Luận án Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam

LỜI CAM ĐOAN .i

LỜI CẢM ƠN.ii

MỤC LỤC.iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.vii

DANH MỤC CÁC BẢNG.ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .xi

MỞ ĐẦU.1

Chương 1. TỔNG QUAN.4

1.1. Tổng quan về rong nâu .4

1.1.1. Giới thiệu về rong biển .4

1.1.2. Giới thiệu về Rong Nâu .7

1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới .7

1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam.9

1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu .14

1.1.3.1. Polysaccharide.14

1.1.3.2. Hợp chất phenolic .19

1.1.3.3. Hợp chất carotenoid.21

1.1.3.4. Hợp chất Terpenoid .22

1.1.3.5. Các hợp chát khác.25

1.2. Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan) .26

1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan.26

1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu.26

1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan.28

1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan .29

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan .30

1.2.5.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối .30

1.2.5.2. Hoạt tính chống virus.32

1.2.5.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch.33

1.2.5.4. Hoạt tính chống oxy hóa.35

1.2.5.5. Giảm lipid máu .36iv

1.2.5.6. Kháng viêm .36

1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan .37

1.2.5.8. Hoạt tính kháng khuẩn.37

1.2.5.9. Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu.37

1.2.5.10. Các ứng dụng của fucoidan.38

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội

dung nghiên cứu của luận án .39

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.39

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .44

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .49

2.1. Đối tượng nghiên cứu .49

2.2. Phương pháp nghiên cứu.50

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan.51

2.2.1.1. Phương pháp tách chiết fucoidan .51

2.2.1.2. Phương pháp phân đoạn fucoidan.51

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan .51

2.2.2.1. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .51

2.2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC).53

2.2.2.3. Phương pháp phổ IR .53

2.2.2.4. Phương pháp phổ NMR.54

2.2.2.5. Phương pháp phổ MS.59

2.2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) .64

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học.66

2.2.3.1. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro.66

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế

bào ung thư trên thạch mềm.68

2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu.68

Chương 3. THỰC NGHIỆM.70

3.1. Thu thập và xử lý rong .70

3.2. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu .71

3.3. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan.77v

3.3.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate .77

3.3.2. Xác định thành phần monosaccharide.77

3.3.3. Xác định hàm lượng sulfate.78

3.3.4. Phương pháp khử sulfate.78

3.3.5. Xác định hàm lượng axít uronic.78

3.3.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa .79

3.3.7. Thủy phân tạo oligosaccharide.79

3.3.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) .79

3.3.9. Phổ IR.80

3.3.10. Phổ NMR .80

3.3.11. Phổ ESI-MS/MS .80

3.3.12. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS).80

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học.81

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào .81

3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch

mềm .82

3.4.3. Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu.83

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .85

4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan.85

4.2. Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06

loài rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các

fucoidan thu được.86

4.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S.

binderi và S. duplicatum .90

4.3.1. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi.90

4.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum .92

4.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong

nâu Sargassum aquifolium.96

4.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan.96

4.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan.100

4.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation).100vi

4.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA .101

4.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis).104

4.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion.106

4.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3 .107

4.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4 .111

4.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6 .115

4.4.2.8. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5 .117

4.4.2.9. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M

bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS .117

4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học .124

4.4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào .124

4.4.3.2. Hoạt tính chống khối u in vitro.124

4.4.3.3. Hoạt tính chống đông tụ máu .126

4.5. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân

lập từ rong nâu Turbinaria decurrens.131

4.5.1. Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ

rong nâu Turbinaria decurrens. .131

4.5.2. Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria

decurrens.135

4.5.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M.142

4.6. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong

nâu Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào .144

4.6.1. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương

pháp tán xạ tia X góc nhỏ.144

4.6.2. Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt

tính gây đốc tế bào. .151

KẾT LUẬN.156

KIẾN NGHỊ.159

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .160

TÀI LIỆU THAM KHẢO.162

pdf191 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 420 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ấu trúc không gian kiểu chuỗi xoắn, hình trụ hoặc hình cầu. Bảng 2.5 đưa ra các giá trị khác nhau của  trong cấu trúc của các polymer. Thông số cấu trúc ρ là được xác định theo tỷ số: Ρ = Rg/Rh Bảng 2.5. Thông số  đối với một số dạng cấu trúc polymer Cấu trúc không gian ρ Hình cầu Hình sợi Cấu trúc mạch nhánh Hình trụ 0.788 1.50-1.78 1.78-2.0 >2.0 Trọng lượng phân tử trung bình (Mw), bán kính hồi chuyển (Rg) và hệ số thứ hai của phương trình khí thực nghiệm (A2) được xác định bằng phương trình sau: Trong đó K là hệ số tương phản quang học; c là nồng độ dung dịch polymer; Rθ là hệ số Rayleigh; q là giá trị vector tán xạ dọc; θ là góc tán xạ; n0 là chiết xuất của dung môi; dn/dc là số gia chỉ số khúc xạ của dung dịch; N0 là số Avogadro, và λ0 độ dài bước sóng trong chân không. Bán kính động Rh xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (dynamic light scattering – DLS) được xác định theo phương trình Stokes-Einstein: 66 rong đó: D là hệ số phân bố; k là hằng số Boltzmann; T là nhiệt độ tuyệt đối, η là độ nhớt dung môi [92,99]. 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3.1. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro Hoạt tính gây độc tế bào được thử tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên; Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks và Skehan [100, 101]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: - Chất thử pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml (hoặc ở dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml). Đối với chất tinh khiết thử với dãi nồng độ 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml; 0,04g/ml. - Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. - Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. - Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng axít trichloracetic (TCA). - Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC. Loại 67 màu SRB thừa không gắn với protêin và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng axít axetic 1% rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. - Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: ] ± ϭ % Ức chế = 100% - % CS Trong đó OD: Mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn, được tính theo công thức: σ = Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i x: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL. DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: Trong đó: y: nồng độ chất thử X: Giá trị CS (%) Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  5 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư. 68 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế bào ung thư trên thạch mềm Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm được thử tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp của Kim (2005) và Gao (2002) [102,103]. Kỹ thuật theo dõi sự hình thành khối tế bào là thử nghiệm sự bám dính và hình thành khuẩn lạc trên thạch mềm, đây được coi là kỹ thuật nghiêm ngặt trong kiểm tra sự biến đổi của tế bào. Theo kỹ thuật này, tế bào (đã được xử lý bằng các chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư) được nuôi cấy cùng với chất điều chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong 10-20 ngày. Tiếp theo giai đoạn nuôi cấy này, các khuẩn lạc hình thành được nhuộm rồi phân tích hình thái, hoặc đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên mỗi giếng, thực hiện theo phương pháp của Skehan và cộng sự [104]. Tóm tắt như sau: Tế bào nuôi trong môi trường MEM bổ sung 10% FBS ở 370C trong tủ ấm CO2 (5% CO2). Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy 1 lớp, đạt đến phase Log, tế bào được tách khỏi bình và tách rời nhau bởi trypsin, đếm và hòa lại vào môi trường thạch loãng (0,35 % với thạch mặt và 0,5% với thạch nền) với nồng độ tế bào 3,33 x 100/mL. Trộn mẫu thử với nồng độ đầu 5- 25 µg/mL. Thí nghiệm được tiến hành trên phiến 6 giếng, lặp lại 2-3 lần. Sau 10-20 ngày lấy ra và nhuộm tế bào bằng tím kết tinh 0,005%, đọc kết quả dưới kính hiển vi ngược có gắn camera và nối ra máy tính. Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch được tính lặp lại 3-5 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc [105]. 2.2.3.3. Hoạt tính chống đông tụ máu Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này bị trùng hợp tạo thành mạng lưới giam giữ các thành phần của máu làm máu đông lại. Đông máu và chống đông là một quá trình rất phức tạp, cả hai hiện tượng này cùng xảy ra, song song tiến triển, nhưng cuối cùng là để nhằm cầm máu, hoặc tránh hiện tượng đông máu tràn lan gây tắc nghẽn mạch máu một khi đã hình thành đủ. Quá trình đông máu tự nhiên bao gồm một loạt các phản ứng và đối phản ứng mà ở mỗi giai đoạn, sản phẩm được tạo ra phải nhanh hơn là sự tiêu hủy của nó 69 dẫn đến hiện tượng đông máu. Khi cân bằng giữa hai quá trình trên lệch về một phía thì hoặc sẽ có hiện tượng máu không đông, hoặc hiện tượng máu quá đông. Phép thử hoạt tính chống đông tụ máu được tiến hành trên máu chuột thí nghiệm in vitro, kết quả đánh giá qua quan sát trực quan và kiểm tra trạng thái của máu. 70 Chương 3. THỰC NGHIỆM 3.1. Thu thập và xử lý rong Rong nâu được thu thập tại các vùng biển ở Vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam. Thời gian thu mẫu rong nâu vào tháng 5 năm 2014. Các mẫu rong nâu được phân loại bởi TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang), tất cả các tiêu bản được lưu giữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các loài rong nâu thuộc đối tượng nghiên cứu của luận án có tên khoa học cụ thể như sau: Hai loại rong nâu là đối tượng nghiên cứu chính của luận án: Sargassum aquifolium (Turner) C.Agardh và Turbinaria decurrens Bory. Các loại rong Sargassum polycystum, Sargassum mcclurei, Sargassum oligocystum, Sargassum denticarpum, Sargassum swatzii và Tubinaria ornata, dùng tách chiết fucoidan và nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan. Các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum và Sargassum binderi, là đối tượng nghiên cứu về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của fucoidan. Hình 3.1. Vị trí địa lý nơi thu thập mẫu rong nâu và ảnh rong Sargassum aquifolium 71 Hình 3.2. Rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens Rong nâu được thu hoạch, rửa sạch bằng nước biển để loại bỏ cát, đất, các chất bẩn khác,Sau khi thu hoạch tiếp tục được phơi khô tự nhiên. Mẫu rong sau khi phơi khô được cắt nhỏ trước khi đem tách chiết fucoidan. 3.2. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu Chiết tách fucoidan thực hiện theo phương pháp được sử dụng rất phổ biến trên thế giới hiện nay của Bilan và cộng sự [68]. Mẫu rong khô 200g được xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH:CHCl3:H2O tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với axeton, sấy khô. Sau khi sấy khô bã rong được chiết với 250ml dung dịch CaCl2 2% (5 lần) mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 850C trong 5 giờ. Dịch chiết 5 lần được gom lại, sau đó thêm 80ml dung dịch hexadecyltrimethylammoniumbromide nồng độ 10% trong nước. Tủa tạo thành được li tâm, rửa với nước nhiều lần, sau đó khuấy trộn với 150ml dung dịch NaI 20% trong cồn để ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, ly tâm tách lấy phần tủa (làm như vậy 5 lần), sau đó rửa với cồn và hòa tan lại trong nước. Dung dịch được thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu được fucoidan thô dưới dạng muối Na (Ký hiệu F), hiệu suất chiết tách tính theo trọng lượng rong khô. Phương pháp phân đoạn fucoidan: Fucoidan thô được hòa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần tủa không tan là axít polyuronic (PA), phần dịch trong đưa lên cột DEAE-Sephacel. Đầu tiên rửa cột với dung dịch 0,04N HCl đến khi thử âm tính với cacbonhydrate bằng phương pháp phenol-axit sulfuric [94], tiếp theo rửa cột với gradient nồng độ từ 0-2N NaCl, hoặc rửa giải theo từng nồng độ khác nhau của NaCl: 0N; 0.5N; 1N; 1.5N và 2N, các phân đoạn fucoidan thu được theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl được thẩm tách loại 72 muối bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa trong nước cất với thời gian 48h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột [95]. Qui trình chiết và tách phân đoạn fucoidan theo bản quyền WO 2005/014657 Phương pháp chiết tách fucoidan Mẫu rong nâu được cắt nhỏ 2-3 cm, xử lý loại màu và các hợp chất trọng lượng phân tử thấp với EtOH 85 % theo tỷ lệ w/v = 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Mẫu rong 1 kg sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu được tiến hành chiết với 20 lít dung môi dd axít HCl (pH = 2) ở nhiệt độ 70oC trong thời gian 3h với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc qua vải lọc, sau đó trung hòa với NaHCO3 đến pH = 6-7. Dịch chiết cô quay chân không ở nhiệt độ 60oC sau đó thẩm tách loại muối và các hợp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách trong thời gian 48h theo phương pháp [109]. Chúng tôi tiến hành làm sạch và cô đặc dịch chiết bằng màng siêu lọc kích thước 10 kDa. Dịch chiết sau khi làm sạch ( đã loại nước, loại muối, các hợp chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 8-10 giờ) và cô đặc tới 1/10 thể tích ban đầu, được kết tủa với EtOH 98% theo tỷ lệ Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô sử dụng máy đông khô chân không thu bột polysaccharide dạng thô chứa fucoidan. Phương pháp tách phân đoạn fucoidan Bột polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan, được hòa tan trong dung dịch 0,04 N HCl, ly tâm tách phần không tan là polyuronan. Phần dịch trong cho chạy qua cột DEAE-Cellulose , đầu tiên rửa cột với 0,04 N HCl đến khi thử âm tính với carbonhydrate bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [94], các hợp chất larminaran không bị hấp thụ trên cột sẽ được rửa giải. Tiếp tục rửa giải cột bằng muối NaCl cho gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2 N, các phân đoạn (F1, F2, F3,) được tách ra theo các nồng độ khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu được cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thước 10 kDa trong nước cất sau thời gian 24 giờ, sau đó đem đông khô thu được các fucoidan dạng bột. 73 Hình 3.3. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium 74 Hình 3.4. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens 75 Hình 3.5. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto) 76 Hình 3.6. Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [109] Polysaccharide Muối, KLN, các hợp chất phân tử thấp Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10 kDa Tủa với EtOH 98 % Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô Dịch chiết rong Bã rong Chiết axít HCl pH 2 Rong nâu Rong đã xử lý dung môi Polyphenol, chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp Chiết với (Cồn; Aceton; Chloroform) Tỉ lệ w/v = 1/10, t = 10-15 ngày t = 3 giờ (3 lần) (ở 70oC) Hòa tan trong HCl 0,04 N Ly tâm lấy dịch trong Chạy cột sắc ký DEAE- cellulose Polyuronic axít (PA) Rửa giải với HCl 0,04 N và gradient nồng độ NACl (0-2 N) L F4 F3 F2 F1 0,04N HCl a N NaCl b N NaCl c N NaCl d N NaCl 77 3.3. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan 3.3.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfuric [94], Chuẩn bị dung dịch cacbonhydrate có hàm lượng khoảng 0.1-0.2 µg/µl, lấy 200 µl dung dịch thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút lấy ra để nguội, đo mật độ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Dung dịch chuẩn sử dụng glucose hoặc galactose. 3.3.2. Xác định thành phần monosaccharide Thành phần monosaccharide được xác định bằng phương pháp HPLC. Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic acid) 2M, thủy phân trong 6 giờ ở 100oC sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích hydrat cacbon IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0.6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C- R2 AX. Các đường đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn. Xác định thành phần đường theo phương pháp của Bilan và cộng sự [110]. Nguyên tắc là thủy phân fucoidan thành các monosaccharide, chuyển các monosaccharide sang dẫn xuất alditol acetate rồi định lượng bằng GC–FID. + Thủy phân khử từng phần trên hệ NaBH4/TFA: Cân 15mg fucoidan vào trong ống nghiệm (có nắp) chứa 1ml TFA 2,0M. Đem đun nóng ống nghiệm ở nhiệt Độ 80oC trong 3 giờ, sau khi để nguội thêm chính xác 1ml dung dịch inositol 1mg/ml. Lắc đều đem dung dịch lọc, loại tủa, dung dịch còn lại thêm 2ml ethanol cô quay đến cạn. Sau đó thêm 1ml NH4OH 1M để đuổi axit còn dư sau đó sấy khô bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC. Cặn được hoà tan trong 0,5 ml dung dịch NaBH4 10% vừa pha trong NH4OH 1M, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng để qua đêm. NaBH4 dư được phân huỷ bằng 0,5ml CH3COOH đậm đặc. Tách axít boric và 78 trimethyl borat bằng cách cho bay hơi nhiều lần ở nhiệt độ 40oC với methanol để cặn thu được chỉ còn là alditol. + Phản ứng acetyl hóa các alditol: Cho 1ml anhydric acetic và 1ml pyridine vào bình có chứa fucoidan đã được thuỷ phân ở trên và đem đun nóng ở 100oC trong 1 giờ. Sau đó làm lạnh, bay hơi khô ở nhiệt độ 40oC. Alditol acetat trong hỗn hợp được chiết bằng ethyl acetat. Xác định thành phần đường đơn trên máy sắc kí GC-FID Agilent (Mỹ) HP3. Xác định thành phần monosaccharide bằng phương pháp GLC sau khi đã alditol axetate. Tại Viện Hóa học hữu cơ N.D. Zelinsky, Viện hàn lâm Khoa học Nga, Maxcơva, Liên Bang Nga. 3.3.3. Xác định hàm lượng sulfate Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatine [111]. Cân khoảng 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5ml, thêm 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, thời gian 6 giờ. 3.3.4. Phương pháp khử sulfate Đề sulfate hóa (desulfation) được thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Bilan và cộng sự (2002) [68], 100 ml dung dịch fucoidan (100 mg) được cho qua cột trao đổi ion (dạng H+; CG-120, 200–400 mesh, Serva, Germany). Rửa giải với 200 ml nước cất. Dung dịch sau rửa giải được cô tới gần khô bằng máy cô quay chân không, mẫu sau đó được hòa tan lại trong 20ml dung dịch hỗn hợp [DMSO (19ml) : MeOH (1ml)] thêm vào 0,5ml Pyridin, toàn bộ dung dịch được chuyển sang một ống thủy tinh có nút vặn kín và cho phản ứng ở 100 oC trong thời gian 6h. Hỗn hợp sau phản ứng được thẩm tách trong nước cất bằng màng thẩm tách 10 kDa trong thời gian 48h, hỗn hợp sau thẩm tách được đông khô ta thu được mẫu bột fucoidan đề sulfate. 3.3.5. Xác định hàm lượng uronic acid Hàm lượng uronic acid được xác định sử dụng phương pháp Carbazole [112], sử dụng axít D-glucuronic làm chất chuẩn. Chuẩn bị dãy các chất chuẩn với hàm lượng khác nhau (1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml). Dung dịch fucoidan dùng để phân tích có hàm lượng 1 μg/ml. 79 Lấy 250 μl dung dịch chuẩn mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu cabonhydrate không chứa axít uronic) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 ml dung dịch A, phản ứng được tiến hành ở 100 oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B lắc đều và cho phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 525 nm. 3.3.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa Methyl hóa (methylation) thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Chizhov và cộng sự (1999) [12], 1mg mẫu fucoidan đề sulfate hóa (dSF) được hòa tan trong 1ml DMSO trong một lọ nhỏ có nút vặn ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 10 phút, thêm tiếp vào 100 mg bột NaOH và 0,2ml MeI. Hỗn hợp phản ứng được lắc liên tục trong thời gian 20 phút ở 40 oC, sau đó một lượng tương tự NaOH và MeI được thêm vào. Hỗn hợp tiếp tục được lắc trong thời gian 1h, sau đó làm lạnh và thêm vào 1ml nước. Lượng MeI dư được loại bỏ bằng cô quay chân không, phần dung dịch còn lại được đưa qua cột C18, đầu tiên rửa giải bằng nước cất, tiếp theo được rửa giải với 50% MeOH. Phần dung dịch được rửa giải với MeOH được cho bay hơi trên máy cô quay chân không tới gần khô. Để phân tích GC-MS, mẫu sau khi cho bay hơi được thủy phân với 1ml TFA 4N ở nhiệt độ 100 oC trong thời gian 6h, mẫu sau thủy phân được khử với NaBH4 và Methyl hóa với Ac2O/pyridin. Các methylate alditol acetate riêng phần được phân tích bằng GLC-MS. 3.3.7. Thủy phân tạo oligosaccharide Cân 5mg fucoidan sau đó thêm vào 3ml TFA 0,75 M. Sau đó lắc đều, cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60ºC trong thời gian là 60 phút. Lấy ra để nguội, cô quay chân không cho bay hết TFA, sau đó thêm 2ml metanol vào mẫu rồi cô quay đến hết, làm 3 lần. Mẫu thu được dùng đo phổ MS, NMR. 3.3.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Khối lượng phân tử trung bình của fucoidan xác định bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC). Phép đo GPC được thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent 1100, với cột Shodex SB-806HQ và detector RID (refractive index detector) tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nhiệt độ của cột được giữ ở 60C. Fucoidan 80 nồng độ 1mg/ml. Thể tích mẫu bơm là 0,5ml với tốc độ 1,0ml/phút. Dung dịch NaCl (1mg/ml) được sử dụng làm chất rửa giải. 3.3.9. Phổ IR Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Brucker tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3.3.10. Phổ NMR Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance III 500MHz tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu được pha trong dung môi D2O. DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1- sulfonic acid) được sử dụng làm chất nội chuẩn, đo ở nhiệt độ 70oC với kỹ thuật đo khử tín hiệu nước. Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance 600MHz tại Tại Viện Hóa học hữu cơ N.D. Zelinsky, Viện hàn lâm Khoa học Nga, Maxcơva, Liên Bang Nga. . Mẫu được pha trong dung môi D2O. 3.3.11. Phổ ESI-MS/MS Phổ ESI-MS được ghi trên máy Xevo TQ MS, Waters-USA, kiểu ion hóa âm. Dung môi MeOH : H2O = 1:1. Chế độ ghi mẫu với kiểu ion hoá âm. Khí phun mù là N2 với áp suất khí là 30 psi, tốc độ phun khí 650lít/giờ tại nhiệt độ là 180ºC. 3.3.12. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại BL10C, Photon Factory, Tsukuba, Nhật Bản. Tia X được phát ở bước sóng  = 0,149 nm. Phép đo kéo dài 600 giây để đảm bảo đủ thời gian đo cần thiết mà mẫu không bị phá hủy bởi tia X. Kết quả được tính toán bằng đồ thị Kratky (q2I(q) vs q) và đồ thị Guinier (ln(qI(q)) vs q2 ). Ở đây, I(q) là cường độ tán xạ và q được định nghĩa bằng (4)sin( với  là bước sóng,  là góc tán xạ. Từ đồ thị Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc có thể xác định được. Giá trị Rgc cho biết cấu trúc không gian của chất đo ở kính thước cỡ nano. Mẫu fucoidan nồng độ 1 mg/ml trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M được chuẩn bị cho phép đo SAXS [92,99]. 81 3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào Theo phương pháp của Skehan & cs. (1990) và Likhiwitayawuid & cs. (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Mẫu được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Dòng tế bào (cell lines) Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi) Dòng RD (Human rhabdomyosarcoma – Ung thư mô liên kết) Môi trường và các dụng cụ, hóa chất: Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penicillin- Streptomycin sulfate - Fungizone); NAA (Non- Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum) Trypsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic. Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu týp cho micropipet Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO Tính kết quả: Kết quả được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm. Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức: 82 Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50 Cách tính giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y = a + blnX Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%) 3.4.2. Hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm Hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro được xác định theo phương pháp của Zhao & cs. (1999), Gao & cs. (2002), Gao & cs. (2010), hiện đang được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Dòng tế bào: Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) Phương pháp tiến hành: Kỹ thuật theo dõi sự hình thành khối u là thử nghiệm sự bám dính và hình thành khối u trên thạch mềm, đây được coi là kỹ thuật nghiêm ngặt trong kiểm tra sự biến đổi của tế bào. Theo kỹ thuật này, tế bào (đã được xử lý bằng các chất gây ung t

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_dac_diem_cau_truc_va_hoat_tinh_sinh_hoc_c.pdf
Tài liệu liên quan