Luận án Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của Phytosome Silybin

iến hành bào chế 03 mẻ phytosome silybin theo quy trình như hình 3.17 với công thức bào chế thể hiện ở bảng 3.28. Bảng 3.28. Thành phần công thức bào chế phytosome silybin 150g/mẻ STT Thành phần Đơn vị Số lượng 1. Silybin 95% gam 25,0 2. Phosphatidyl cholin 90% gam 75,0 3. Maltodextrin gam 40,0 4. Aerosil gam 10,0 5. EtOHtđ ml 3880,0 6. THF ml 120,0 7. Nước cất ml 850,0 Tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của phytosome bào chế: a. Kết quả đánh giá hình thái cấu trúc tiểu phân Bột phytosome silybin là dạng bột khô tơi, màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, dễ hút ẩm ngoài không khí. 92 Đặc điểm hình thái học của tiểu phân được xác định bằng phương pháp ghi ở mục 2.2.1.3.b. Kết quả thể hiện ở Hình 3.18. Hình 3.18. Hình ảnh chụp SEM (a) Silybin nguyên liệu; (b) bột phytosme silybin; (c) Maltodextrin; (d) Aerosil và chụp TEM (e) bột phytosome silybin sau rửa tá dược Kết quả chụp SEM cho thấy khi tiểu phân phytosome silybin có dạng hình cầu, trong đó maltodextrin và aerosil tồn tại hỗn độn hoặc bám dính trên bề mặt của phytosome. Trong khi silybin có cấu trúc tinh thể. Kết quả chụp TEM cũng thể hiện dạng hình cầu. b. KTTP, PDI và thế Zeta Tiến hành đánh giá KTTP, PDI, thế Zeta như mô tả ở mục 2.2.1.3.c-d. Kết quả được trình bày trong bảng 3.29 Bảng 3.29. KTTP, PDI, thế Zeta của phytosome silybin (n=3) Mẻ KTTP (nm) PDI Thế Zeta 1 189,5 ± 6,4 0,430 ± 0,011 - 50,0 ± 1,5 2 188,7 ± 7,9 0,443 ± 0,024 - 50,9 ± 1,8 3 187,9 ± 8,0 0,437 ± 0,021 - 51,2 ± 1,6 Nhận xét: cả 3 mẻ bột phytosome phun sấy có kích thước tiểu phân trung bình dao động từ 150 - 250 nm, giá trị PDI < 0,5 cho phân bố KTTP tương đối đồng đều. 93 c. Kết quả đánh giá hệ số phân bố dầu nước Đánh giá hệ số phân bố dầu nước của bột phytosome theo mục 2.2.1.3.g. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.30. Bảng 3.30. Hệ số phân bố dầu nước silybin và phytosome silybin (n=3) Môi trường thử Tên mẫu Log D pH 1,2 Silybin 2,66 ± 0,07 Phytosome silybin mẻ 1 1,51 ± 0,06 mẻ 2 1,54 ± 0,04 mẻ 3 1,52 ± 0,04 pH 6,8 Silybin 2,33 ± 0,07 Phytosome silybin mẻ 1 1,41 ± 0,06 mẻ 2 1,39 ± 0,03 mẻ 3 1,40 ± 0,04 pH 7,4 Silybin 2,19 ± 0,06 Phytosome silybin mẻ 1 1,02 ± 0,03 mẻ 2 1,03 ± 0,04 mẻ 3 1,04 ± 0,03 Nhận xét: hệ số log D7,4 của silybin lớn hơn 2 thể hiện độ tan của silybin trong dung môi thân dầu n-octanol cao hơn nhiều trong môi trường nước. Khi hình thành dạng phytosome, hệ số log D của silybin có sự thay đổi ở các pH thử nghiệm. Xu hướng chung là giá trị log D giảm xuống dưới 2. Như vậy, so với nguyên liệu, silybin dạng phytosome đạt được sự cân bằng dầu-nước tốt hơn. Điều này cũng phù hợp với việc độ tan trong nước của silybin tăng lên khi ở dạng phytosome. d. Kết quả đánh giá độ hòa tan của phytosome silybin Tiến hành đánh giá độ hòa tan của phytosome silybin theo như mô tả ở mục 2.2.1.3.h. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.31 và 3.32 Bảng 3.31. Độ hòa tan của bột phytosome silybin từ 3 mẻ bào chế trong dung dịch pH 1,2 (n=3) Thời gian (phút) % silybin hòa tan Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Silybin NL 10 6,54 ± 0,50 5,27 ± 0,51 7,22 ± 0,32 2,02 ± 0,22 30 12,63 ± 0,65 11,42 ± 0,66 13,86 ± 0,50 2,41 ± 0,23 94 Thời gian (phút) % silybin hòa tan Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Silybin NL 60 18,85 ± 0,82 17,53 ± 0,98 20,27 ± 0,65 2,82 ± 0,22 120 24,99 ± 1,04 23,69 ± 1,22 26,67 ± 0,86 3,24 ± 0,20 180 30,46 ± 1,20 29,12 ± 1,34 32,21 ± 1,04 3,59 ± 0,19 240 36,11 ± 1,36 34,77 ± 1,48 37,88 ± 1,18 3,96 ± 0,18 Bảng 3.32. Độ hòa tan của bột phytosome silybin từ 3 mẻ bào chế trong dung dịch pH 6,8 (n=3) Thời gian (phút) % silybin hòa tan Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Silybin NL 10 33,87 ± 1,57 32,51 ± 1,91 34,84 ± 2,73 2,86 ± 0,12 30 66,81 ± 3,09 66,00 ± 2,86 68,35 ± 2,34 3,25 ± 0,17 60 91,71 ± 3,46 90,06 ± 4,07 93,70 ± 2,90 3,63 ± 0,18 120 96,15 ± 3,97 94,37 ± 4,78 97,92 ± 4,21 4,04 ± 0,18 180 97,35 ± 4,16 95,57 ± 4,91 99,13 ± 4,13 4,46 ± 0,24 240 97,35 ± 4,16 95,57 ± 4,91 99,13 ± 4,13 4,77 ± 0,16 Nhận xét: Kết quả cho thấy các mẻ bào chế có tính đồng nhất về độ hòa tan của phytosome silybin. So với silybin nguyên liệu, lượng hoạt chất hòa tan từ bột phytosome silybin nhiều hơn với tốc độ giải phóng nhanh hơn. e. Kết quả đánh giá độ tan của phytosome silybin Tiến hành đánh giá độ tan silybin dạng phytosome trong dung môi nước theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.1.1.f. Kết quả thể hiện ở bảng 3.33 Bảng 3.33. Độ tan silybin dạng phytosome trong dung môi nước (n=3) Mẫu Độ tan silybin trong nước (µg/mL) Phytosome silybin Mẻ 1 592,70 ± 25,58 Mẻ 2 592,16 ± 29,27 Mẻ 3 593,63 ± 23,97 Nguyên liệu silybin 9,29 ± 0,32 Nhận xét: độ tan trong nước của silybin ở dạng bột phytosome đã tăng khoảng gần 59 lần so với dạng tự do. Có thể thấy nghiên cứu bào chế silybin dưới dạng phytosome có thể cải thiện đáng kể độ tan trong nước của silybin. 95 f. Kết quả định tính Tiến hành định tính Si-A và Si-B trong bột phytosome bằng phương pháp HPLC theo phương pháp được mô tả ở mục 2.2.1.1. Kết quả được thể hiện ở hình 3.19. Hình 3.19. SKĐ của silybin chuẩn (a), bột phytosome silybin (b) Nhận xét: Mẫu bột phytosome silybin xuất hiện pic của Si-A và Si-B với thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của Si-A và Si-B của mẫu chuẩn. Như vậy, bột phytosome silybin đạt yêu cầu trong phép thử định tính. g. Kết quả hàm lượng, KLR, độ ẩm và CI Tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về hàm lượng silybin (toàn phần và dạng phytosome), mất khối lượng do làm khô, KLR và chỉ số CI theo mô tả ở mục 2.2.1.3. Kết quả thể hiện ở bảng 3.34 Bảng 3.34. Một số chỉ tiêu chất lượng 3 mẻ phytosome silybin bào chế quy mô 150g/mẻ (n=3) Mẻ Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Độ ẩm (%) 3,47 ± 0,16 3,46 ± 0,16 3,45 ± 0,14 KLR (g/mL) 0,415 ± 0,013 0,418 ± 0,014 0,416 ± 0,015 CI (%) 19,20 ± 0,80 19,33 ± 0,83 19,13 ± 0,76 Hps (%) 90,03 ± 4,22 89,76 ± 4,85 90,14 ± 4,23 Hth (%) 94,44 ± 3,67 94,17 ± 3,17 94,60 ± 2,49 HL Sitp (%) 13,43 ± 0,40 13,48 ± 0,39 13,56 ± 0,50 HL Siphy (%) 12,68 ± 0,82 12,60 ± 0,40 12,69 ± 0,67 Nhận xét: ở quy mô bào chế 150g/mẻ, bột phytosome silybin thu được vẫn đảm bảo về các chỉ tiêu chất lượng về độ ẩm (dưới 5%), hàm lượng silybin toàn phần (khoảng 13%) và hàm lượng silybin dạng phytosome (khoảng 12%). (a) (b) 96 Khả năng trơn chảy của khối bột đạt ở mức khá (CI % nằm trong khoảng 16 - 20). Khối lượng riêng của bột phytosome silybin khoảng 0,4 g/ml. Bột phù hợp sử dụng trong các dạng bào chế như viên nén, viên nang. h. Kết quả đánh giá sự hình thành liên kết giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome Tiến hành đo và phân tích phổ FTIR, XRD, DSC, NMR theo như mô tả ở mục 2.2.1.3.i, của các mẫu gồm: Silybin nguyên liệu, PC, phức hợp Si-PC và hỗn hợp vật lý Si-PC. h.1. Kết quả đánh giá bằng phân tích nhiệt vi sai (DSC) Phân tích DSC thực hiện với các mẫu gồm silybin nguyên liệu, PC, phức hợp Si-PC và hỗn hợp vật lý Si-PC. Kết quả thể hiện trong hình 3.20. Hình 3.20. Phổ DSC: A- nguyên liệu silybin, B- nguyên liệu PC C- hỗn hợp vật lý, D- phổ của phức hợp Si-PC Nhận xét: Đường cong DSC của 4 mẫu silybin, PC, hỗn hợp vật lý và phức hợp Si-PC cho thấy mẫu silybin có một đỉnh thu nhiệt ở 172,3oC tương ứng với khoảng nhiệt độ nóng chảy của silybin. Với mẫu PC nguyên liệu, đường cong DSC cho thấy một dải thu nhiệt với điểm bắt đầu thu nhiệt Furnace temperature /°C50 100 150 200 250 300 350 HeatFlow/mW -10 -5 0 5 10 Peak :172.3002 °C Onset Point :148.3582 °C Enthalpy /J/g : 128.6406 (Endothermic effect) Peak :299.9170 °C Onset Point :284.3274 °C Enthalpy /J/g : -158.4077 (Exothermic effect) Figure: 21/05/2019 Mass (mg): 9.16 Crucible:Al 100 µl Atmosphere:ArExperiment:HoaHVQY 1 Procedure: RT-300 degree C (Zone 2)DSC131 Exo Furnace temperature /°C50 100 150 200 250 300 350 HeatFlow/mW -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 Peak :107.0545 °C Onset Point :39.7775 °C Enthalpy /J/g : 187.3434 (Endothermic effect) Peak :246.4189 °C Onset Point :243.6215 °C Enthalpy /J/g : 10.7733 (Endothermic effect) Peak :334.5344 °C Onset Point :304.8200 °C Enthalpy /J/g : -110.0615 (Exothermic effect) Figure: 21/05/2019 Mass (mg): 21.36 Crucible:Al 100 µl Atmosphere:ArExperiment:HoaHVQY 2 Procedure: RT-300 degree (Zone 2)DSC131 Exo Furnace temperature /°C50 100 150 200 250 300 350 HeatFlow/mW -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 4 Peak :136.2391 °C Onset Point :121.5649 °C Enthalpy /J/g : 12.3813 (Endothermic effect) Peak :185.4128 °C Onset Point :172.3019 °C Enthalpy /J/g : 35.3121 (Endothermic effect) Peak :387.8571 °C Figure: 21/05 2019 Mass (mg): 17.43 Crucible:Al 100 µl Atmosphere:ArExperiment:HoaHVQY 3 Procedure: RT-300 d gree C (Zone 2)DSC131 Exo Furnace temperature /°C50 100 150 200 250 300 350 HeatFlow/mW -5 5 15 25 35 45 Peak :72.6580 °C Onset Point :52.5320 °C Enthalpy /J/g : 38.6929 (Endothermic effect) Peak :351.1530 °C Onset Point :301.5826 °C Enthalpy /J/g : -1711.9750 (Exothermic effect) Peak :259.4376 °C Figure: 21/05/2019 Mass (mg): 6.51 Crucible:Al 100 µl Atmosphere:ArExperiment:HoaHVQY 4 Procedure: RT-300 degree C (Zone 2)DSC131 Exo A B C D 97 (onset) ở 35,3oC và đỉnh ở 107,1oC tương ứng với nhiệt độ nóng chảy của PC khi đuôi thân dầu từ trạng thái gel chuyển qua trạng thái tinh thể lỏng. Với hỗn hợp vật lý cho thấy hai đỉnh thu nhiệt tương ứng với hai đỉnh thu nhiệt của hai nguyên liệu cấu thành. Trong khi đó, ở đường cong DSC của phức hợp Si-PC, hai đỉnh thu nhiệt của silybin và PC hoàn toàn biến mất. Thay vào đó là một đỉnh thu nhiệt mới thấp hơn ở 72,6oC. Điều này gợi ý rằng có sự hình thành liên kết giữa silybin và PC. Nhiệt độ nóng chảy giảm xuống cũng chỉ dấu rằng năng lượng liên kết giữa các cấu tử giảm mạnh, độ tan của hệ tăng lên. h.2. Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Phân tích phổ FT-IR thực hiện với các mẫu gồm silybin nguyên liệu, PC, phức hợp Si-PC và hỗn hợp vật lý Si-PC. Kết quả thể hiện trong hình 3.21. Hình 3.21. Phổ FTIR: A- nguyên liệu silybin, B- nguyên liệu PC, C- hỗn hợp vật lý, D- phức hợp Si-PC Nhận xét: Dựa trên bảng băng sóng hấp thụ IR đặc trưng của từng nhóm chức, xác định số sóng các nhóm chức đặc trưng của nguyên liệu và PC. Phổ IR của phân tử PC, nhóm (RO)2PO2- bao gồm P=O có số sóng tại 1243,86 cm-1, P-O- tại 1081,87 cm-1. (A) (B) (C) (D) 98 Phổ IR của silybin có 3 đỉnh hấp thụ đặc trưng cho 3 liên kết hydro O- H tự do trong phân tử lần lượt là tại 3609,13; 3454,85 và 3131,83 cm-1. Phổ IR mẫu hỗn hợp vật lý xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm O-H tự do và cả nhóm (RO)2PO2-. Phổ IR của phức hợp cho thấy pic ở 3609,13 cm-1 của nhóm O-H tự do trong phân tử silybin đã biến mất, đồng thời các pic ở 3454,85 và 3131,83 cm- 1 thì có sự dịch chuyển số sóng thành 3397,96 và 3010,34 cm-1 (đỉnh được mở rộng hơn). Bên cạnh đó, pic hấp thụ của nhóm P=O trong phân tử PC cũng có sự dịch chuyển số sóng từ 1243,86 cm-1 thành 1238,08 cm-1. Như vậy, thông qua việc phân tích phổ IR cho thấy có sự dịch chuyển số sóng của nhóm –OH tự do của dược chất, nhóm PO4- của PC. Điều đó cho phép kết luận đã có liên kết mới hình thành giữa các nhóm –OH tự do của dược chất và nhóm PO4- của PC. h.3. Kết quả đánh giá bằng phổ nhiễu xạ tia X Tiến hành quét phổ nhiễu xạ tia X của 4 mẫu: PC, silybin, hỗn hợp vật lý và phức hợp Si-PC. Kết quả thể hiện ở hình 3.22 và phụ lục 4. Hình 3.22. Giản đồ nhiễu xạ tia X của Silybin, PC, hỗn hợp vật lý và phức hợp Si-PC AnhHVQY Mau 2 AnhHVQY Mau 2 - File: AnhHVQY Mau 2.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 2.000 ° - End: 60.000 ° - Step: 0.020 ° - Step time: 1. s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 0 s - 2-Theta: 2.000 ° - Theta: 1.000 ° - Chi: 0.00 ° - Lin (Cp s) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 2-Theta - Scale 2 10 20 30 40 50 60 d=2 2.09 9 d=1 0.85 7 d=7 .195 d=6 .501 d=6 .077 d=5 .845 d=5 .517 d=5 .388 d=5 .073 d=4 .737 d=4 .517 d=4 .306 d=3 .987 d=3 .901 d=3 .762 d=3 .632 d=3 .458 d =3.3 88 d= 3.31 9 d=3 .266 d=3 .156 d=2 .924 d=2 .835 d=2 .768 d=2 .715 d=2 .690 d=2 .579 d=2 .544 d=2 .434 d=2 .331 d=2 .272 d=2 .218 d=2 .192 d=2 .077 d=2 .011 d=1 .987 d=1 .952 d=1 .832 d=1 .775 d=1 .717 d=1 .673 AnhHVQY Mau 2 AnhHVQY Mau 2 - File: AnhHVQY Mau 2.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 2.000 ° - End: 60.000 ° - Step: 0.020 ° - Step time: 1. s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 0 s - 2-Theta: 2.000 ° - Theta: 1.000 ° - Chi: 0.00 ° - Lin (Cp s) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 2-Theta - Scale 2 10 20 30 40 50 60 d=2 2.09 9 d=1 0.85 7 d=7 .195 d=6 .501 d=6 .077 d=5 .845 d=5 .517 d=5 .388 d=5 .073 d=4 .737 d=4 .517 d=4 .306 d=3 .987 d=3 .901 d=3 .762 d=3 .632 d=3 .458 d =3.3 88 d= 3.31 9 d=3 .266 d=3 .156 d=2 .924 d=2 .835 d=2 .768 d=2 .715 d=2 .690 d=2 .579 d=2 .544 d=2 .434 d=2 .331 d=2 .272 d=2 .218 d=2 .192 d=2 .077 d=2 .011 d=1 .987 d=1 .952 d=1 .832 d=1 .775 d=1 .717 d=1 .673 AnhHVQY Mau 2 AnhHVQY Mau 2 - File: AnhHVQY Mau 2.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 2.000 ° - End: 60.000 ° - Step: 0.020 ° - Step time: 1. s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 0 s - 2-Theta: 2.000 ° - Theta: 1.000 ° - Chi: 0.00 ° - Lin (Cp s) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 2-Theta - Scale 2 10 20 30 40 50 60 d=2 2.09 9 d=1 0.85 7 d=7 .195 d=6 .501 d=6 .077 d=5 .845 d=5 .517 d=5 .388 d=5 .073 d=4 .737 d=4 .517 d=4 .306 d=3 .987 d=3 .901 d=3 .762 d=3 .632 d=3 .458 d =3.3 88 d= 3.31 9 d=3 .266 d=3 .156 d=2 .924 d=2 .835 d=2 .768 d=2 .715 d=2 .690 d=2 .579 d=2 .544 d=2 .434 d=2 .331 d=2 .272 d=2 .218 d=2 .192 d=2 .077 d=2 .011 d=1 .987 d=1 .952 d=1 .832 d=1 .775 d=1 .717 d=1 .673 AnhHVQY Mau 2 AnhHVQY Mau 2 - File: AnhHVQY Mau 2.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 2.000 ° - End: 60.000 ° - Step: 0.020 ° - Step time: 1. s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 0 s - 2-Theta: 2.000 ° - Theta: 1.000 ° - Chi: 0.00 ° - Lin (Cp s) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 2-Theta - Scale 2 10 20 30 40 50 60 d=2 2.09 9 d=1 0.85 7 d=7 .195 d=6 .501 d=6 .077 d=5 .845 d=5 .517 d=5 .388 d=5 .073 d=4 .737 d=4 .517 d=4 .306 d=3 .987 d=3 .901 d=3 .762 d=3 .632 d=3 .458 d =3.3 88 d= 3.31 9 d=3 .266 d=3 .156 d=2 .924 d=2 .835 d=2 .768 d=2 .715 d=2 .690 d=2 .579 d=2 .544 d=2 .434 d=2 .331 d=2 .272 d=2 .218 d=2 .192 d=2 .077 d=2 .011 d=1 .987 d=1 .952 d=1 .832 d=1 .775 d=1 .717 d=1 .673 Hỗn hợp vật lý Si,PC Phosphatidyl cholin Silybin AnhHVQY Mau 3 AnhHVQY Mau 3 - File: AnhHVQY Mau 3.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 2.0 0 ° - End: 60.000 ° - Step: 0.020 ° - Step time: 1. s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 0 s - 2-Theta: 2.000 ° - Theta: 1.000 ° - Chi: 0.00 ° - Lin (C ps ) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 2-Theta - Scale 2 10 20 30 40 50 60 d= 4. 43 2 Phức hợp Si-PC M7 AnhHVQY M7 - File: AnhHVQY M7.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 2.000 ° - End: 60.000 ° - Step: 0.020 ° - Step time: 1. s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 0 s - 2-Theta: 2.000 ° - Theta: 1.000 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: Li n (C ps ) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 130 1400 1500 2-Theta - Scale 2 10 20 30 40 50 60 d= 4. 41 2 d= 20 .2 05 d= 11 .2 58 AnhHVQY M8 AnhHVQY M8 - File: AnhHVQY M8.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 2.000 ° - End: 60.000 ° - Step: 0.020 ° - Step time: 1. s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 0 s - 2-Theta: 2.000 ° - Theta: 1.000 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: Li n (C ps ) 0 100 200 300 40 5 0 600 700 800 900 100 11 1 1300 1400 1500 2-Theta - Scale 2 10 20 30 40 50 60 d= 11 .4 43 d= 6. 50 1 d= 6. 05 3 d= 5. 51 1 d= 5. 05 8 d= 4. 51 2 d= 4. 31 7 d= 3. 98 4 d= 3. 63 0 d= 3. 38 5 d= 3. 31 3 d= 3. 26 4 d= 2. 84 2 d= 2. 77 1 d= 2. 70 4 d= 2. 34 8 d= 2. 24 4 d= 2. 20 9 d= 1. 95 4 d= 1. 91 5 d= 1. 87 0 d= 1. 78 7 d= 2. 43 8 99 Phổ XRD của silybin nguyên liệu cho thấy một số đỉnh riêng biệt trong khoảng góc nhiễu xạ 2θ từ 2-30 tại 22,09°; 10,85°; 7,19°; 6,50°; 6,07°; 5,51°; 4,51°; 4,30°; 3,98°; 3,63° chứng tỏ bản chất tinh thể của silybin. Phổ XRD của PC thể hiện các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng tại 4,41°; 11,25° và 20,20°. Trên phổ đồ X-ray của phức hợp Si-PC các đỉnh nhiễu xạ của silybin và SPC đã biến mất. Trong khi đó, trên phổ đồ của hỗn hợp vật lý tương ứng vẫn xuất hiện đỉnh nhiễu xạ của PC (11,25°) và đỉnh nhiễu xạ của silybin (6,50°; 6,07°; 5,51°; 4,51°; 3,98°; 3,63°). Điều này chứng tỏ silybin tồn tại ở dạng vô định hình trong tiểu phân phức hợp. h.4. Kết quả đánh giá bằng phổ NMR * Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR: Tiến hành quét phổ 1H-NMR với 3 mẫu: Silybin, PC, phức hợp Si-PC trong dung môi DMSO. Kết quả được thể hiện trong hình 3.23 và phụ lục 5. Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của (a) Silybin và (b) phức hợp Si-PC (a) (b) 5,52 100 Trên phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) silybin có các peak OH đặc trưng của OH phenol (δ 11,74 (s, OH); 10,53 (brs, OH); 8,77 (s, OH)) và OH alcohol (5,52 (brd, J = 4,0 Hz, OH); 4,66 (brs, OH)). Ngoài peak tại 10,53 ppm là tù, đa số các peak đều khá sắc, nhọn. Phổ 1H-NMR trong phức hợp Si-PC cho thấy: Tín hiệu 10,53 ppm bị mất. Các tín hiệu -OH còn lại đều yếu, thấp và tù hơn khi so sánh với tín hiệu silybin tinh khiết. Điều này là phù hợp về mặt tương tác hóa học khi -OH này không bị chắn bởi các nhóm khác hoặc không có liên kết hydro nội phân tử như OH khác. * Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR: Tiến hành quét phổ 13C-NMR với 3 mẫu: Silybin, PC và phức hợp Si- PC. Kết quả được thể hiện ở hình 3.24 và phụ lục 5. Hình 3.24. Phổ 13C-NMR của (a) PC và (b) phức hợp Si-PC (a) (b) 101 Một số thay đổi có thể nhìn thấy giữa phổ 13C-NMR của phức hợp Si- PC so với PC ở vùng choline gồm: Độ dịch chuyển hóa học (δ) của phức hợp Si-PC so với PC (độ sai khác): N(CH3) 53,096 - 53,078 (+0,018); C2 57,958 – 57,886 (+0,072); C3 62,270 và 62,220 - 62,176 và 62,130 (+0,094/+0,096). Độ dịch chuyển hóa học các nhóm khác có xu hướng dịch về trường mạnh (bên phải) khi so sánh phức hợp Si-PC với cả Si và PC. Carbon 2, 3 ở gần nhóm phosphat của PC bị ảnh hưởng nhiều nhất. * Kết luận: Qua phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR nhận định rằng có sự hình thành liên kết giữa silybin và PC. Tương tác có thể diễn ra mạnh nhất ở -OH (10,53 ppm) của silybin và nhóm phosphat của PC. 3.1.3.3. Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng của phytosome silybin Thông qua kết quả nghiên cứu đánh giá chỉ tiêu phytosome silybin, một số tiêu chuẩn chất lượng được đề xuất như ở bảng 3.35. Bảng 3.35. Dự kiến tiêu chuẩn cơ sở của phytosome silybin Tiêu chuẩn chất lượng Đề xuất tiêu chuẩn Tính chất dạng bột khô tơi, màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vị đắng. Kích thước tiểu phân (nm) Không quá 300nm Hệ số đa phân tán PDI Không quá 0,5 Mất khối lượng do làm khô (%) Không quá 5 % Chỉ số nén CI (%) 16 - 20 Khối lượng riêng biểu kiến (g/ml) Không nhỏ hơn 0,35 Định tính (HPLC) bột phytosome silybin thể hiện peak trùng với peak của silybin chuẩn trên sắc ký đồ. Định lượng (HPLC) - Hàm lượng silybin dạng phytosome trong mẫu không dưới 10,0%. - Hàm lượng silybin toàn phần trong mẫu không dưới 11,0% % Silybin hòa tan sau 60 phút trong dd pH 6,8 ≥ 85% 102 3.1.4. Theo dõi độ ổn định của phytosome silybin Bột phytosome silybin được theo dỗi độ ổn định ở 2 điều kiện: Điều kiện thực trong phòng thí nghiệm và điều kiện lão hóa cấp tốc theo phương pháp được mô tả ở mục 2.2.1.4. a. Độ ổn định về hình dạng tiểu phân Sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thực và lão hóa cấp tốc, hệ tiểu phân phytosome silybin được chụp SEM và TEM. Kết quả được thể hiện ở hình 3.25 Hình 3.25. Hình ảnh chụp SEM, TEM của mẫu bột phytosome silybin sau 6 tháng ở ĐK thường (a) và lão hóa cấp tốc (b) Nhận xét: hệ tiểu phân phytosome silybin vẫn tồn tại ở dạng cấu trúc và hình thái như ban đầu sau thời gian 6 tháng theo dõi độ ổn định. b. Độ ổn định về KTTP, PDI và thế Zeta Tiến hành đo KTTP, PDI và thế Zeta theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.1.3.c-d. Kết quả thể hiện trong bảng 3.36 Bảng 3.36. KTTP, PDI, thế Zeta của bột phytosome silybin sau thời gian bảo quản 3 và 6 tháng ở các điều kiện khác nhau (n=3) Điều kiện Mẻ Chỉ tiêu Thời gian (tháng) 0 3 6 15 - 35°C; RH: 60 - 90% 1 KTTP (nm) 189,5 ± 6,4 189,9 ± 4,7 190,4 ± 5,0 PDI 0,430 ± 0,011 0,432 ± 0,011 0,431 ± 0,014 Zeta (mV) -50,0 ± 1,5 -50,1 ± 1,9 -48,8 ± 1,3 2 KTTP (nm) 188,7 ± 7,9 190,0 ± 8,2 190,7 ± 6,6 PDI 0,443 ± 0,024 0,440 ± 0,039 0,441 ± 0,045 Zeta (mV) -50,9 ± 1,8 -51,1 ± 2,1 -49,1 ± 1,7 3 KTTP (nm) 187,9 ± 8,0 190,1 ± 7,4 189,9 ± 5,4 PDI 0,437 ± 0,021 0,432 ± 0,022 0,443 ± 0,024 Zeta (mV) -51,2 ± 1,6 -51,0 ± 1,4 -50,1 ± 1,2 103 Điều kiện Mẻ Chỉ tiêu Thời gian (tháng) 0 3 6 40 ± 2°C; RH: 75 ± 5% 1 KTTP (nm) 189,5 ± 6,4 191,9 ± 7,5 193,3 ± 7,9 PDI 0,430 ± 0,011 0,432 ± 0,013 0,438 ± 0,014 Zeta (mV) -50,0 ± 1,5 -49,4 ± 1,7 -48,3 ± 2,3 2 KTTP (nm) 188,7 ± 7,9 192,9 ± 6,8 194,6 ± 8,1 PDI 0,443 ± 0,024 0,437 ± 0,040 0,439 ± 0,047 Zeta (mV) -50,9 ± 1,8 -50,8 ± 2,7 -48,8 ± 1,4 3 KTTP (nm) 187,9 ± 8,0 192,4 ± 7,6 195,0 ± 6,1 PDI 0,437 ± 0,021 0,434 ± 0,023 0,443 ± 0,025 Zeta (mV) -51,2 ± 1,6 -50,6 ± 1,7 -49,1 ± 1,8 Kết quả cho thấy KTTP và PDI sau thời gian theo dõi ở 6 tháng thay đổi không đáng kể (p>0,05) và vẫn nằm trong giới hạn cho phép. c. Mất khối lượng do làm khô Tiến hành đánh giá chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.1.3.e. Kết quả thể hiện ở bảng 3.37 Bảng 3.37. Độ ẩm bột phytosome silybin sau thời gian bảo quản 3 và 6 tháng ở các điều kiện khác nhau (n=3) Điều kiện Thời gian (tháng) Mất khối lượng do làm khô (%) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 0 3,47 ± 0,16 3,46 ± 0,16 3,45 ± 0,14 15 - 35°C; RH: 60 - 90% 3 3,49 ± 0,11 3,47 ± 0,13 3,46 ± 0,12 6 3,50 ± 0,14 3,47 ± 0,12 3,47 ± 0,13 40 ± 2°C; RH: 75 ± 5% 3 3,89 ± 0,15 3,87 ± 0,14 3,86 ± 0,16 6 4,13 ± 0,15 4,15 ± 0,13 4,17 ± 0,14 Sau thời gian bảo quản ở điều kiện thực và điều kiện lão hóa cấp tốc, kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cả 3 mẻ vẫn nằm trong giới hạn cho phép. d. Độ ổn định về hàm lượng Tiến hành đánh giá hàm lượng silybin toàn phần và dạng phytosome theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.1.1.a. Kết quả thể hiện trong bảng 3.38 104 Bảng 3.38. Phần trăm hàm lượng silybin trong bột phun sấy so với thời điểm ban đầu sau 6 tháng bảo quản (n=3) Điều kiện Thời gian (tháng) % hàm lượng silybin so với ban đầu Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 0 100 100 100 15 - 35°C; RH: 60 - 90% Silybin dạng phytosome 3 99,75 ± 2,31 99,95 ± 2,21 100,08 ± 2,40 6 99,11 ± 2,04 99,73 ± 2,31 99,09 ± 2,08 Silybin toàn phần 3 99,94 ± 2,97 100,02 ± 2,75 99,93 ± 2,62 6 99,40 ± 2,75 99,65 ± 2,88 99,17 ± 2,50 40 ± 2°C; RH: 75 ± 5% Silybin dạng phytosome 3 99,78 ± 2,01 99,86 ± 2,07 99,98 ± 2,49 6 98,39 ± 2,34 98,91 ± 2,02 99,22 ± 2,05 Silybin toàn phần 3 99,62 ± 2,46 99,47 ± 2,58 99,54 ± 2,09 6 99,13 ± 2,26 98,99 ± 2,15 99,02 ± 2,11 Sau thời gian bảo quản ở điều kiện thực và điều kiện lão hóa cấp tốc, hàm lượng silybin trong bột phun sấy so với ban đầu vẫn đạt yêu cầu. e. Độ ổn định về độ hòa tan Sau 6 tháng bảo quản, tiến hành đánh giá độ hòa tan của mẫu bột phytosome silybin trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 theo phương pháp đã đề cập ở mục 2.2.1.3.h. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.39 Bảng 3.39. Độ hòa tan trong dung dịch pH 6,8 của bột phytosome silybin sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thực và lão hóa cấp tốc (n=3) Điều kiện Thời gian(phút) % silybin hòa tan Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Thực 10 32,04 ± 0,91 30,92 ± 1,29 31,74 ± 1,54 30 66,29 ± 2,57 63,88 ± 1,36 64,74 ± 1,47 60 90,50 ± 2,10 87,75 ± 2,25 89,80 ± 2,87 120 94,61 ± 2,31 92,08 ± 3,22 94,06 ± 3,87 180 96,05 ± 2,92 93,34 ± 3,29 95,38 ± 3,84 LHCT 10 32,66 ± 1,30 30,20 ± 1,14 30,90 ± 1,48 30 65,07 ± 1,75 63,19 ± 3,57 63,92 ± 1