Luận án Nghiên cứu cấu trúc của Ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva Lactuca và Ulva Reticulata - Quách Thị Minh Thu

LỜI CAM ĐOAN .i

LỜI CẢM ƠN.ii

MỤC LỤC .iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . vi

DANH MỤC HÌNH .viii

DANH MỤC BẢNG. x

MỞ ĐẦU . 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN . 3

1.1. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển.3

1.1.1. Phân loài rong biển . 3

1.1.2. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển. 6

1.1.3. Sulfate polysaccharide từ rong biển . 7

1.1.3.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu . 7

1.1.3.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ. 8

1.1.3.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục. 9

1.1.4. Rong lục chi Ulva và ulvan . 12

1.1.4.1. Rong lục chi Ulva. 12

1.1.4.2. Thành phần và cấu trúc hóa học của ulvan. 12

1.1.4.3. Các tính chất hóa lý của ulvan . 16

1.1.4.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan . 18

1.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide .22

1.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC. 22

1.2.2. Phương pháp phổ hồng ngoại IR. 22

1.2.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. 23

1.2.4. Phương pháp phổ khối lượng MS. 27

1.2.5. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS. 28

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến nội

dung nghiên cứu của luận án. .30iv

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước . 30

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới . 32

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM. 38

2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .38

2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong . 39

2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan . 42

2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học. 44

2.2. Xác định cấu trúc của ulvan.47

2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan. 47

2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC). 48

2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) . 48

2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). 48

2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS). 49

2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) . 49

2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) . 49

2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên.49

2.3.1. Sulfate hóa . 49

2.3.2. Acetyl hóa. 50

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 52

3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu.52

3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan. 52

3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan. 53

3.2. Xác định cấu trúc của ulvan.58

3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H) . 58

3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N). 67

3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N). 82

3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H). 92

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh

học của ulvan. 101v

3.3.1. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa . 101

3.3.2. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa . 106

KẾT LUẬN CHUNG. 108

KIẾN NGHỊ. 110

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 111

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 113

PHỤ LỤC . 131

pdf143 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 426 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu cấu trúc của Ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva Lactuca và Ulva Reticulata - Quách Thị Minh Thu, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
hloroform, lắc kỹ. Sau đó thêm 10ml chloroform, tiếp tục lắc kỹ rồi thêm 10ml nước cất, tiếp tục lắc mạnh, lọc bỏ bã. Dịch lọc được ly tâm với tốc độ quay 1000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Dịch sẽ được tách thành hai pha, tách bỏ pha nước, thu pha hữu cơ và cất quay loại dung môi trên máy cất quay chân không ở nhiệt độ 60°C. Quá trình tách chiết được thực hiện 3 lần cho đến khi 41 thu được toàn bộ lượng chất béo thô trong mẫu rong nghiên cứu, làm khô sản phẩm bằng nitơ lỏng, đưa vào bình hút ẩm đến khối lượng không đổi. e) Phân tích tổng carbohydrate Được xác định bằng phương pháp phenol-acid sulfuric [139]. Hỗn hợp gồm 1ml dung dịch mẫu có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml được cho vào ống so màu, thêm 1ml phenol 4,0%, 5,0 ml acid H2SO4 đậm đặc 95,5% (d=1,84g/ml) và lắc mạnh, sau đó để yên 10-20 phút. Sau đó, hỗn hợp được đo mật độ quang tại bước sóng 490 nm. Dung dịch chuẩn được dùng là glucose hoặc galactose. 3.1.2.2. Kết quả về thành phần hóa học của rong Thành phần hóa học chính của rong bao gồm protein, lipid, sulfate, carbohydrate và tro, các thành phần này bị ảnh hưởng rất lớn bởi môi trường nơi rong sinh sống. Kết quả nghiên cứu về thành phần chính của 2 loại rong Ulva reticulata và Ulva lactuca thu hái ở vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa của Việt Nam được tóm tắt trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Thành phần hóa học của rong (% trọng lượng rong khô) Rong lục Protein Lipid Tro Sulfate Carbohydrate Ulva reticulata 9,1 0,5 23,6 4,2 14,2 Ulva lactuca 7,75 0,5 20,7 3,4 6,7 Kết quả phân tích thành phần hóa học của 2 mẫu rong nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein dao động từ 7,75 đến 9,1%, hàm lượng lipid <1% và hàm lượng tro từ 20-24%. So sánh với các tài liệu đã công bố trên thế giới [43, 44] hàm lượng protein có trong rong lục từ 10 đến 47%, hàm lượng tro dao động từ 20 đến 40% và hàm lượng lipit < 4%. Như vậy, rong biển sinh trưởng tại vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa nhìn chung có hàm lượng protein nhỏ hơn, hàm lượng tro và lipit là tương đương so với các nghiên cứu trên. Hàm lượng sulfate và carbohydrate trong 2 mẫu rong nghiên cứu tương ứng là từ 3,4-4,2% và 6,7-14,2%. So sánh với kết quả nghiên cứu trên thế giới thì 2 loài rong lục Ulva reticulata và Ulva lactuca của Việt Nam có hàm lượng sulfate và carbohydrate thấp hơn [12, 13, 140, 141]. Điều đó 42 một lần nữa khẳng định vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng rất ảnh hưởng đến thành phần hóa học của rong. 2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan Trước khi tiến hành chiết ulvan, mẫu rong lục được loại chất màu và các chất hữu cơ có khối lượng phân tử thấp như sau: Dùng lượng ethanol phù hợp cho vào một lượng bột rong lục, khuấy mạnh rồi ngâm ở nhiệt độ phòng qua đêm. Hỗn hợp được lọc để loại dung môi, tiếp tục cho ethanol vào và khuấy mạnh, bước này lặp lại 3 lần. Sấy chân không đến khối lượng không đổi thu được mẫu bột rong dùng để chiết ulvan. Sau khi nghiên cứu tham khảo các quy trình và điều kiện chiết tách ulvan từ rong lục mà các tác giả đã công bố, chúng tôi đã khảo sát và đưa ra các quy trình để chiết tách ulvan từ 2 loại rong lục thu thập được như sau: 2.1.3.1. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi nước: Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400 ml dung dịch nước ở nhiệt độ 80º-90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, ly tâm lấy dịch trong, sau đó, cô quay cho đến khi thể tích còn khoảng 100 ml, thêm tiếp cồn tuyệt đối vào để kết tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C đến khối lượng không đổi thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-N, UL-N [127-129]. 2.1.3.2. Quy trình chiết bằng dung môi acid: Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400 ml dung dịch acid HCl 0,05-0,1N ở nhiệt độ 90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa dịch chiết bằng dung dịch NaOH 0,1N rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể tích còn khoảng 100 ml, thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C đến khối lượng không đổi thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-H, UL-H [96, 131]. 2.1.3.3. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi kiềm: Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400 ml dung dịch kiềm NaOH 0,1N ở nhiệt độ 60ºC, thời gian 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa dịch chiết bằng dung dịch HCl 0,1N 43 rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó, cô quay cho đến khi thể tích còn 100 ml. Thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C đến khối lượng không đổi thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-K, UL-K [13, 47, 49]. Tinh chế ulvan: mẫu ulvan thô được hòa tan trong nước cất và được tiến hành tinh chế bằng màng thẩm tách MWCO 10000 (Da) của hãng Thermo Scientific – USA dưới vòi nước chảy trong 72h để loại các chất thấp phân tử, sau đó kết tủa ulvan bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º, sấy tủa ở 60ºC đến khối lượng không đổi, thu được mẫu ulvan sạch. Sơ đồ tổng quát về quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục được đưa ra ở Hình 2.2. Hình 2.2. Quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục Mẫu bột rong lục khô (20 g) 1. 400 ml dung môi ở 80º-90º trong 2h, 2 lần 2. Lọc bỏ bã 3. Ly tâm loại cặn 4. Trung hòa dung dịch 5. Cất quay giảm thể tích Dịch chiết 1. Bổ sung EtOH 2. Ly tâm lấy tủa Ulvan sạch Ulvan thô 1. Hòa tan trong nước cất 2. Cho qua màng thẩm tách trong 72h 3. Kết tủa bằng EtOH 4. Ly tâm lấy tủa 44 Kết quả về hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan được đưa ra ở Bảng 2.2. Bảng 2.2. Kết quả hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan Mẫu UR-N UR-H UR-K UL-N UL-H UL-K Hiệu suất (%w) 8,3 7,2 5,1 6,5 6,4 4,1 2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học Các phép thử hoạt tính sinh học được thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Phòng Hóa phân tích và triển khai công nghệ - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào Xác định hoạt tính độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm bao gồm: HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và HeLa (ung thư cổ tử cung). Các dòng tế bào được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37ºC, 5% CO2. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks [142]. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: - Chất thử (20 ml) pha trong dimethyl sulfoxide 10% được đưa vào các giếng của khay có 96 giếng để có nồng độ 100 mg/ml; 20 mg/ml; 4 mg/ml; 0,8 mg/ml. - Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. 45 - Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 ml môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3 - 5 ngày. - Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 ml) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng acid trichloracetic – TCA. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37ºC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acid acetic rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. - Cuối cùng, sử dụng 10 mM dung dịch đệm base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Xác định khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: [OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 % sống sót = OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) % ức chế tế bào = 100% - % sống sót - Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 mg/ml; 2 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,08 mg/ml. Giá trị IC50 của Ellipticine luôn ổn định trong khoảng từ 0,25 - 0,56 mg/ml trên tất cả các dòng tế bào ung thư nghiên cứu. Dimethyl sulfoxide 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. 2.1.4.2. Hoạt tính chống đông tụ máu Xác định hoạt tính chống đông tụ máu theo phương pháp của Anderson và CS [143] trên chuột nhắt trắng dòng BALB/c. Hút 10µl mẫu nghiên cứu hoặc 46 dextrose hoặc nước cất vào ống eppendof. Hút 50µl máu chuột vào các ống eppendof đã có mẫu thử hoặc aspirin hoặc dextrose hoặc nước cất. Lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng. Ghi thời gian máu bị đông tụ. Aspirin (Sigma) được sử dụng làm đối chứng tham khảo. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 2.1.4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp khuyếch tán đĩa thạch theo phương pháp của Vanden và CS [144] với 100 µl dịch nuôi cấy có chứa 107 – 108 khuẩn và lượng dịch chiết sử dụng để thử hoạt tính là 200 µl. Chất đối chứng là mẫu trắng (dung môi nước). Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm : Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes (L. mono). Vi khuẩn Gr(+): Bacillus cereus, Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus. Nấm men: Candida albicans. Vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Trypcase Soya Broth (TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn). Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth đối với nấm; Trypcase Soya Broth đối với vi khuẩn. Môi trường thí nghiệm: Eugon broth đối với vi khuẩn và Myco phil đối với nấm. Mẫu ulvan được hoà tan trong dung môi nước với nồng độ 4-10 mg/ml. Chuyển vào mỗi giếng của đĩa vi lượng 96 giếng 10 µl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng. Bổ sung thêm vào mỗi giếng 190 µl vi sinh khuẩn và nấm tương ứng đã hoạt hoá. Để trong tủ ấm 37ºC trong 24h đối với vi khuẩn và 30ºC trong 48h đối với nấm. Tiến hành đồng thời với mẫu trắng. Xác định đường kính vòng vô khuẩn trên các mẫu có hoạt tính. 2.1.4.4. Hoạt tính chống oxy hóa - Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Prieto và CS [145]. Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml, thêm vào 3 ml chất phản ứng (0,6 M acid sulfuric, 28 mM natri phosphate và 4 mM amoni molybdat). Phản ứng được tiến hành tại nhiệt độ 95ºC trong 3h, để nguội đo tại bước sóng 695 nm. Độ hấp thụ của 47 hỗn hợp tăng tại bước sóng 695 nm chỉ ra khả năng oxy hóa tổng của mẫu nghiên cứu. Hoạt tính oxy hóa tổng số tính theo acid ascorbic. - Xác định khả năng khử sắt theo phương pháp Zhu và CS [146]. Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 ml đệm phốt phát pH= 7,2 và 0,2 ml dung dịch kali ferricyanide 1%. Hỗn hợp được giữ ở 50ºC trong 20 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,2 ml CCl3COOH 10%. Sau cùng, lấy 0,125 ml hỗn hợp trên và 0,125 ml nước cất được đặt vào giếng 96 lỗ cùng với 0,02 ml FeCl3. Độ hấp thụ của hỗn hợp tăng tại bước sóng 655 nm chỉ ra khả năng khử sắt của mẫu nghiên cứu. 2.2. Xác định cấu trúc của ulvan 2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan - Xác định hàm lượng sulfate: Xác định hàm lượng sulfate bằng phương pháp khối lượng [147, 148]. Mẫu được thủy phân hoàn toàn bằng dung dịch HCl 1M ở nhiệt độ 100°C trong 8 giờ. Dung dịch BaCl2 1M được thêm dư vào dung dịch thủy phân để tạo kết tủa BaSO4, ly tâm lấy tủa, sấy tủa ở 80ºC đến khối lượng không đổi. Sau đó định lượng BaSO4. Hàm lượng sulfate có trong mẫu được tính theo công thức sau: 100 96 233(%) 4 x m x m DS BaSO  Trong đó DS: hàm lượng sulfate (%); mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g); m: khối lượng mẫu thử nghiệm (g). - Xác định hàm lượng acid uronic: Xác định bằng phương pháp của Bitter và CS [149]. Thủy phân hỗn hợp gồm 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 100 µg/ml và 6 ml H2SO4 đậm đặc ở 100ºC trong 20 phút, sau đó để nguội tới nhiệt độ phòng. Tiếp theo thêm 0,2 ml dung dịch carbazol 0,1% trong ethanol 96º và lắc đều, phản ứng được tiến hành tiếp ở 100ºC trong 10 phút. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 527 nm. Acid glucuronic được dùng làm chất chuẩn. 48 - Xác định thành phần đường: Xác định theo phương pháp của Billan và CS [150]. Nguyên tắc là thủy phân ulvan thành các monosaccharide, chuyển các monosaccharide sang dẫn xuất alditol acetate rồi định lượng bằng GC. + Thủy phân khử từng phần trên hệ NaBH4/TFA Cân 15 mg ulvan vào trong ống nghiệm (có nắp) chứa 1ml TFA 2,0M. Đem đun nóng ống nghiệm ở nhiệt độ 80oC trong 3h. Sau khi để nguội thêm chính xác 1ml dung dịch inositol 1mg/ml, lắc đều. Dung dịch được lọc, loại tủa, rồi thêm 2ml ethanol và cô quay đến cạn. Sau đó thêm 1ml NH4OH 1M để đuổi acid còn dư, sấy khô bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC. Cặn thu được được hoà tan trong 0,5 ml dung dịch NaBH4 10% vừa pha trong NH4OH 1M, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng và để qua đêm. NaBH4 dư được phân huỷ bằng 0,5ml CH3COOH đậm đặc. Tách acid boric và trimethyl borat bằng cách cho bay hơi nhiều lần ở nhiệt độ 40oC với methanol để cặn thu được chỉ còn là alditol. + Phản ứng acetyl hoá các alditol Cho 1ml acid anhydric acetic và 1ml pyridine vào bình có chứa ulvan đã được thuỷ phân ở trên và đem đun nóng ở 100oC trong 1 giờ. Sau đó làm lạnh, bay hơi khô ở nhiệt độ 40oC. Alditol acetat trong hỗn hợp được chiết bằng ethyl acetat. Xác định thành phần đường đơn trên máy sắc kí GC-FID Agilent (Mỹ). 2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Phép đo khối lượng phân tử bằng phương pháp GPC được thực hiện ở Phòng Thí nghiệm Phân tích Trung Tâm – Ðại học Khoa học Tự nhiên - Hồ Chí Minh, trên máy HPLC Agilent 1100 với pha động là dung dịch NaNO3 0,1N, pha tĩnh là cột Ultrahydrogel 500 (300 mm x 7.8 mm ID), tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID. 2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. 2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và được đo phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, trên máy Bruker AVANCE 49 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS (acid 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic) được dùng làm chất chuẩn nội. 2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LTQ Orbitrap XLTM, Thermo SCIENTIFIC kiểu ion hóa âm tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, dung môi MeOH : H2O = 1:1. Khí phun mù là N2 với áp suất khí là 30 psi với tốc độ phun khí 650 lít/giờ tại nhiệt độ là 180ºC. 2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại BL19B2, SPring-8, Hyogo, Nhật Bản. Tia X được phát ở bước sóng  = 0,149 nm. Phép đo kéo dài 600 giây để đảm bảo đủ thời gian đo cần thiết mà mẫu không bị phá hủy bởi tia X. Kết quả được tính toán bằng đồ thị Kratky (q2I(q) vs q) và đồ thị Guinier (ln(qI(q)) vs q2 ). Ở đây, I(q) là cường độ tán xạ và q được định nghĩa bằng (4)sin(với  là bước sóng,  là góc tán xạ. Từ đồ thị Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc có thể xác định được. Giá trị Rgc cho biết cấu trúc không gian của chất đo ở kính thước cỡ nano [151]. Chuẩn bị mẫu đo: Mẫu ulvan nồng độ 1 mg/ml trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M được chuẩn bị cho phép đo SAXS. 2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) Ảnh SEM được chụp trên hệ thiết bị Nova NaNoSEM 450 – FEI tại Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên 2.3.1. Sulfate hóa Dẫn xuất sulfate hóa của ulvan được tổng hợp theo phương pháp của Lihong Fan và CS [152]. Qui trình được tiến hành theo 2 bước như sau: - Bước 1: Tạo tác nhân sulfate hóa: Hòa tan khoảng 5,2g sodium bisul te trong 40 ml nước cất rồi đưa vào bình 3 cổ và lắp vào hệ thống đun hồi lưu cách 50 thủy. Sau đó, ḥòa tan hoàn toàn khoảng 3,16g sodium nitrite trong 10ml nước cất và đưa vào phễu nhỏ giọt, nhỏ từ từ vào bình 3 cổ ở trên, phản ứng được tiến hành với khuấy từ ở 90ºC trong 1,5h. Tác nhân sulfate hóa được tạo thành theo phương trình: 4NaHSO3 + NaNO2  (NaSO3)3N + Na2SO3 + 2H2O - Bước 2: Tổng hợp ulvan sulfate: tác nhân sulfate hóa tạo thành ở trên được điều chỉnh đến pH=9 bằng dung dịch NaOH 0,1M. Tiếp theo hòa tan 1,0 g ulvan UR-N bằng 30 ml nước cất rồi thêm từ từ vào bình cầu 3 cổ ở trên và khuấy mạnh, phản ứng được tiến hành ở 60ºC trong 4h. Sau đó hỗn hợp được cất loại bỏ dung môi, thẩm tách qua màng MWCO 3500 (Da) để làm sạch rồi được thêm ethanol 96° để kết tủa ulvan sulfate, sản phẩm được sấy ở 50ºC đến khối lượng không đổi. Dẫn xuất ulvan sulfate thu được được kí hiệu là UR-S. Xác định hàm lượng sulfate trong mẫu bằng phương pháp khối lượng: 0,5g mẫu UR-S được hòa tan với 10ml nước cất thành dung dịch, sau đó thêm 3ml dung dịch HCl 1M và thủy phân hỗn hợp ở nhiệt độ 100°C trong 8h, thêm tiếp dung dịch BaCl2 1M đến dư để kết tủa lượng sulfate sau khi thủy phân, ly tâm lấy tủa, sấy tủa ở 80ºC đến khối lượng không đổi. Sau đó định lượng BaSO4 và tính được hàm lượng sulfate có trong mẫu theo công thức như ở phần 3.2.1. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. 2.3.2. Acetyl hóa Dẫn xuất acetyl của ulvan tự nhiên được tổng hợp theo phương pháp của Xiao-xiao Liu và CS [153, 154] như sau: 0,5 g UR-N được hòa tan trong bình cầu với 6 ml nước, thêm 6 ml NaOH 1M khuấy mạnh tại nhiệt độ 30ºC trong 30 phút để tạo sodium ulvan, thêm tiếp 4ml dung dịch acid anhydride acetic, tiến hành phản ứng ở 75ºC trong 4 giờ. Hỗn hợp được điều chỉnh về pH = 7,0, cất loại dung môi, thẩm tách qua màng MWCO 3500 (Da) để làm sạch và kết tủa bằng ethanol 96°. Dẫn xuất acetyl của ulvan được kí hiệu là UR-Ac, được sấy khô tại 50ºC đến khối lượng không đổi. Xác định hàm lượng acetyl trong mẫu UR-Ac bằng phương pháp phân tích thể tích theo Luis.A [155] : Theo phương pháp chuẩn độ ngược: 0,5g UR-Ac được hòa tan trong hỗn hợp ethanol (50 ml) /nước (100 ml), lắc đều trong 30 phút ở nhiệt 51 độ 50°C. Thêm tiếp vào 20 ml dung dịch KOH 0,2M và lắc đều. Chuẩn độ lượng KOH dư bằng dung dịch HCl 0,2M với chỉ thị phenolphtalein. Tiến hành tương tự với mẫu trắng UR-N tự nhiên. Hàm lượng acetyl được tính theo công thức 100 43,0.).( (%) 0 x m NVV DA AcUR HClTN    Trong dó: DA: hàm lượng acetyl (%); V0: thể tích mẫu trắng (ml); VTN: thể tích mẫu nghiên cứu (ml); NHCl: nồng độ đương lượng acid HCl; mUR-Ac: khối lượng mẫu thử nghiệm (g). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. 52 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu 3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan Rong lục có thành phần polysacharide rất phức tạp, do vậy mẫu được tiến hành chiết theo 3 quy trình là chiết nước, chiết acid và chiết kiềm như mô tả trong phần thực nghiệm. Kết quả về hiệu suất chiết tách và thành phần hóa học của polysaccharide theo 3 quy trình chiết được đưa ra ở Bảng 3.1. Kết quả cho thấy cả 6 mẫu ulvan đều có thành phần đường chủ yếu là rhamnose và 4 loại đường khác là galactose, xylose, mannose và glucose nhưng với các tỷ lệ khác nhau. Hàm lượng sulfate trong các mẫu ulvan thu được dao động ở khoảng 13-19%, hàm lượng acid uronic rất lớn nằm trong khoảng 18-23% tính theo khối lượng rong khô, trong đó, 2 mẫu ulvan chiết bằng nước cho hàm lượng sulfate cũng như hàm lượng acid uronic là cao nhất và tỷ lệ đường Rha cũng khá cao so với các ulvan chiết bằng acid và kiềm. So sánh với các kết quả phân tích thành phần hóa học của ulvan ở các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, ulvan chiết tách từ 2 loài rong lục của Việt Nam có hàm lượng sulfate thấp hơn còn hàm lượng acid uronic là tương đương [156, 157]. Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của 6 ulvan Ulvan SO3Na (% khối lượng) Acid uronic (% khối lượng) Thành phần monosaccharide ( % mol) Rha Gal Xyl Man Glu UR-N 17,60 22,5 1 0,03 0,06 0,01 0,06 UR-H 14,3 19,3 1 0,1 0,11 0,01 0,21 UR-K 13,2 19,8 1 0,1 0,14 0,03 0,14 UL-N 18,9 21,5 1 0,03 0,07 0,01 0,06 UL-H 15,1 18,7 1 0,01 0,10 0,01 0,06 UL-K 14,2 18,2 1 0,04 0,09 0,01 0,07 53 Như vậy, ta thấy thành phần hóa học của 6 mẫu ulvan là khác nhau tùy thuộc vào quy trình chiết tách chúng. Mục đích nghiên cứu của luận án là nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học. Do vậy, cả 6 mẫu ulvan mà chúng tôi chiết tách được đều được đánh giá hoạt tính sinh học. 3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan 3.1.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Theo các kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học [77, 85] thì dịch chiết từ rong lục có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định rất tốt. Do vậy, chúng tôi thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cả 6 ulvan chiết tách được, kết quả được chỉ ra ở Bảng 3.2. Kết quả cho thấy, trong 6 mẫu ulvan chiết tách từ 2 loài rong lục nghiên cứu, UL-N và UR-N cho kết quả tốt nhất thể hiện dương tính với E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus và Enterobacter cloace, UR-H và UL-H thể hiện hoạt tính tốt với E. coli trong khi UR-K và UL-K không thể hiện hoạt tính đối với các chủng vi khuẩn dùng trong nghiên cứu này. Theo Bảng 3.1, UL-N có hàm lượng sulfate cao nhất, điều này cũng phù hợp với xu hướng của các sulfate polysaccharide là phân tử có hàm lượng sulfate cao thường có hoạt tính sinh học cao. Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 6 mẫu ulvan Vi Khuẩn UR-H UR-N UR-K UL-H UL-N UL-K Đối chứng Gram (-) E. coli ++ ++ - ++ +++ - +++ Pseudomonas aeruginosa - + - - + - +++ Vibrio haveyi - - - - - - +++ Gram (+) Bacillus cereus - - - - ++ - +++ Streptococcus faecalis - - - - - +++ Enterobacter cloace - ++ - + ++ - +++ Staphylococcus aureus - - - - - - +++ Các ký hiệu tính theo đường kính vòng tròn kháng khuẩn: (+++) 14 – 20mm; (++) 12 – 14mm; (+) 8 – 11mm; (-) không ảnh hưởng. 54 3.1.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào Quy trình thử nghiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và HeLa (ung thư cổ tử cung) của cả 6 mẫu ulvan chiết tách được từ 2 loài rong lục nghiên cứu được tiến hành theo như mô tả ở phần thực nghiệm, các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Hóa chất Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng để làm chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10mg/ml; 2mg/ml; 0,4mg/ml; 0,08mg/ml. Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Kết quả thử nghiệm cho thấy, các mẫu chiết kiềm UL-K và UR-K không thể hiện hoạt tính này. Trong khi đó, các mẫu ulvan chiết nước và chiết acid đều thể hiện hoạt tính tốt trên cả 3 dòng tế bào ung thư, cụ thể như sau: UR-H với IC50 = 47,75-50,69 µg/ml; UR-N với IC50 = 31,31-36,37 µg/ml; UL-N với IC50 = 25,09- 36,33 µg/ml và UL-H với IC50 = 40,74-50,93 µg/ml. Kết quả được đưa ra ở Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan UR-H, UR-N, UL-N và UL-H cho thấy, khi tăng nồng độ mẫu thử lên thì phần trăm (%) tế bào sống sót giảm và đạt 0% khi nồng độ ulvan ở 100 µg/ml. 55 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan % tế bào sống sót Nồng độ (µg/ml) UR-H Nồng độ (µg/ml) UR-N Nồng độ (µg/ml) Ellipticine HepG2 HeLa MCF-7 HepG2 HeLa MCF-7 100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 HepG2 HeLa MCF-7 20 42,26 50,30 44,72 20 50,34 36,29 48,74 4 70,18 69,05 76,84 4 84,22 83,05 89,66 10 1,33 3,31 5,93 0,8 83,24 90,44 85,45 0,8 94,90 96,44 95,91 IC50 (µg/ml) 49,10±1,56 47,75±2,37 50,69±1,86 IC50 (µg/ml) 31,31±1,56 34,75±1,38 36,37±1,73 2 29,14 21,87 28,86 Nồng độ (µg/ml) UL-H Nồng độ (µg/ml) UL-N HepG2 HeLa MCF-7 HepG2 HeLa MCF-7 0,4 49,42 48,89 48,58 100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 20 50,21 55,34 48,67 20 60,67 66,24 58,71

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_cau_truc_cua_ulvan_co_hoat_tinh_sinh_hoc.pdf
Tài liệu liên quan