Luận án Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang thuốc

r rồi đem ly tâm và cô quay thu được hệ chất mang nano dendrimer PAMAM-PEG (G2.0-PEG4K, G3.0-PEG4K, G4.0- PEG4K, G5.0-PEG4K; G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K, G5.0-PEG6K; G2.0-PEG10K, G3.0-PEG10K, G4.0-PEG10K, G5.0-PEG10K; G2.0-PEG12K, G3.0-PEG12K, 4.0-PEG12K, G5.0-PEG12K). (a) (b) Hình 2.9. Hình cô quay sản phẩm PAMAM-PEG (a), Sản phẩm PAMAM-PEG (b) 53 Bảng 2.4. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp PAMAM-PEG Lượng và mẫu PAMAM Lượng và mẫu NPC-PEG-TA Tỷ lệ mol PAMAM:NPC- PEG-TA = A : B Sản phẩm G2.0 (0,05g ;0,0154 mmol) NPC-PEG4K-TA (1,0635g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-PEG4K NPC-PEG6K-TA (1,5549g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-PEG6K NPC-PEG10K-TA (2,292g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-PEG10K NPC-PEG12K-TA (3,029g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-PEG12K G3.0 (0,05g ;0,0072 mmol) NPC-PEG4K-TA (1,0024g;0,2316 mmol) 1:32 G3.0-PEG4K NPC-PEG6K-TA (1,4655g;0,2316 mmol) 1:32 G3.0-PEG6K NPC-PEG10K-TA (2,1603g;0,2316 mmol) 1:32 G3.0-PEG10K NPC-PEG12K-TA (2,855g;0,2316 mmol) 1:32 G3.0-PEG12K G4.0 (0,05g ;0,0035 mmol) NPC-PEG4K-TA (0,9744g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-PEG4K NPC-PEG6K-TA (1,4246g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-PEG6K NPC-PEG10K-TA (2,0999g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-PEG10K NPC-PEG12K-TA (2,7753g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-PEG12K G5.0 (0,05g ;0,0017 mmol) NPC-PEG4K-TA (0,961g; 0,222 mmol) 1:128 G5.0-PEG4K NPC-PEG6K-TA (1,405g; 0,222 mmol) 1:128 G5.0-PEG6K NPC-PEG10K-TA (2,0711g; 0,222 mmol) 1:128 G5.0-PEG10K NPC-PEG12K-TA (2,7371g; 0,222 mmol) 1:128 G5.0-PEG12K 54 Hình 2.10. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-PEG (G2.0-PEG4K, G3.0-PEG4K, G4.0-PEG4K, G5.0-PEG4K; G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K, G5.0- PEG6K; G2.0-PEG10K, G3.0-PEG10K, G4.0-PEG10K, G5.0-PEG10K; G2.0- PEG12K, G3.0-PEG12K, 4.0-PEG12K, G5.0-PEG12K) Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC; NPC-PEG-TA và các sản phẩm cuối PAMAM-PEG bằng các phương pháp FTIR, 1H NMR. Hình thái của PAMAM-PEG được khảo sát bằng hình TEM. 55 Khối lượng phân tử của PAMAM-PEG và mức độ biến tính được xác định thông qua phổ 1H-NMR và GPC. Các chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0-PEG4K, G3.0-PEG4K, G4.0- PEG4K, G5.0-PEG4K; G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K, G5.0-PEG6K; G2.0-PEG10K, G3.0-PEG10K, G4.0-PEG10K, G5.0-PEG10K; G2.0-PEG12K, G3.0-PEG12K, 4.0-PEG12K, G5.0-PEG12K được sử dụng để nang hóa thuốc 5- FU. 2.3.3. Biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, và G5.0 bằng các Pluronic P123, F68, F127 và F108. Hệ chất mang nano dendrimer PAMAM-Pluronic cũng được tổng hợp thông qua ba giai đoạn. Giai đoạn 1: Đầu tiên, Pluronic (1,25 mmol) đun nóng chảy trong môi trường khí N2 ở 650C và thêm NPC (3,75 mmol) vào Pluronic nóng chảy. Hỗn hợp được khuấy từ trong 4 giờ tại điều kiện trên. Sau đó, thêm 10 ml THF vào hỗn hợp phản ứng và đưa về nhiệt độ phòng. Kết tủa sản phẩm với diethyl ether. Sản phẩm thu được sau khi cô quay là NPC-Plu-NPC có dạng bột màu trắng [16]. Hình 2.11. Hình phản ứng Pluronic với NPC Giai đoạn 2: Nhỏ từ từ 0,055 mmol trong 1mL DMF và 5 mL THF dung dịch tyramine (TA) vào dung dịch NPC-Plu-NPC (0,05 mmol) và khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Kết tủa sản phẩm trong diethylether, sau đó cô quay thu được NPC-Plu-TA dạng bột màu trắng. 56 (a) (b) Hình 2.12. Phản ứng NPC-Plu-NPC với TA (a), sản phẩm NPC-Plu-TA (b) Giai đoạn 3: Để có được G2.0-Pluronic, G3.0-Pluronic, G4.0-Pluronic, G5.0- Pluronic, nhỏ từ từ hỗn hợp B mmol NPC-Plu-TA /20 mL THF vào dung dịch A mmol PAMAM /20 mL methanol (tỷ lệ mol A : B sẽ thay đổi tùy theo số nhóm bề mặt của mỗi thế hệ PAMAM) và sau đó khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau thời gian này, sản phẩm thô được thẩm tách với methanol trong 3 ngày sử dụng màng MWCO 3000-5000 Da (G2.0-Pluronic), MWCO 6000-8000 Da (G3.0- Pluronic), MWCO 12000-14000 Da (G4.0-Pluronic, G5.0-Pluronic). Sau đó, tiến hành kết tủa dung dịch còn lại trong màng MWCO bằng diethyl ether rồi đem ly tâm và cô quay thu được hệ chất mang nano dendrimer PAMAM-Pluronic (G2.0- P123, G3.0-P123, G4.0-P123, G5.0-P123; G2.0-F68, G3.0-F68, G4.0-F68, G5.0- F68; G2.0-F127, G3.0-F127, G4.0-F127, G5.0-F127; G2.0-F108, G3.0-F108, G4.0- F108, G5.0-F108). (a) (b) (c) Hình 2.13. Phản ứng biến tính PAMAM bằng Pluronic (a), Thẩm tách sản phẩm (b), Sản phẩm PAMAM-Pluronic (c) 57 Bảng 2.5. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp PAMAM-Pluronic Lượng và mẫu PAMAM Lượng và mẫu NPC-Plu-TA Tỷ lệ mol PAMAM:NPC-Plu-TA = A : B Sản phẩm G2.0 (0,05g ;0,0154 mmol) NPC-P123-TA (1,5057g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-P123 NPC-F68-TA (2,1323g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-F68 NPC-F127-TA (3,1765g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-F127 NPC-F108-TA (3,6679g ;0,2457 mmol) 1:16 G2.0-F108 G3.0 (0,05g ;0,0072 mmol) NPC-P123-TA (1,4192g;0,2316mmol) 1:32 G3.0-P123 NPC-F68-TA (2,0097g;0,2316mmol) 1:32 G3.0-F68 NPC-F127-TA (2,994g;0,2316mmol) 1:32 G3.0-F127 NPC-F108-TA (3,4571g;0,2316mmol) 1:32 G3.0-F108 G4.0 (0,05g ;0,0035 mmol) NPC-P123-TA (1,3796g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-P123 NPC-F68-TA (1,9536g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-F68 NPC-F127-TA (2,9103g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-F127 NPC-F108-TA (3,3606g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-F108 G5.0 (0,05g ;0,0017 mmol) NPC-P123-TA (1,3606g ;0,222mmol) 1:128 G5.0-P123 NPC-F68-TA (1,9268g ;0,222mmol) 1:128 G5.0-F68 NPC-F127-TA (2,8704g ;0,222mmol) 1:128 G5.0-F127 NPC-F108-TA (3,3144g ;0,222mmol) 1:128 G5.0-F108 Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC; NPC-Plu-TA và các sản phẩm cuối PAMAM-Pluronic bằng các phương pháp FTIR, 1H NMR. 58 Hình thái của PAMAM-Pluronic được khảo sát bằng hình TEM. Khối lượng phân tử của PAMAM-Pluronic và mức độ biến tính được xác định thông qua phổ 1H-NMR và GPC. Các chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0-Pluronic, G3.0-Pluronic, G4.0- Pluronic, G5.0-Pluronic được sử dụng để nang hóa thuốc 5-FU. Hình 2.14. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-Pluronic (G2.0-P123, G3.0-P123, G4.0- P123, G5.0-P123; G2.0-F68, G3.0-F68, G4.0-F68, G5.0-F68; G2.0-F127, G3.0- F127, G4.0-F127, G5.0-F127; G2.0-F108, G3.0-F108, G4.0-F108, G5.0-F108) 59 2.3.4. Tổng hợp chất mang nano PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol PAMAM G4.0 : F127 khác nhau Để tổng hợp chất mang nano dendrimer PAMAM G4.0-F127 tỷ lệ 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 ta nhỏ từ từ hỗn hợp b mmol NPC-F127-TA /20 mL THF vào dung dịch a mmol PAMAM G4.0 /20 mL methanol với các tỷ lệ a:b lần lượt là 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau thời gian này, sản phẩm thô được lọc với methanol trong 3 ngày sử dụng màng MWCO 12000-14000 Da. Tiến hành kết tủa dung dịch còn lại trong màng MWCO bằng diethylether rồi đem ly tâm và cô quay thu được hệ chất mang dendrimer PAMAM G4.0-F127 (tỷ lệ 1:8, 1:16, 1:32, 1:64). Bảng 2.6. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp PAMAM-F127 với tỷ lệ mol khác nhau Lượng và mẫu PAMAM Lượng và mẫu NPC-F127-TA Tỷ lệ mol PAMAM:NPC-PEG-TA = A : B Sản phẩm G4.0 (0,05g ;0,0035 mmol) NPC-F127-TA (0,3638g ;0,0281 mmol) 1:8 G4.0-F127 NPC-F127-TA (0,7276g ;0,0563 mmol) 1:16 G4.0-F127 NPC-F127-TA (1,4552g ; 0,1126 mmol) 1:32 G4.0-F127 NPC-F127-TA (2,9103g ;0,2251 mmol) 1:64 G4.0-F127 Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm cuối PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản ứng (1:8, 1:16, 1:32, 1:64) bằng các phương pháp FTIR, 1H-NMR. Hình thái của PAMAM G4.0-F127 được khảo sát bằng hình TEM. Khối lượng phân tử của PAMAM G4.0-F127 và mức độ biến tính được xác định thông qua phổ 1H-NMR và GPC. 60 Các chất mang nano dendrimer PAMAM G4.0-F127 được sử dụng để nang hóa thuốc 5-FU. Hình 2.15. Sơ đồ tổng hợp PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản ứng (1:8, 1:16, 1:32, 1:64) 2.3.5. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM- PEG Tiến hành cho 100 mg chất mang nano dendrimer PAMAM-PEG4K ( PAMAM-PEG6K, PAMAM-PEG10K, PAMAM-PEG12K) vào dung dịch 20 mg 5- FU/2 mL nước cất (độ tan trong nước của 5-FU là 12,2 g/L 20 ºC), khuấy từ tại nhiệt độ phòng trong 24 giờ [hình 2.16 và hình 2.17]. Hỗn hợp được cho vào màng lọc MWCO 3500-5000 Da để loại bỏ lượng 5-FU dư. Tiến hành lọc 3 lần, mỗi lần 60 phút trong 500 mL nước cất. HPLC được sử dụng để xác định gián tiếp số lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong vật liệu chất mang nano. Sử dụng phương pháp HPLC để tính toán lượng thuốc 5-FU và kiểm tra cấu trúc dendrimer PAMAM-PEG bằng phương pháp FTIR. 61 Sản phẩm sau khi thẩm tách được đông khô kiểm tra độc tính trên tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm SRB, MTT, FDA/EB và sử dụng nghiên cứu tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro. (a) (b) Hình 2.16. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-PEG (a), Cơ chế mang thuốc trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-PEG (b) Hình 2.17. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-PEG 2.3.6. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM- Pluronic Tiến hành cho 100 mg chất mang dendrimer PAMAM-P123 (PAMAM-F68, PAMAM-F127, PAMAM-F108) vào dung dịch 20 mg 5-FU/2 mL nước cất (độ tan trong nước của 5-FU là 12,2 g/L 20 ºC), khuấy từ tại nhiệt độ phòng trong 24 giờ 62 [hình 2.18 và hình 2.19]. Hỗn hợp được cho vào màng lọc MWCO 3500-5000 Da để loại bỏ lượng 5-FU dư. Tiến hành lọc 3 lần, mỗi lần 60 phút trong 500 mL nước cất. HPLC được sử dụng để xác định gián tiếp số lượng thuốc 5-FU được mang trong vật liệu chất mang nano dendrimer PAMAM-Pluronic. Sản phẩm sau khi thẩm tách được đông khô kiểm tra độc tính trên tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm SRB, MTT, FDA/EB và sử dụng nghiên cứu tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro. (a) (b) Hình 2.18. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-Pluronic (a), Cơ chế nang hóa thuốc trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-Pluronic (b) Hình 2.19. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-Pluronic 63 2.3.7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU in vitro trong đệm PBS Đệm PBS là một dung dịch đẳng trương có pH (7,4) giống với pH trong cơ thể sinh vật, đây là dung dịch điển hình để thẩm tách các chất tương hợp sinh học. Thành phần của đệm này gồm: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 theo tỷ lệ thích hợp. Cân 26,4 mg PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU (có chứa 3 mg 5-FU) hòa tan trong 3ml nước cất. Chia dung dịch trên thành 3 phần bằng nhau cho vào 3 túi thẩm tách MWCO (3000-5000 Da) tiến hành thẩm tách trong 12ml đệm PBS. Để xác định lượng 5-FU được giải phóng ra ta tiến hành lấy mẫu nước thẩm tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 mL trong 1 giờ, 3 giờ, 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung môi thẩm tách bên ngoài màng và thêm vào lượng dung môi tương ứng ban đầu là 12 mL. Nồng độ 5-FU khuếch tán ra ngoài màng thẩm tách được xác định bằng phương pháp đo HPLC. Hình 2.20. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM G4.0-PEG6K 64 2.3.8. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-Pluronic/5-FU in vitro trong đệm PBS Cân 22,67 mg PAMAM G4.0-P123/5-FU (24 mg đối với mẫu PAMAM G4.0- F127/5-FU) có chứa 3 mg 5-FU, hòa tan trong 3ml nước cất. Chia dung dịch trên thành 3 phần bằng nhau cho vào 3 túi thẩm tách MWCO (3000-5000 Da) tiến hành thẩm tách trong 12ml đệm PBS. Để xác định lượng 5-FU được giải phóng ra ta tiến hành lấy mẫu nước thẩm tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 mL trong 1 giờ, 3 giờ, 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung môi thẩm tách bên ngoài màng và thêm vào lượng dung môi tương ứng ban đầu là 12 mL. Nồng độ 5-FU khuếch tán ra ngoài màng thẩm tách được xác định bằng phương pháp đo HPLC. Hình 2.21. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM G4.0-P123 và PAMAM G4.0-F127 65 2.3.9. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro trong đệm PBS Cân 3 mg 5-FU hòa tan trong 3ml nước cất. Chia dung dịch trên thành 3 phần bằng nhau cho vào 3 túi thẩm tách MWCO (3000-5000 Da) tiến hành thẩm tách trong 12ml đệm PBS. Để xác định lượng 5-FU được giải phóng ra ta tiến hành lấy mẫu nước thẩm tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 mL trong 1 giờ, 3 giờ, 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung môi thẩm tách bên ngoài màng và thêm vào lượng dung môi tương ứng ban đầu là 12 mL. Nồng độ 5-FU khuếch tán ra ngoài màng thẩm tách được xác định bằng phương pháp đo HPLC. Hình 2.22. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng 2.3.10. Phương pháp xác định độc tính tế bào của các chất mang nano (1) Xác định độc tính tế bào ung thư MCF-7 bằng phương pháp nhuộm SRB a. Nguyên tắc 66 - Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào. - Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu. b. Chuẩn bị tế bào MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trong môi trường E’MEM có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 μg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100 μg/ml), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37oC, 5% CO2. c. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB Tế bào đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế bào/giếng. Sau 24 giờ nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng độ trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộm với dung dịch Sulforhodamine B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. d. Xử lý kết quả Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm (ký hiệu là OD492 và OD620): - Tính giá trị OD = OD492 - OD620 (1) - Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb - ODblank (2) - Tính tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức: 67 %100)1(%  OD OD C TNI Với: - ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào - ODblank: giá trị OD của giếng blank (không có tế bào) - ODTN: giá trị OD của mẫu thử tình từ công thức (1) và (2) - ODC: giá trị OD của mẫu chứng (control) tình từ công thức (1) và (2) IC50 được xác định như sau: - Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phầm mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ cho tỷ lệ gây độc tế bào 50% bằng cách: o Tính phương trình đường thẳng qua 2 điểm có tỷ lệ gây độc tế bào gần 50% nhất (1 điểm có tỷ lệ gây độc tế bào nhỏ hơn 50%, điểm còn lại có tỷ lệ gây độc tế bào lớn hơn 50%). o Từ phương trình trên (có dạng y = ax + b), thế y = 50 vào, ta suy ra được giá trị nồng độ x chính là IC50. (2) Xác định độc tính nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm MTT a. Nguyên tắc Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Kỹ Thuật Y sinh, trường Đại học Quốc tế - VNU theo phương pháp MTT (Goldbio Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) và tại bước sóng 490 nm và sử dụng máy ELISA b. Chuẩn bị nguyên bào sợi Dòng tế bào thử nghiệm: Nguyên bào sợi được phân lập từ mô mỡ của chuột (L929). Nguyên bào sợi được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, sử dụng môi trường nuôi cấy bao gồm (DMEM : F12 : FBS: Gentamicin) theo tỷ lệ (50 : 50 : 10 : 1). Tế bào sau khi nuôi đến mật độ 80 - 85% diện tích đáy của đĩa nuôi được phân tách 68 bằng Trypsin 1%. Sử dụng thuốc nhuộm Trypan blue và buồng đếm Hemocytometer để tính mật độ tế bào có trong dung dịch. c. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp MTT Dung dịch nguyên bào sợi đã biết nồng độ được cấy vào đĩa 96 giếng chuyên dụng, với mật độ 104 tế bào/giếng trong môi trường đã đề cập ở trên, và được nuôi ở 37oC, hơi nước trên 95% và nồng độ CO2 ở mức 5% trong 24 giờ. Sau đó, 4 loại mẫu thử được pha trong môi trường nuôi cấy với nồng độ 100µg/1mL được thay thế cho môi trường nuôi cấy cũ với liều lượng 200µL/giếng. Các giếng không thay môi trường được xem như mẫu đối chứng. d. Nhuộm MTT 24 và 48 giờ sau khi thay môi trường có chứa thuốc, dung dịch nhuộm MTT (Goldbio Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) được cho vào từng giếng với nồng độ 2µL/giếng và ủ ở 37oC trong 4 giờ. Sau đó cho thêm 20µL DMSO vào từng giếng, tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 tiếng trong điều kiện tránh sáng. Sử dụng máy ELISA để đọc kết quả nhuộm MTT ở bước sóng 590 nm. Quy trình thí nghiệm được lặp lại 4 lần cho mỗi thuốc cũng như mẫu đối chứng. (3) Xác định độc tính nguyên bào sợi bằng phương pháp nhuộm FDA/EB a. Nguyên tắc Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Kỹ Thuật Y sinh, trường Đại học Quốc tế - VNU theo phương pháp nhuộm tế bào sống/chết (live/dead). Kết quả được chụp trên ánh sáng huỳnh quang và bằng kính hiển vi soi ngược quang học ECLIPSE Ti (Nikon Instruments Inc.) sử dụng phần mềm NIS-Elements BR (Nikon Instruments Inc.) b. Chuẩn bị nguyên bào sợi (tương tự như trên) c. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp FDA/EB Dung dịch nguyên bào sợi đã biết nồng độ được cấy vào đĩa 96 giếng chuyên dụng, với mật độ 104 tế bào/giếng trong môi trường đã đề cập ở trên, và được nuôi ở 37oC, hơi nước trên 95% và nồng độ CO2 ở mức 5% trong 24 giờ. Sau đó, 4 loại mẫu thử (G4.0, G4.0-PEG6K, G4.0-F127 và G4.0-F68) được pha trong môi trường 69 nuôi cấy với nồng độ 100µg/1mL được thay thế cho môi trường nuôi cấy cũ với liều lượng 200µL/giếng. Các giếng được thay môi trường không pha thuốc được xem như mẫu đối chứng. d. Nhuộm FDA/EB (sống/chết) FDA (Fluorescein Diacetate) từ dạng bột được pha trong dung môi DMSO với tỷ lệ 1.5mg/mL tạo dung dịch FDA. Bột EB (Ethidium Bromide) được pha trong dung môi PBS 1x với tỷ lệ 1mg/mL để tạo dung dịch EB. Pha dung dịch nhuộm FDA/EB bằng hai dung dịch trên theo tỷ lệ (dd FDA : dd EB : PBS 1x) = (10 : 5 : 3) 24 và 48 giờ sau khi thay môi trường có chứa thuốc, dung dịch nhuộm FDA/EB được cho vào từng giếng với nồng độ 10µL/giếng. Sau thời gian 2-3 phút, tiến hành chụp hình mẫu dưới ánh sáng huỳnh quang. 70 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0 - Các sản phẩm dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G5.0 được tổng hợp từ ethylenediamine (EDA) có dạng dẻo màu vàng nhạt đậm dần từ G-0.5 đến G5.0. Hình 3.1. Cấu trúc dendrimer PAMAM từ EDA đến thế hệ G5.0 3.1.1. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS Phổ khối lượng MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử các polymer. 71 Hình 3.2. Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0 Phổ MS chứng minh sản phẩm từ G-0.5 đến G 2.0 đúng với cấu trúc sản phẩm, phù hợp với lý thuyết (hình 3.2 và bảng 3.1). Bảng 3.1. Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS Thế hệ PAMAM CTPT Lý thuyết MS MLT MMS Hiệu số sai lệch (%) G-0.5 C18H32O8N2 407 405 0,02 G0.0 C22H48O4N10 517 517 0,00 G0.5 C54H96O20N10 1212 1206 0,06 G1.0 C62H128O12N26 1430 1428 0,02 G1.5 C126H224O44N26 2823 2808 0,15 G2.0 C142H288O28N58 3256 3259 0,03 G2.5 C270H480O92N58 6045 * G3.0 C302H608O60N122 6909 * 72 G3.5 C558H992O188N122 12489 * G4.0 C622H1248O124N250 14215 * G5.0 C1262H2528O252N506 28826 * (*: Không xác định được) Tuy MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử, nhưng với các dendrimer có khối lượng phân tử lớn từ G2.5 (M = 6049) trở đi thì MS không xác định được. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của nhóm Schwartz [98] và Hood [46]. Bên cạnh MS, GPC dùng để xác định trọng lượng của hợp chất cao phân tử nhưng với dendrimer PAMAM, ở các phòng thí nghiệm thường gặp nhiều khó khăn để phân tích do hệ dung môi sử dụng cho pha động là hệ đệm với pH cao (pH=11) và cần có loại cột phù hợp. Hơn nửa phân tích thường cho kết quả với độ đa phân tán cao [8, 69, 89]. Cho nên 1H-NMR có thể là phương pháp hiệu quả để theo dõi, đánh giá khối lượng phân tử và độ chuyển hóa của dendrimer [25, 29, 49, 58, 73, 112-113] và đặc biệt là các dendrimer ở thế hệ (G) lớn [47, 69]. 3.1.2. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR Độ dịch chuyển hóa học cho các proton đặc trưng trong dendrimer PAMAM đã được ghi nhận theo nhiều báo cáo trước [38, 88-89, 98, 102, 106, 119, 124]. Trong kết quả phổ 1H-NMR tương ứng với proton điển hình trong cấu trúc dendrimer: -CH2CH2N< (a) tại δH = 2.6 ppm; -CH2CH2CO- (b) tại δH = 2.8-2.9 ppm; -CH2CH2CONH- (c) tại δH = 2.3-2.4 ppm; -CH2CH2NH2 (d) tại δH = 2.7- 2.8 ppm; -CONHCH2CH2N- (e) tại δH = 3.2-3.4 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) tại δH = 2.4-2.5 ppm và -COOCH3 (h) tại δH = 3,7 ppm. Dưới đây là kết quả 1H- NMR của dendrimer PAMAM các thế hệ (hình 3.3). [80] 1H-NMR PAMAM G-0.5: tại δH = 2.497 ppm (a), δH = 2.756-2.784 ppm (b), δH = 2.386-2.454 ppm (g) và δH = 3.628-3.702 ppm (h). 1H-NMR PAMAM G0.0: tại δH = 2.561-2.573 ppm (a), δH = 2.771-2.815 ppm (b), δH = 2.373-2.400 ppm (c), δH = 2.728-2.753 ppm (d) và δH = 3.246-3.336 ppm (e). 73 1H-NMR PAMAM G0.5: tại δH = 2.536-2.560 ppm (a), δH = 2.730-2.783 ppm (b), δH = 2.338-2.394 ppm (c), δH = 3.255-3.312 ppm (e), δH = 2.423-2.496 ppm (g) và δH = 3.631-3.674 ppm (h). 1H-NMR PAMAM G1.0: tại δH = 2.588-2.601 ppm (a), δH = 2.802-2.829 ppm (b), δH = 2.375-2.402 ppm (c), δH = 2.733-2.758 ppm (d) và δH = 3.258- 3.270 ppm (e). 1H-NMR PAMAM G1.5: tại δH = 2.567-2.654 ppm (a), δH = 2.778-2.848 ppm (b), δH = 2.391-2.419 ppm (c), δH = 3.266-3.368 ppm (e), δH = 2.472-2.499 ppm (g) và δH = 3.688 ppm (h). 1H-NMR PAMAM G2.0: tại δH = 2.582-2.608 ppm (a), δH = 2.795-2.822 ppm (b), δH = 2.368-2.394 ppm (c), δH = 2.699-2.741 ppm (d) và δH = 3.250- 3.328 ppm (e). 1H-NMR PAMAM G2.5: tại δH = 2.536-2.631 ppm (a), δH = 2.748-2.858 ppm (b), δH = 2.390-2.417 ppm (c), δH = 3.261-3.331 ppm (e), δH = 2.473-2.499 ppm (g) và δH = 3.683-3.688 ppm (h). 1H-NMR PAMAM G3.0: tại δH = 2.605-2.618 ppm (a), δH = 2.804-2.831 ppm (b), δH = 2.379-2.404 ppm (c), δH = 2.735-2.760 ppm (d) và δH = 3.261-3.334 ppm (e). 1H-NMR PAMAM G3.5: tại δH = 2.570-2.634 ppm (a), δH = 2.780-2.846 ppm (b), δH = 2.393-2.419 ppm (c), δH = 3.268-3.369 ppm (e), δH = 2.475-2.501 ppm (g) và δH = 3.631-3.689 ppm (h). 1H-NMR PAMAM G4.0: tại δH = 2.550 ppm (a), δH = 2.770 ppm (b), δH = 2.352 ppm (c), δH = 2.746-2.758 ppm (d) và δH = 3.225-3.259 ppm (e). 1H-NMR PAMAM G5.0: tại δH = 2.544 ppm (a), δH = 2.849 ppm (b), δH = 2.340 ppm (c), δH = 2.761 ppm (d) và δH = 3.239-3.251 ppm (e). 74 75 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM thế hệ G-0.5 đến G5.0 76 Theo kết quả phổ 1H-NMR, các peak đặc trưng của proton tại vị trí (a) và (e) luôn xuất hiện rõ ràng và không trùng lặp với bất kỳ peak khác, nên hai peak này được chọn sử dụng để tính toán đánh giá dendrimer PAMAM. So sánh tỷ lệ proton ở 2 vị trí (a), (e) trên phân tử dendrimer (LT) và tỷ lệ diện tích peak các proton ở 2 vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ 1H-MNR (NMR) chúng tôi lập được công thức tính khối lượng phân tử dendrimer thông qua phổ 1H-NMR như sau: ( e ) 2 (a ) 2 (e ) 2 (a ) 2 H( C H ) H( C H )NMR (NMR) (LT) (LT) LT ( C H ) ( C H ) S S M .M .M H H               (e ) 2H( C H ) S   , (a ) 2H( C H ) S   : Diện tích peak của các proton ở vị trí (e) và (a) xuất hiện trong phổ 1H-NMR. (e) 2( C H ) H    , (a ) 2( C H ) H    : Tổng số proton ở vị trí (e) và (a) tính trong công thức phân tử dendrimer PAMAM. MLT: Khối lượng phân tử của dendrimer PAMAM theo lý thuyết được tính dựa vào công thức phân tử. Áp dụng công thức trên, khối lượng phân tử (KLPT) các dendrimer PAMAM được tính toán dựa vào phổ 1H-NMR không khác nhiều so với KLPT tính dựa vào công thức phân tử (bảng 3.2). Cụ thể: Tính toán KLPT dendrimer PAMAM G-0.5: sử dụng giá trị diện tích peak của các proton tại vị trí b và a trong phổ 1H-NMR (peak b và a là 8,000 và 4,000; tương ứng NMR = 8,000/4,000=2); tổng số proton tính trong công thức phân tử dendrimer PAMAM G-0.5 (peak b và a là 8 và 4, tương ứng LT =8/4=2