin 0,06 ->64 ≤2 ≥8 64 >64 83,3 4,2 12,5 Minocycline 0,25 - 32 ≤4 ≥16 2 16 21,5 13,2 65,3 Colistin <0,25 –1 ≤2 ≥4 0,25 0,5 00 - 100 7/9 kháng sinh đã bị kháng ≥ 70,8% (trong đó 6 KS đã bị kháng ≥ 83,3%) và MIC50, MIC90 rất cao; tỷ lệ kháng với minocyclin thấp nhất trong các KS thử nghiệm (trừ KS colistin chưa thấy chủng nào đề kháng). Dải giá trị MIC của colistin từ < 0,25 – 1 µg/ml, MIC50 = 0,25 µg/ml, MIC90 = 0,5 µg/ml. Hình 3.1. Hình ảnh cho kỹ thật xác định MIC pha loãng trong thạch Hình 3.1A. Hình ảnh 32 chủng cần kiểm tra MIC trên đĩa môi trường không có KS Hình 3.1.B. Đã có những chủng bị ức chế ở đĩa môi trường có KS. Giá trị MIC được xác định ở đĩa có nồng độ KS thấp nhất mà ở đó các VK bị ức chế phát triển (mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc hoặc không còn khuẩn lạc nào). 64 Bảng 3.5. Mức độ đề kháng của chủng nghiên cứu theo vùng miền Kháng sinh Vùng miền Dải MIC µg/ml (n=144) MIC50 µg/ml (n=144) MIC90 µg/ml (n=144) Tỷ lệ kháng (%) Imipenem Miền Bắc 0,025 - >64 64 >64 88,1 Miền Trung 0,025 - >64 64 >64 81,2 Miền Nam 0,025 - >64 64 >64 75,9 Meropenem Miền Bắc 0,06 - >64 32 64 88,1 Miền Trung 0,06 - >64 32 64 81,2 Miền Nam 0,06 - >64 32 64 75,9 Doripenem Miền Bắc 0,015 - >64 32 64 88,1 Miền Trung 0,015 - >64 32 64 81,2 Miền Nam 0,015 - >64 32 64 75,9 Ceftazidime Miền Bắc 8 - >128 128 >128 91,0 Miền Trung 8 - >128 128 >128 83,3 Miền Nam 8 - >128 128 >128 75,9 Cefepime Miền Bắc 2 - >128 128 >128 89,6 Miền Trung 2 - >128 128 >128 81,2 Miền Nam 2 - >128 128 >128 75,9 Amikacin Miền Bắc 0,5 - >256 >256 >256 74,6 Miền Trung 0,5 - >256 >256 >256 70,8 Miền Nam 0,5 - >256 >256 >256 62,1 Levofloxacin Miền Bắc 0,06 - >64 64 >64 89,6 Miền Trung 0,06 - >64 64 >64 79,2 Miền Nam 0,06 - >64 64 >64 75,9 Minocycline Miền Bắc 0,25 – 32 2 16 23,9 Miền Trung 0,25 – 32 2 16 18,8 Miền Nam 0,25 – 32 2 16 20,7 Colistin Miền Bắc <0,25 – 1 0,25 0,5 00 Miền Trung <0,25 – 1 0,25 0,5 00 Miền Nam <0,25 – 1 0,25 0,5 00 Tỷ lệ đề kháng KS của các chủng A. baumannii ở 3 miền không hoàn toàn như nhau. Nhưng dải giá trị MIC, MIC50, MIC90 của các KS ở 3 miền không có sự khác biệt. 65 Biểu đồ 3.1. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của carbapenem đối với các chủng A. baumannii Giá trị MIC = 32 - 64 µg/ml chiếm tỷ lệ nhiều nhất. DOR có MIC thấp hơn so với IPM và MEM, tỷ lệ DOR có MIC ≥ 64 µg/ml là 29,2% so với 64,5% và 47,9% của IPM và MEM (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,01). Đối với các chủng CSAB, MIC ≤ 0,5 µg/ml là chủ yếu. Bảng 3.6. Giá trị MIC của một số kháng sinh ở 2 nhóm CSAB và CRAB Loại KS Dải MIC (µg/ml) MIC50 (µg/ml) MIC90 (µg/ml) Tỷ lệ (%) kháng CSAB n=24 CRAB n=120 CSAB n=24 CRAB n=120 CSAB n=24 CRAB n=120 CSAB n=24 CRAB n=120 CAZ 4 - 128 8 - >128 8 >128 128 >128 16,7 99,2 <0,001 CPM 2 - 32 16 - >128 4 128 16 >128 8,3 99,2 <0,001 66 AK 0,5 - >256 1 - >256 1 >256 32 >256 8,3 83,3 <0,001 LEV 0,06 - 16 0,125 - 64 2 >64 16 >64 29,2 94,2 <0,001 MI 0,125 - 32 0,25 - 32 0,5 2 8 32 8,3 24,2 <0,05 CO <0,25– 0,5 <0,25 - 1 0,25 0,25 0,5 0,5 0 0 Giá trị MIC50, MIC90 và tỷ lệ đề kháng với một số KS (Ngoại trừ colistin và minocyclin) ở nhóm chủng CSAB thấp hơn hẳn so với nhóm CRAB (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001). Biểu đồ 3.2. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của cefepime ở 2 nhóm CSAB và CRAB Đối với các chủng CSAB, 83,3% số chủng có MIC ≤ 8 µg/ml (còn nhạy cảm với CPM). Đối với các chủng CRAB, 99,2% số chủng đề kháng với CPM và 86,7% số chủng có MIC≥ 128 µg/ml. 67 Biểu đồ 3.3. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của ceftazidime ở 2 nhóm CSAB và CRAB Đối với các chủng CSAB, 79,2% số chủng có MIC ≤ 8 µg/ml (còn nhạy cảm với CAZ). Đối với các chủng CRAB, 99,2% số chủng đề kháng với CPM và 97,5% số chủng có MIC≥ 128 µg/ml. Biểu đồ 3.4. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của amikacin ở 2 nhóm CSAB và CRAB Đối với các chủng CSAB, 83,3% số chủng có MIC ≤ 16 µg/ml (nhạy cảm với AK), trong đó MIC ≤2 µg/ml là chủ yếu (70,8%). Đối với các chủng CRAB, 85,0% số chủng cũng đề kháng với AK và 80,0% số chủng có MIC≥ 256 µg/ml. 68 Biểu đồ 3.5. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của levofloxacin ở 2 nhóm CSAB và CRAB Đối với các chủng CSAB, 58,3% số chủng có MIC ≤ 2 µg/ml (nhạy cảm với LEV), MIC ≤1 µg/ml là 45,8%. Đối với các chủng CRAB, 95,0% số chủng đề kháng với LEV và 67,5% số chủng có MIC≥ 64 µg/ml. Biểu đồ 3.6. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của minocyclin ở 2 nhóm CSAB và CRAB Đối với cả 2 nhóm CSAB và CRAB, tỷ lệ chủng nhạy cảm với MI còn khá cao (87,5% và 60,8%) (Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05). MIC ≤ 1 µg/ml là 58,3% và 42,5% ở 2 nhóm. 69 Biểu đồ 3.7. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của colistin ở 2 nhóm CSAB và CRAB Đối với cả 2 nhóm CSAB và CRAB, 100% số chủng còn nhạy cảm với colistin và không có sự khác biệt về phân bố giá giá trị MIC giữa 2 nhóm. Gần 1/2 số chủng có MIC = 0,25 µg/ml. Hình 3.2. Hình ảnh kỹ thuật xác định MIC đối với colistin 70 3.2. PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN MÃ HÓA CARBAPENEMASE LỚP D, B CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII 3.2.1. PCR phát hiện một số gen mã hóa carbapenemase Biểu đồ 3.8. Tỷ lệ gen mã hóa carbapenemae phát hiện được ở các chủng A. baumannii Trong 144 chủng A. baumannii, 79,9% mang gen blaOXA-23-like, gen blaOXA-58-like và blaNDM-1 chiếm tỷ lệ thấp (5,6% và 6,3%), 80,6% có ISAba1 và 86,9% (110/115) số chủng mang gen blaOXA-23-like có ISAba1 ở vùng trước của gen blaOXA-23-like (ISAba1/blaOXA-23-like). Không xác định được chủng nào mang gen blaOXA-24-like, blaIMP, blaVIM, blaSPM, blaGIM, blaSIM. Biểu đồ 3.9. Tỷ lệ tổ hợp các gen mã hóa carbapenemase ở các chủng A. baumannii 71 Trong số144 chủng, chỉ có 15,9% số chủng dương tính với duy nhất gen blaOXA-51-like. Trong khi đó, 76,4% số chủng mang hai gen (nhiều nhất là tổ hợp blaOXA-51-like+blaOXA-23-like); 7,6% số chủng mang tổ hợp 3 gen mã hóa carbapenemase. Bảng 3.7. Tỷ lệ các chủng A. baumannii dương tính với ISAba1 ISAba1 dương tính (n=116) Chủng chỉ có blaOXA-51-like Chủng có blaOXA-23-like Chủng không có blaOXA-23-like Số chủng dương tính/tổng 6/23 110/115 0/6 Tỷ lệ (%) 26,1 95,7 0 Trong 116 chủng dương tính với ISAba1, 26,1% số chủng chỉ mang blaOXA-51-like và 95,7% các chủng có blaOXA-23-like dương tính với ISAba1, các chủng không có blaOXA-23-like không dương tính với ISAba1. Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen blaOXA của các chủng A. baumannii Chú thích: Giếng 1-9: Kết quả đại diện phát hiện gen blaOXA-51-like, blaOXA-23- like, blaOXA-58-like của các chủng A. baumannii nghiên cứu. P1: Chứng dương 1- ADN mang gen blaOXA-51-like blaOXA-23-like,. P2: Chứng dương 2- ADN mang gen blaOXA-51, blaOXA-58 của A. baumannii; N: chứng âm; M: thang chuẩn 100bp. 72 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen blaNDM-1 của các chủng A. baumannii Chú thích: P: Chứng dương - DNA mang gen blaNDM-1 của A. baumannii. N: chứng âm; M: thang chuẩn (100bp). Mẫu 1,4,5,6,8: Dương tính với gen blaNDM-1. Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen ISAba1 và ISAba1/blaOXA-23 của các chủng A. baumannii Chú thích: P1: Chứng dương - DNA mang gen ISAba1. P2: Chứng dương - DNA mang gen ISAba1/blaOXA-23. N1, N2: chứng âm; M: thang chuẩn (100bp). Mẫu 1, 2: Dương tính với ISAba1; Mẫu 4,6: ISAba1/blaOXA-23 73 Hình 3.6. Kết quả đại diện so sánh giải trình tự sản phẩm PCR gen blaOXA-51-like với trình tự gen chuẩn Kết quả PCR và giải trình tự sản phẩm PCR đối với gen blaOXA-51-like của các chủng nghiên cứu như ở hình 3.4 và hình 3.7 (độ tương đồng 100% với trình tự gen blaOXA-51-like trên cơ sở dữ liệu của NCBI) đã khẳng định gen blaOXA-51-like phát hiện được trong nghiên cứu này là chính xác và đúng theo các tham chiếu quốc tế (kết quả giải trình tự được trình bày tại phụ lục 2). 74 Acinetobacter baumannii strain 6AB15 insertion sequence ISAba1, complete sequence; and OXA-23 carbapenemase (oxa-23) gene, complete cds Sequence ID: GQ849192.1 Length: 2036 Number of Matches: 1 75 Hình 3.7. Kết quả đại diện so sánh giải trình tự sản phẩm PCR gen ISAba1/blaOXA-23-like với trình tự gen chuẩn Kết quả PCR và giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen ISAba1/blaOXA-23- like của các chủng nghiên cứu như ở hình 3.6 và hình 3.8 (độ tương đồng 99% với trình tự gen ISAba1/blaOXA-23-like trên cơ sở dữ liệu của NCBI) đã khẳng định gen ISAba1/blaOXA-23-like phát hiện được trong nghiên cứu này là chính xác và đúng theo các tham chiếu quốc tế (kết quả giải trình tại phụ lục 7). Tương tự, đối với các gen blaOXA-23-like, blaOXA-58-like, blaNDM-1, ISAba1, ISAba1/blaOXA-23-like kết quả giải trình tự sản phẩm PCR các gen tương ứng của các chủng nghiên cứu đã khẳng định các gen phát hiện được trong nghiên cứu này là chính xác và đúng theo các tham chiếu quốc tế (kết quả giải trình tự được trình bày tại phụ lục 3, 4, 5, 6, 7). 76 Biểu đồ 3.10. Tỷ lệ các gen mã hóa carbapenemase ở 2 nhóm CSAB VÀ CRAB Đối với CSAB, ngoài blaOXA-51-like, chỉ có 8,3% số chủng mang blaOXA-58-like và 20,8% có ISAba1. Gen blaOXA-23-like, blaNDM-1 ISAba1/blaOXA-51-like chỉ có ở nhóm CRAB. Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii mang 1 và ≥ 2 gen mã hóa carbapenemase Các chủng chỉ mang gen blaOXA-51-like có tỷ lệ đề kháng với các KS thấp hơn nhiều so với các chủng có ≥ 2 gen mã hóa carbapenemase (với p< 0,001). 77 Biểu đồ 3.12. Tỷ lệ giá trị MIC của carbapenem giữa 2 nhóm mang blaOXA-23-like có và không có ISAba1/blaOXA-23-like Tỷ lệ các giá trị MIC của 2 loại KS IPM và MEM gần tương tự nhau giữa các chủng mang blaOXA-23-like có hoặc không có ISAba1/blaOXA-23-like. Đối với DOR, nhóm chủng có ISAba1/blaOXA-23-like có tỷ lệ MIC ≥ 64 µg/ml cao hơn nhóm chủng không có ISAba1/blaOXA-23-like (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05). Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ các gen mã hóa carbapenemase ở các chủng A. baumannii theo vùng miền Các gen mã hóa carbapenemase đều có ở các chủng A. baumannii phân lập được tại các bệnh ở 3 miền với tỷ lệ gần tương tự nhau. 78 Biểu đồ 3.14. Tỷ lệ cac gen mã hóa carbapenemase ở các chủng A. baumannii theo tuyến bệnh viện Tỷ lệ các gen mã hóa carbapenemase ở các chủng A. baumannii phân lập được tại các bệnh viện tuyến trung ương cao hơn các bệnh viện tuyến tỉnh (tuy nhiên, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê chỉ đối với gen blaNDM-1 với p <0,05). 3.2.2. Xác định mối liên hệ kiểu gen PFGE và kiểu hình đề kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii Hình 3.8. Hình ảnh đại diện cho kiểu gen PFGE của A.baumannii Chú thích: M: Thang ADN chuẩn của Salmonella braenderup H9812 1-12: Là ADN của 12 chủng A. baumannii xác định kểu gen PFGE 79 Hình 3.9A 80 Hình 3.9B 81 Hình 3.9C Hình 3.9 (hình 3.9A, 3.9B, 3.9C): Mối liên hệ kiểu gen của 144 chủng A. baumannii phân lập tại 9 bệnh viện Kết quả PFGE tại hình 3.8 cho thấy, các chủng A. baumannii có kiểu gen đa dạng (với 26 cụm có độ tương đồng về kiểu gen ≥ 80%, trong đó có 2 cụm có độ tương đồng 100%. Các cụm tương đồng về kiểu gen gồm các chủng trong cùng 1 bệnh viện hoặc các bệnh viện và các vùng miền khác nhau. 82 Hình 3.10A 83 Hình 3.11B Hình 3.10 (hình 3.10A, 3.10B): Kiểu hình đề kháng ở các cụm có kiểu gen PFGE tương đồng Ghi chú: AMR: Tính kháng kháng sinh (Nhạy cảm: ; Kháng/trung gian 1: IPM, 2: MEM, 3: DOR, 4: CPM, 5: CAZ, 6: AK, 7: LVX, 8: MI, 9: CO Kiểu hình đề kháng kháng sinh của các chủng thuộc một cụm kiểu gen PFGE không hoàn toàn giống nhau. 15/26 cụm có sự khác biệt đối với kháng sinh minocycline, các kháng sinh khác ít có sự khác biệt hơn (3-5/26 cụm). 84 3.3. XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA MIC VỚI SỰ XUẤT HIỆN CARBAPENEMASE VÀ GEN MÃ HÓA CARBAPENEMASE Hình 3.11. Ảnh kết quả đại diện thử nghiệm MHT (trái) và THT (phải) Chú thích: 1: Chủng chứng dương; 2: Chủng chứng âm với carbapenemase. 3,4: Chủng A. baumannii kiểm tính tra sinh carbapenemase Chủng 3,4: Âm tính với carbapenemase ở MHT nhưng dương tính ở THT Hình 3.12: Ảnh kết quả đại diện cho kỹ thuật CarbAcineto NP Ống 1: Chứng nội; ống 2: Chứng âm; ống 3: chứng dương; ống 4: Mẫu thử dương tính với carbapenemase có blaNDM-1 (Chuyển màu từ đỏ sang vàng hoàn toàn, trong vòng 20 phút); ống 7: Mẫu dương tính carbapenemase có blaOXA-23 (Từ đỏ sang vàng cam); ống 8: Mẫu có blaOXA-58 (Từ đỏ sang đỏ cam) (Đọc kết quả âm tính); Ống 5,6: Mẫu âm tính với Carbapenemase 85 Bảng 3.8. Tỷ lệ carbapenemase dương tính theo từng kỹ thuật Kỹ thuật MHT THT CarbAci NP CarbAci NP cải tiến CIM Tính chung* Số lượng 7/144 7 (Y) 117/144 5 (Y) 119/144 9 (N) 119/144 9 (N) 121/144 121/144 Tỷ lệ (%) 4,9 81,2 82,6 82,6 84,0 84,0 Chú thích: Tính chung*: Tiêu chuẩn xác định 1 chủng sinh carbapenemase khi chủng đó cho kết quả “dương tính” với bất kỳ 1 trong 5 kỹ thuật. (Y): Dương tính yếu (Khó xác định dương tính/âm tính) (N): Dương tính nhanh trong vòng 20 phút Kỹ thuật CIM có tỷ lệ dương tính với carbapenemase cao nhất (84,0%). Tiếp đến là kỹ thuật CarbAcineto NP và CarbAcineto NP cải tiến (2 kỹ thuật này cho kết quả hoàn hoàn tương đồng nhau) và cho kết quả dương tính nhanh (N) trong vòng 20 phút đối với chủng có blaNDM-1. Kỹ thuật MTH cho tỷ lệ dương thấp nhất (trong đó, cả 7/7 cho kết quả dương tính yếu (Y). 86 Bảng 3.9. Mối liên quan giữa MIC với carbapenemase dương tính theo từng kỹ thuật Nhạy/kháng carbapenem MIC (µg/ml) Tỷ lệ carbapenemase dương tính p MHT THT CarbAcineto NP CarbAcineto NP cải tiến CIM Tính chung* Tổng <0,001 Nhạy cảm (n=24) ≤ 2 (n=24) 0 1 (Y) 1 (Y) 1 (Y) 2 (8,3) 2 (8,3) 2 (8,3) Đề kháng (n=120) 8 (n=2) 0 0 1 (50,0) 1 (50,0) 1 (50,0) 1 (50,0) 119/120 (99,2) 16 (n=6) 0 5 (83,3) 6 (100) 6 (100) 6 (100) 6 (100) 32 (n=20) 0 20 (100) 20 (100) 20 (100) 20 (100) 2 (100) ≥64 (n=92) 7 (Y) (7,6) 91 (98,9) 91 (98,1) 91 (98,1) 92 (100) 92 (100) TỔNG 7/144 (4,9) 117/144 (81,2) 119/144 (82,6) 119/144 (82,6) 121/144 (84,0) 121/144 (84,0) Có sự khác biệt về tỷ lệ dương tính với carbapenemase giữa 2 nhóm: CSAB với MIC ≤ 2 µg/ml và CRAB với MIC ≥ 8 µg/ml (8,3% so với 99,2%). Tuy nhiên, tỷ lệ dương tính với từng kỹ thuật khác nhau: CIM có tỷ lệ dương tính cao nhất, tiếp đến là CarbAcineto NP, CarbAcineto NP cải tiến. Đối với kỹ thuật THT và MHT, tỷ lệ dương tính cao hơn đối với các chủng có MIC cao. MHT chỉ dương tính yếu (Y) với chủng có MIC ≥ 64 µg/ml. 87 Bảng 3.10. Mối liên quan giữa gen mã hóa carbapenemase với carbapenemase dương tính theo từng kỹ thuật Số lượng gen Gen mã hóa carbapenemase Dương tính với carbapenemase p MHT THT CarbAcineto NP CarbAcineto NP cải tiến CIM Tính chung* Tổng 1 gen (n=23) blaOXA-51* 0 0 0 0 0 0 0 - ≥ 2 gen (n=121) blaOXA-51+ blaOXA-58 (n=2) 0 1 (Y) 1 (Y) 1(Y) 2 (100) 2 (100) 121/121 (100) blaOXA-51+ blaOXA-23 (n=106) 4 (Y) (3,8) 103 (97,1) 105 (99,1) 105 (99,1) 106 (100) 106 (100) blaOXA-51+ blaNDM-1 (n=2) 0 2 (Y) (100) 2 (N) (100) 2 (N) (100) 2 (100) 2 (100) blaOXA-51+ blaOXA-23+blaOXA-58 (n=4) 1 (Y) (25,0) 4 (100) 4 (100) 4 (100) 4 (100) 4 (100) blaOXA-51+blaOXA-23+ blaNDM-1 (n=5) 2 (Y) (100) 5 (100) 5 (N) (100) 5 (N) (100) 5 (100) 5 (100) blaOXA-51+blaOXA-58+ blaNDM-1 (n=2) 0 2 (Y) (100) 2 (N) (100) 2 (N) (100) 2 (100) 2 (100) Tổng 7/144 117/144 119/144 119/144 121/144 121/144 Các chủng chỉ có blaOXA-51-like, không có chủng nào dương tính (+) với carbapenemase. 100% chủng có ≥2 gen: dương tính với carbapenemase. Tuy nhiên, tỷ lệ (+) với carbapenemase là khác nhau giữa các kỹ thuật: CIM (+) 100% và là kỹ thuật duy nhất (+) với chủng mang blaOXA-51-like+ blaOXA-58-like; MHT có tỷ lệ (+) thấp nhất và chỉ cho kết quả (+) yếu (Y). CarbAcineto NP cho kết quả dương tính nhanh (N) đối với chủng có blaNDM-1 (khoảng 20 phút). 88 Bảng 3.11. Mối liên quan giữa MIC với sự xuất hiện carbapenemase và gen mã hóa carbapenemase ở A. baumannii Gen carbapene- mase MIC của IPM Tỷ lệ carbapenemase dương tính ≤2 8 16 32 ≥64 MHT THT Carb- Acineto NP Carb- Acineto- NP cải tiến CIM Tính chung* Tổng blaOXA-51* (n=23) 22 (83,3) 0 0 0 0 0 0 0 1 (16,1) 0 0 0 0 0 0 blaOXA-51 + blaOXA-58 (n=2) 2 (100) 0 1 (Y) 1 (Y) 1 (Y) 2 2 2/2 (100) blaOXA-51 + blaOXA-23 (n=106) 1 (0,94) 0 0 1 1 1 1 106/106 (100) 6 (5,7) 0 5 6 6 6 6 18 (16,9) 0 18 18 18 18 18 81 (76,4) 4 80 80 80 81 81 89 blaOXA-51 + blaOXA-58+ blaOXA-23 (n=4) 4 (100) 1 (Y) 4 4 4 4 4 4/4 (100) blaOXA-51 + blaNDM-1 (n=2) 1 (50,0) 0 1 (Y) 1 (N) 1 (N) 1 1 2/2 (100) 1 (50,0) 0 1 (Y) 1 (N) 1 (N) 1 1 blaOXA-51 + blaOXA-23+ blaNDM-1 (n=5) 5 (100) 2 (Y) 5 5 (N) 5 (N) 5 5 5/5 (100) blaOXA-51 + blaOXA-58+ blaNDM-1 (n=2) 1 (50,0) 0 1 (Y) 1 (N) 1 (N) 1 1 2/2 (100) 1 (50,0) 0 1 (Y) 1 (N) 1 (N) 1 1 Tổng 24/144 2/144 6/144 20/144 92/144 7/144 117/144 119/144 119/144 121/144 121/188 121/144 Trong 23 chủng dương tính duy nhất với blaOXA-51-like, 22/23 chủng có MIC của IPM ≤ 2 µg/ml, 01/23 chủng có MIC = 8 µg/ml và tất cả đều âm tính với carbapenemase. 100% chủng mang gen blaOXA-23-like và hoặc blaNDM-1 có MIC của IPM từ 8 - ≥ 64 µg/ml và dương tính với carbapenemase. Tỷ lệ dương tính với carbapenemase ở chủng có MIC≤2 µg/ml thấp hơn nhiều so với chủng có MIC ≥8µg/ml (8,3% so với 99,2%) (với p<0,001). 90 Chương 4 BÀN LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CARBAPENEM VỚI CÁC CHỦNG A. BAUMANNII 4.1.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện chọn có chủ đích tại 9 bệnh viện ở 3 miền của Việt Nam. Trong đó, có 4 bệnh viện ở miền Bắc, 3 bệnh viện ở miền Trung và 2 bệnh viện ở miền Nam. Mỗi miền có 1 bệnh viện tuyến trung ương và các bệnh viện tuyến tỉnh. Do việc thu thập mẫu khó khăn nên số lượng mẫu thu thập ở các bệnh viện chưa được cân đối, đặc biệt ở miền Nam chỉ thu thập được mẫu từ 2 bệnh viện (ít hơn so với miền Bắc và miền Trung). Việc xác định chính xác về mức độ loài của Acinetobacter là rất cần thiết vì các loài Acinetobacter khác nhau có sự khác nhau về đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh, tính nhạy cảm và cơ chế đề kháng kháng sinh. A. baumannii thường gây bệnh với mức độ nặng hơn, khả năng đề kháng kháng sinh và tỷ lệ tử vong cao hơn các loài Acinetobacter khác [46],[50],[152]. Tuy nhiên, rất khó để phân biệt chính xác các loài trong phức hợp A. calcoaceticus - A. baumannii complex (ABC complex), gồm: A. baumannii, Acinetobacter pittii, Acinetobacter nosocomialis, Acinetobacter seifertii, Acinetobacter dijkshoorniae và Acinetobacter calcoaceticus do chúng có liên quan rất chặt chẽ với nhau, biểu hiện về kiểu hình và các tính chất sinh hóa gần tương tự nhau [153]. Với các phương pháp xác định kiểu hình hiện có, như: bộ định danh API 20NE (BioMerieux, Pháp), hệ thống định danh tự động thương mại (VITEK 2, Phoenix, Biolog, MicroScan WalkAway) không đủ chính xác để xác định và phân biệt các loài trong phức hợp ABC complex [78],[79]. Một nghiên cứu trên 130 chủng Acinetobacter spp. được xác định bằng phương 91 pháp lai ADN với 18 loài gen khác nhau đã được sử dụng để đánh giá khả năng xác định loài của Acinetobacter bằng bộ định danh API 20NE (với phiên bản 5.1) cho thấy API 20NE có độ chính xác là 87% [79]. Gen blaOXA-51-like được xác định là gen nội tại tự nhiên nằm trên nhiễm sắc thể của A. baumannii. Kết quả của một số nghiên cứu cho thấy việc phát hiện gen blaOXA-51-like có thể được sử dụng như một cách khá đơn giản và đáng tin cậy để xác định A. baumannii [77],[78]. Theo kết quả nghiên cứu của Turton và CS trên các chủng Acinetobacter nhận được từ các phòng thí nghiệm tham chiếu của Anh (năm 2005 - 2006), gen blaOXA-51-like nằm trên nhiễm sắc thể của 141 chủng A. baumannii (Được xác định bằng giải trình tự 16sRNA) đại diện cho 23 kiểu gen, nhưng không được xác định ở 22 loài Acinetobacter khác [77]. Tương tự, một nghiên cứu khác, với 2582 chủng Acinetobacter spp. được phân lập trên lâm sàng từ 27 tỉnh ở Trung Quốc (2009-2010). Đã xác định gen