Luận án Nghiên cứu chế tạo vi cảm biến điện hóa trên cơ sở vật liệu lai polyme dẫn – graphen, định hƣớng ứng dụng xác định ion chì (II) và thuốc trừ sâu

khoa học sự sống thuộc viện ITIMS triển khai. Các nghiên cứu sau đó được triển khai nhằm xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong môi trường nước (dựa trên sự ức chế hoạt tính xúc tác của enzym họ cholinesteras hoặc tyrosinas) sử dụng loại cảm biến này. Nhóm Cảm biến sinh học thuộc Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu tập trung phát triển các cảm biến điện hóa ứng dụng trong y sinh, kiểm soát an toàn thực phẩm, xác định dư lượng thuốc trừ sâu và hàm lượng kim loại nặng. Nhóm đã chế tạo cảm biến điện hóa tích hợp sử dụng công nghệ chế tạo vi cơ điện tử (MEMS). Trong đó, hệ vi điện cực gồm 3 điện cực (điện cực làm việc, điện cực đối và điện cực so sánh) được tích hợp trên cùng 1 chíp và sử dụng chuẩn giao tiếp USB 2.0 [114]. Cảm biến điện hóa sử dụng phản ứng enzym hoặc sự bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể cũng đã được nghiên cứu, chế tạo. Các kết quả ban đầu cho thấy khả năng chế tạo - ứng dụng cảm biến điện hóa tích hợp trong lĩnh vực kiểm soát ô nhiễm môi trường (xác định dư lượng thuốc trừ sâu) [115, 116]. Nhóm của Trần Vĩnh Hoàng, Trần Đại Lâm, Nguyễn Tuấn Dung đã công bố chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa xác định thuốc trừ cỏ atrazin dựa trên sự tái phục hồi hoạt tính điện hóa polyme dẫn polyJuglon sau khi kháng thể kéo kháng nguyên atrazin ra khỏi bề mặt 41 điện cực và xác định bằng phương pháp vôn - ampe sóng vuông (hình 1.19) [117]. Hình 1. 19: Mô hình cảm biến atrazin dựa trên sự thay đổi tín hiệu signal-off/signal- on c a màng poly(JUG-HATZ) [117] Gần đây, Nguyễn Văn Chúc và cộng sự đã sử dụng graphen để làm tăng độ nhạy cho cảm biến miễn dịch xác định atrazin [83]. Nguyễn Vân Anh và cộng sự đã sử dụng điện cực enzym AChE trên màng P(1,5-DAN) và PPy để xác định thuốc trừ sâu họ lân hữu cơ là trichlorfon [118]. Methamidophos là hoạt chất bảo vệ thực vật họ lân hữu cơ có độc tính cao và đã bị cấm sử dụng trong các hoạt động nông nghiệp tại Việt Nam. Tuy nhiên, theo báo cáo của Cục bảo vệ thực vệ, methamidophos vẫn được sử dụng một cách tràn lan gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Do vậy, luận án đã lựa chọn methamidophos là đối tượng phân tích bằng cảm biến sinh học điện hóa. 1.4.4. Methamidophos Methamidophos (O,S-Dimethyl phosphoramidothioate) là một loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm chất độc lân hữu cơ, có công thức phân tử C2H8O2NPS (M=141,13g/mol), khối lượng riêng là 1,31g/cm³, nhiệt độ nóng chảy khá thấp là 44,5°C. Ít tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ, dễ phân hủy bởi axit và kiềm, không tồn tại lâu trong môi trường, có hiệu lực diệt sâu nhanh, ức chế enzym Acetylcholinesteras (AChE) bằng phản ứng photphoryl hoá, làm ứ đọng 42 Axetylthiocholin gây rối loạn dẫn truyền Cholinergic dẫn đến chết. Cấu trúc hóa học của methamidophos được biểu diễn trong hình 1.20. Hình 1. 20: Cấu trúc hóa học c a methamidophos Methamidophos là một hoạt chất trong nhóm lân hữu cơ và được tổ chức y tế thế giới xếp vào loại độc tính cấp 1 có khả năng gây nguy hại cho sức khỏe con người và cấm dùng trong nông nghiệp [119]. Methamidophos được hấp thu nhanh qua dạ dày, phổi và da ở người, được thải trừ chủ yếu qua nước tiểu. Nó là một chất ức chế cholinesterase. Methamidophos phân hủy trong đất, trong cát là 6,1 ngày, trong nước tại pH = 5,0 là 309 ngày, tại pH = 7,0 là 27 ngày và tại pH = 9,0 là 3 ngày. Ánh sáng mặt trời làm tăng tốc độ phân hủy của methamidophos. Nó được hấp thu thông qua rễ và lá cây. Ngộ độc methamidophos có thể gây mất trí nhớ, lo lắng, rối loạn tâm thần và theo các nhà khoa học, nó có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh Alzheimer. Theo quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm của Bộ y tế thì lượng methamidophos được đưa vào cơ thể hàng ngày mà không gây ảnh hưởng có hại tới sức khỏe con người là 0,004mg/kg thể trọng. 1.4.5. Giới thiệu enzym, cơ chất và phản ứng enzym – cơ chất 1.4.5.1. Enzym Enzym là chất xúc tác sinh học (biocatalysators) có bản chất là protein hoặc axit nucleic, có trong mọi tế bào sinh vật. Enzym có thể xúc tác đặc hiệu cho mọi phản ứng sinh hóa bên trong và bên ngoài cơ thể sinh vật. Enzym có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hóa học hữu cơ và vô cơ khác. Enzym có tính đặc hiệu cao vì mỗi enzym chỉ xúc tác cho một kiểu phản ứng nhất định tạo thành một hay một số sản phẩm nhất định [40, 120]. Trong các phản ứng này, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzym – cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa và do đó tham gia phản ứng dễ dàng hơn. Mục đích của các nghiên cứu chế tạo cảm biến enzym là lợi dụng tính nhạy cao và đặc hiệu của tương tác enzym – cơ chất cho mục đích phát hiện và định lượng. Đối 43 với cảm biến điện hóa, tương tác giữa enzym và cơ chất phải sinh ra hoặc tiêu thụ các phần tử hoạt động điện. Như vậy, sự phát hiện chất đích được thực hiện theo phản ứng oxi hóa khử các phần tử này ngay trên bề mặt điện cực, tín hiệu điện đo được phải tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất [121]. Enzym là sản phẩm sinh học có giá thành tương đối cao, điều kiện phản ứng thường tối ưu trong dung dịch do vậy enzym bị hòa tan trong dung dịch gây khó thu hồi và giảm độ nhạy của phép đo. Do đó, việc cố định enzym ngày càng được chú trọng nhằm tăng tính ổn định của enzym trong các phản ứng như nhiệt độ, pH... enzym cố định có thể thu hồi sau phản ứng giúp phản ứng thực hiện được liên tục. Một trong những bước tiến quan trọng hiện nay là cố định enzym trên bề mặt màng polyme tạo thành mạng lưới có khả năng phản ứng thuận lợi với cơ chất. Ngày nay, những nghiên cứu về ứng dụng enzym trong sản xuất công nghiệp phát triển rất mạnh. Các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tăng khả năng sử dụng enzym, kéo dài thời gian, số lần sử dụng enzym, giảm giá thành enzym. Enzym AChE là một loại enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân axetylthiocholin và một số cholin este khác có chức năng dẫn truyền thần kinh. Được tạo thành từ 12 lớp xoáy beta kết chặt được bao bọc bởi 14 vòng xoắn ốc anpha. Tâm hoạt động là phần rãnh sâu, kéo dãn ở khoảng giữa của protein. Enzym AChE rất cần thiết trong hoạt động bình thường của hệ thần kinh. Nếu thiếu hoạt động của enzym AChE, axetylthicholin sẽ tích tụ và ngăn sự truyền dẫn đồng bộ của các dây thần kinh, từ đó làm mất sự phối hợp của cơ bắp, gây co giật và dẫn đến tử vong. Hình 1.21 giới thiệu cấu trúc mô phỏng của enzyme AChE. Hình 1. 21: Mô phỏng axetylcholinsteras (AChE) với cấu trúc đơn vị aminoaxit Ser(200), His (440), Glu (327) [122] 44 Enzym AChE bị ức chế, mất hoạt tính bởi thuốc trừ sâu họ lân hữu cơ và cacbamat. Hình 1.22 trình bày cơ chế chuyển hóa methamidophos trong cơ thể sinh vật. Hình 1. 22: Cơ chế chuyển hóa methamidophos trong cơ thể sinh vật [123] Đơn vị đo hoạt độ chế phẩm enzym: Đơn vị IU (International Unit): Một đơn vị IU là hoạt độ của 1 enzym ở điều kiện tiêu chuẩn thích hợp, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một μmol cơ chất trong một phút. 1IU = 1 cơ chất/phút = 10-6mol/60 giây. 1.4.5.2. C chất Các chất tham gia trong phản ứng do enzym xúc tác gọi là cơ chất. Khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong phần trung tâm hoạt động của phân tử enzym thay đổi vị trí không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất. Cơ chất Axetylthiocholin (ATCh) là một trong những tác nhân dẫn truyền thần kinh quan trọng trong hệ thần kinh của động vật có vú. Nó đã được tìm thấy ở tất cả 45 các mối nối thần kinh, ở tất cả các khớp thần kinh trung ương và các cơ quan ngoại vi. ATCh có nhiệm vụ mang tín hiệu từ các tế bào thần kinh tới tế bào cơ. Cấu trúc của ATCh được mô tả qua hình 1.23. Hình 1. 23: Cấu trúc hóa học c a Axetylthiocholin Quá trình thủy phân ATCh [124]: Khi một tế bào thần kinh vận động nhận được tín hiệu từ trung khu thần kinh, nó sẽ tiết ra ATCh đi vào các khớp thần kinh (synap) giữa các tế bào thần kinh vận động và tế bào cơ. Tại đây ATCh kích hoạt các thụ quan trong tế bào cơ, phát động quá trình co cơ. Khi tín hiệu đã được truyền đi thì ATCh cần phải bị phá hủy, nếu không nó sẽ tiếp tục tác động đến các thụ quản của tế bào cơ và tín hiệu sẽ bị chồng lấn lên nhau. AChE có mặt tại các khớp thần kinh (synap) giữa tế bào thần kinh và tế bào cơ, đảm nhận chức năng phá hủy ATCh ngay sau khi tín hiệu được truyền đi. Dưới tác dụng của AChE, ATCh bị thủy phân thành axit axetic và thiocholin. Sau đó thiocholin sẽ được quay vòng để chuyển lại thành ATCh. Như vậy, việc điều tiết AChE đảm bảo cho hoạt động thần kinh diễn ra nhịp nhàng, chính xác [125]. Đối với AChE, kết quả thực nghiệm đã xác nhận sự tạo phức giữa nó và cơ chất. Tâm hoạt động là nhóm bộ ba Ser (200)-His (440)-Glu (327). Phản ứng xảy ra tại một hốc sâu bên trong phân tử AChE. Phân tử cơ chất trước tiên phản ứng với tâm xúc tác (nhóm OH trên Ser (200)) để tách ra cholin, sau đó tâm xúc tác đã bị axetyl hóa sẽ tái tạo lại bằng cách phản ứng với phân tử nước. Nếu quá trình thủy phân ATCh xảy ra mà AChE bị ức chế, ATCh sẽ không được thủy phân và ứ đọng lại trong cơ thể. Kết quả là sự dẫn truyền thần kinh sẽ bị tắc nghẽn dẫn tới việc không ngắt truyền xung tín hiệu. Điều này có thể tạo ra co thắt, tê liệt các hệ cơ trong cơ thể. 46 1.4.5.3. Phản ứng enzym – c chất Acetylcholinesteras (AChE) là enzym có tính đặc hiệu tương đối, AChE có thể xúc tác cho phản ứng thủy phân của axetylthiocholin (ATCh) tạo ra thiocholin và axit axetic như được mô tả ở hình 1.24 [126]. Hình 1. 24: Phản ứng th y phân cơ chất Phản ứng này sẽ sinh ra dòng điện, gây ra sự thay đổi các tín hiệu hoá-sinh, được nhận biết bằng bộ chuyển đổi tín hiệu và sau đó được hiển thị bằng tín hiệu điện ở đầu ra của cảm biến. Tiến hành thí nghiệm với các nồng độ ATCh khác nhau, nồng độ ATCh càng lớn thì tín hiệu điện càng lớn, dòng sinh ra càng cao tỉ lệ tuyến tính với nồng độ cơ chất ATCh. 1.4.5.4. Sự ức chế phản ứng enzym - cơ chất bởi thuốc trừ sâu Các loại thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ nói chung và methamidophos nói riêng có hoạt tính tiêu diệt các loại sâu bệnh hại cây dựa trên sự ức chế enzym AChE hoạt động với chất dẫn truyền xung thần kinh acetylthiocholin (ATCh). Khi tiếp xúc với phân tử methamidophos, hoạt động của enzym AChE bị ức chế khiến nó sản sinh ra ít proton hơn so với bình thường. Sự chênh lệch về lượng proton sẽ được thể hiện qua độ sụt giảm dòng hiển thị trên máy điện hóa, từ đó cho biết hàm lượng của thuốc trừ sâu. Tiến hành thí nghiệm với các nồng độ thuốc trừ sâu khác nhau, nồng độ thuốc trừ sâu càng lớn thì sự chênh lệch về lượng proton càng lớn, dẫn tới sự chênh lệch tín hiệu điện càng lớn, tỉ lệ tuyến tính với nồng độ thuốc trừ sâu. Khi không có mặt của thuốc trừ sâu, AChE gắn s n trên điện cực s n sàng làm xúc tác cho phản ứng thủy phân cơ chất ATCh. Khi có mặt thuốc trừ sâu, các vị trí liên kết trên cảm biến bị vô + Axetylthiocholin Thiocholin Axit axetic + 2H+ +2e- Thiocholin Dithio-bis-cholin S O NMe3 ⊕ Axetylcholine esterase HS ⊕ NMe3 O OH NMe3 ⊕ HS Me3N S S NMe3 ⊕ ⊕ 47 hiệu hóa một phần và làm giảm khả năng thủy phân cơ chất ATCh trên bề mặt điện cực, do đó làm giảm tín hiệu điện hóa. Kết luận: Như vậy, có thể thấy rằng polyme dẫn điện và graphen là những vật liệu tiên tiến có hiệu quả cao trong ứng dụng chế tạo cảm biến điện hóa. Việc nghiên cứu, phát triển và hoàn thiện các kỹ thuật phân tích nhanh chóng với độ chính xác cao độc chất trong môi trường và thực phẩm là một yêu cầu có tính khoa học và thực tiễn cao. Trong nội dung của luận án này đặt mục tiêu phát triển phương pháp điện hóa xác định nhanh ion Pb(II) và dư lượng thuốc trừ sâu methamidophos trên cơ sở vật liệu lai giữa polyme dẫn điện [polyanilin và poly(1,5-diaminonaphtalen) và graphen. Luận án tập trung giải quyết các vấn đề về kỹ thuật chế tạo màng mỏng trên bề mặt điện cực bằng phương pháp điện hóa hướng tới chế tạo cảm biến hóa học và sinh học trong phân tích ion Pb(II) và methamidophos. Ngoài ra, nghiên cứu cung cấp những hiểu biết về các tính chất điện hóa và tương thích sinh học nổi bật của vật liệu lai hướng đến một hệ cảm biến đa năng trong phân tích nhiều đối tượng khác nhau trong môi trường và thực phẩm. Các nội dung nghiên cứu và thảo luận chi tiết sẽ được trình bày dưới đây. 48 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu, hóa chất - Graphen oxit (đường kính 1-5μm, chiều dày 0,8-1,2nm) của ACS Material (Medford, MA, USA). - Monome 1,5-diaminonaphtalen (1,5-DAN) và anilin (ANi) của Merck (Đức). - Axetylthiocholin chloride (ATCh), Acetylcholine esterase (AChE, 1000IU), Methamidophos (O,S-Dimethyl phosphoramidothioate), Glutaraldehit 25% (GA) là sản phẩm thương mại của Sigma-Aldrich. - Tinh thể Pb(NO3)2, axit HClO4 nồng độ 70-72%, CH3COOH, HCl, CH3COONa, H2SO4, KCl đều là hợp chất tinh khiết phân tích của Merck (Đức). - Các hóa chất LiClO4, muối đệm phosphat (PBS) là hợp chất tinh khiết của Sigma Aldrich. 2.2. Phƣơng pháp thực nghiệm 2.2.1. Chế tạo vật liệu lai polyme dẫn – graphen Vật liệu lai polyme dẫn – graphen được chế tạo phủ trên vi điện cực platin (Pt) tích hợp (hình 2.1) chế tạo tại Viện Khoa học vật liệu - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, lớp mỏng Pt được phủ trên phiến Si/SiO2 có sử dụng lớp lót crom để tăng độ bám dính. Hình 2. 1: iện cực Pt tích hợp 49 Điện cực tích hợp gồm điện cực làm việc (Working Electrode - WE) và điện cực đối (Counter Electrode - CE) là màng Pt. Điện cực so sánh (Refrence Electrode - RE) là điện cực Ag, sau đó được clo hóa bằng FeCl3 để tạo thành điện cực giả so sánh Ag/AgCl. Các điện cực có chiều dày khoảng 100nm, đường kính của điện cực làm việc là 1mm, chiều ngang của điện cực đối và điện cực so sánh là 200nm. Quá trình tạo chế tạo màng polyme dẫn – graphen được sơ đồ hóa như sau: Quá trình tổng hợp màng polyme dẫn được thực hiện trên thiết bị đo điện hóa đa năng PGSTAT30 Autolab (Hà Lan) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới. 2.2.1.1. Chế tạo vật liệu lai P(1,5-DAN) – graphen Vật liệu lai P(1,5-DAN) – graphen được chế tạo theo 2 dạng: màng tổ hợp đa lớp (layer-by-layer) và màng nanocomposit. Màng tổ hợp đa lớp (layer-by-layer) Màng mỏng graphen được chế tạo bằng phương pháp lắng đọng pha hơi trên thiết bị CVD của Viện Khoa học vật liệu trên đế Cu với độ dày trên dưới 5nm (khoảng 50 10 lớp). Sau đó, màng graphen được chuyển lên điện cực Pt như được chỉ ra trong hình 2.2 theo các bước sau: i) Nhỏ một lớp mỏng polyme (PMMA) lên bề mặt Gr/Cu, ủ ở nhiệt độ 180oC trong 2 phút: ii) Ngâm mẫu PMMA/Gr/Cu trong dung dịch Fe(NO3)3 để ăn mòn hết đế Cu; iii) Chuyển màng PMMA/Gr phủ lên điện cực Pt, xử lí điện cực PMMA/Gr/Pt trong axeton để làm sạch lớp PMMA phủ bên ngoài. Hình 2. 2: Qui trình chuyển màng graphen từ đế Cu sang điện cực tích hợp [49] Điện cực Pt/Gr sau đó được tiếp tục phủ màng polyme dẫn bằng phương pháp trùng hợp điện hóa theo kỹ thuật vôn – ampe vòng trong dung dịch chứa monome 1,5- DAN 5mM, axit pecloric HClO4 1M. Khoảng thế quét từ -0,02V tới +0,95V, tốc độ quét 50 mV/s. Kết quả thu được màng tổ hợp đa lớp Pt/Gr/P(1,5-DAN). Màng P(1,5-DAN) cũng được tổng hợp đồng thời với cùng điều kiện nhưng trên điện cực Pt để đối chứng. Màng nanocomposit Màng nanocomposit được chế tạo theo phương pháp đồng kết tủa điện hóa và trùng hợp điện hóa in-situ. Graphen Đồng Đồng Graphen Polyme (PMMA) Polyme (PMMA) Graphen Điện cực Polyme (PMMA) Graphen Graphen Điện cực Axeton 51 Ph ng ph p đồng kết tủa điện h a: Phân tán bột graphen oxit (GO) với tỉ lệ 20μg/mL trong dung dịch nước có chứa axit pecloric HClO4 1M bằng máy rung siêu âm trong 30 phút. Thêm monome 1,5-diaminonaphtalen với nồng độ 5mM, rung siêu âm để hòa tan monome trong 30 phút. Tiến hành phân cực điện cực Pt trong hỗn hợp trên theo phương pháp vôn – ampe vòng trong khoảng thế từ -0,02V đến +0,95V, tốc độ quét thế 50mV/s. Màng P(1,5-DAN) thuần, không pha tạp graphen cũng được tổng hợp đồng thời với cùng điều kiện để đối chứng. Ph ng ph p tr ng h p điện h a in-situ: Hòa tan monome 1,5-diamoninaphtalen nồng độ 0,1M trong etanol có HClO4 0,1M. Thêm bột graphen oxit (GO) vào, phân tán bằng máy rung siêu âm trong 30 phút, thu được huyền phù đồng nhất. Nhỏ chính xác 10,0µl dung dịch huyền phù này lên bề mặt điện cực làm việc (điện cực tích hợp Pt), để khô ở 50oC trong vòng 2 giờ. Nhúng điện cực có phủ lớp hỗn hợp GO-monome vào dung dịch điện li HClO4 0,1M, phân cực theo phương pháp vôn – ampe vòng để tiến hành trùng hợp điện hóa. 2.2.1.2. Chế tạo vật liệu lai PANi – graphen Màng tổ hợp đa lớp (layer-by-layer) Màng mỏng graphen được chế tạo bằng phương pháp lắng đọng pha hơi trên thiết bị CVD của Viện Khoa học vật liệu trên đế Cu với độ dày trên dưới 5nm (khoảng 10 lớp). Sau đó, màng graphen được chuyển lên điện cực Pt như mục 2.2.1.1. Điện cực Pt/Gr sau đó được tiếp tục phủ màng polyme dẫn bằng phương pháp trùng hợp điện hóa theo kỹ thuật vôn – ampe vòng trong dung dịch chứa monome ANi 0,05M trong dung dịch H2SO4 0,5M. Khoảng thế quét từ -0,2V tới +0,9V, tốc độ quét 50mV/s. Kết quả thu được màng tổ hợp đa lớp Pt/Gr/PANi. Màng PANi cũng được tổng hợp đồng thời với cùng điều kiện nhưng trên điện cực Pt để đối chứng. 2.2.2. Xác định hàm lƣợng chì Trong luận án này, phương pháp vôn - ampe hòa tan anot theo kỹ thuật sóng vuông (SWASV - square wave anodic stripping voltammetry) được sử dụng trên 52 máy điện hóa đa năng Autolab PGSTAT30 tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới để xác định hàm lượng ion Pb(II) trong nước, dung dịch nền là đệm axetat 0,1M pH = 4,5. Các giai đoạn xác định hàm lượng chì trong dung dịch theo phương pháp vôn – ampe hòa tan gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: điện phân làm giàu Quá trình làm giàu được thực hiện tại thế Eđp = -1,0V, dung dịch được khuấy với tốc độ 300 vòng/phút. Ion chì được làm giàu trên bề mặt điện cực làm việc dưới dạng kết tủa kim loại theo phản ứng sau: Pb 2+ + 2e → Pb Giai đoạn 2 : giai đoạn nghỉ Giai đoạn này rất ngắn, khoảng 10 giây. Trong giai đoạn này ngừng khuấy, thế điện phân giữ nguyên. Mục đích để lượng kim loại đã được điện phân sẽ phân bố đều trên toàn bộ bề mặt điện cực, khi hòa tan sẽ cho dòng hòa tan đều và ổn định. Giai đoạn 3: giai đoạn hòa tan anôt Quá trình hoà tan được bắt đầu khi kết thúc thời gian nghỉ, đây là quá trình hoà tan kết tủa đã được làm giàu trên điện cực làm việc tức xảy ra phản ứng: Pb - 2e → Pb2+ Ghi đường hòa tan anot theo kĩ thuật sóng vuông, thế được quét từ -1,0V tới - 0,2V, tần số 50Hz, biên độ xung 50mV, bước nhảy thế 5mV. 2.2.3. Cố định enzym lên bề mặt điện cực Trong luận án này, enzyme Acetylcholinesteras (AChE) được cố định trên điện cực lai thông qua tác nhân glutarandehit CHO-(CH2)3-CHO (Pentan-1,5-dial) để cố định enzym AChE. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc liên kết chéo đồng hóa trị, kết hợp các phân tử enzym thành cấu trúc đại phân tử không tan nhờ các tác nhân lưỡng cực hoặc đa chức mà không cần chất mang. Quy trình cố định enzym được chỉ ra ở hình 2.3. Hình 2. 3: Sơ đồ quá trình cố định enzym theo phương pháp liên kết chéo 53 Cách tiến hành: Lấy 2μl dung dịch enzym AChE 10IU/μl được pha trong đệm PBS (pH = 7) tiến hành nhỏ phủ lên bề mặt màng cảm biến, ủ trong hơi glutarandehit bão hòa trong 90 phút. Điện cực sau khi cố định AChE được rửa bằng dung dịch đệm PBS 10mM (pH = 7) để loại bỏ glutarandehit dư và các enzym không được cố định. Bảo quản điện cực ở 4 o C. 2.2.4. Thực nghiệm phản ứng cơ chất – enzym Phân tích cơ chất Acetylthiocholine (ATCh) trên điện cực Pt phủ màng lai polyme dẫn – graphen đã cố định enzym AChE, điện áp được đặt vào hệ điện hóa là +0,3V, bình điện phân là 5ml dung dịch PBS (pH = 7), từng lượng dung dịch ATCh được thêm liên tiếp vào bình điện phân sau khi cường độ dòng đạt được giá trị cân bằng. Đồ thị mô tả mối tương quan giữa đáp ứng dòng và thời gian được ghi lại liên tục trên máy. Từ giá trị chênh lệch cường độ dòng với tín hiệu nền (ΔI) ứng với tổng nồng độ cơ chất ATCh được thêm vào hệ điện hóa sẽ xây dựng được đường chuẩn cơ chất. 2.2.5. Xác định hàm lƣợng thuốc trừ sâu methamidophos Quá trình xác định thuốc trừ sâu methamidophos được xác định dựa trên sự ức chế của thuốc trừ sâu lên enzym AChE đã gắn cố định trên bề mặt điện cực. Phản ứng enzym – cơ chất khi có mặt và không có mặt thuốc trừ sâu được khảo sát bằng phương pháp áp thế tại +0,3V. Nồng độ methamidophos được xác định dựa theo độ ức chế tương đối của thuốc trừ sâu (RI) lên enzym [127, 128]. Độ ức chế tương đối (RI) được xác định theo công thức: -1 -12 3 2 1 I -IdI/dt RI= [s ]= s ΔI (I -I ). t    (*) Trong đó, I1: cường độ dòng điện khi chưa nhỏ dung dịch cơ chất, I2: cường độ dòng điện sinh ra sau khi đã nhỏ dung dịch cơ chất, I3:cường độ dòng điện khi có thuốc trừ sâu trong khoảng thời gian quan sát Δt, ΔI là độ sụt dòng khi có sự ức chế của thuốc trừ sâu đối với enzym. Từ đó lập đường chuẩn xác định hàm lượng thuốc trừ sâu. 54 Phương pháp nhận biết thuốc trừ sâu methamidophos được thực hiện bằng phép đo đáp ứng dòng tại thế áp đặt +0,3V. Để thử nghiệm sự ức chế của methamidophos lên enzym AChE trên điện cực, khi cường độ dòng tăng và ổn định sau khi cho cơ chất ATCh, tiến hành thêm methamidophos vào dung dịch và theo dõi sự thay đổi của cường độ dòng theo thời gian. Từ sự thay đổi của cường độ dòng theo thời gian khi thêm cơ chất ATCh và thuốc trừ sâu methamidophos, chúng ta có thể đánh giá được khả năng ứng dụng làm cảm biến thuốc trừ sâu của điện cực chế tạo được. Hình 2.4 giới thiệu qui trình xác định thuốc trừ sâu methamidophos. Hình 2. 4: Quy trình xác định methamidophos: (1)Trong đệm PBS; (2) Thêm cơ chất ATCh; (3) Thêm methamidophos Chi tiết quy trình đo như sau: + Bước 1: Đặt cảm biến vào 5ml dung dịch đệm PBS (pH = 7) và khởi động quá trình đo. + Bước 2: Khi dòng ổn định, đọc cường độ dòng I1, nhỏ 10µl cơ chất ATCh 25mM. + Bước 3: Khi dòng ổn định, đọc cường độ dòng I2, nhỏ dung dịch cần đo. + Bước 4: Khi dòng ổn định, đọc cường độ dòng I3, dừng phép đo. Độ ức chế tương đối được xác định theo công thức (*). Căn cứ vào đường chuẩn của methamidophos, ta sẽ xác định được hàm lượng methamidophos có trong mẫu. Xác định methamidophos trong mẫu rau 55 Cách chuẩn bị mẫu rau: Các mẫu rau không có dư lượng chất methamidophos được mua tại siêu thị. Rau được rửa sạch, cắt nhỏ, để khô và được làm đồng nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu. Sau đó, thêm nước, lắc đều và đem li tâm trong 10 phút với tốc độ 4000 vòng/phút. Sau 10 phút, lấy ra khỏi máy li tâm và chiết phần dung dịch phía trên sang ống mới. Các mẫu chuẩn methamidophos được chuẩn bị với nồng độ xác định trước (1, 5, 10, 20, 50 ppm) trong mẫu rau. Các mẫu này sẽ được phân tích song song bằng máy điện hóa và bằng kỹ thuật sắc ký – khối phổ. Kết quả phân tích sẽ được so sánh để đánh giá độ hoạt động của cảm biến được chế tạo. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi (Fourier Transform Infrared Spectrocopy, viết tắt là FT-IR) là phương pháp cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý : các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại (2.500 – 16.000nm). Sau khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hoá học dao động (làm thay đổi momen lưỡng cực của phân tử) với nhiều tần số dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử. Các thiết phổ hồng ngoại hiện nay được chế tạo theo kiểu biến đổi Fourier, trong đó bộ đơn sắc được thay bằng bộ giao thoa (giao thoa kế) gồm bộ gương cố định, bộ gương di động và bộ phân chia chùm bức xạ. Vì vậy, thiết bị FT-IR có ưu điểm độ nhạy cao, độ chính xác cao, tốc độ đo đạc và xử lí số liệu nhanh chóng. Dựa vào phổ IR có thể nhận biết được các chất, các thành phần hóa học của vật liệu bằng cách xác định nhóm định chức, các liên kết hóa học. Thông thường, người ta đem so sánh phổ IR hấp thụ thu được của vật liệu với các phổ chuẩn trong thư viện phổ hay với phổ của các hợp chất đã biết để giải phổ nhanh chóng và thuyết phục. Trong luận án, các phân tích được thực hiện phổ FT-IR trên thiết bị Nicolet NEXUX 670 tại Viện Kĩ thuật nhiệt đới. 56 2.3.2. Phƣơng pháp phổ tán xạ Raman Phổ Raman là một kỹ thuật quang phổ dựa trên hiện tượng tán xạ ánh sáng đơn sắc, thường là laser trong vùng nhìn thấy, hồng ngoại gần và cực tím gần. Ánh sáng laser đơn sắc với năng lượng hνo kích thích phân tử và biến đổi dao động lưỡng cực của chúng. Trong chùm tia tán xạ, ngoài các t