Luận án Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi balanophora Balanophora J.R.&G.Forst. ở Việt Nam

mang cụm hoa cái; 2. Cây mang cụm hoa đực; 3. Cụm hoa đực; 4. Cụm hoa cái; 5. Các hoa cái (5b) và vảy bảo vệ (5a); 6,7. Hoa đực đối xứng tỏa tròn; 8,9. Lá; 10. Bề mặt “củ” với các khối đa giác, không có mụn hình sao 74 Hình 3.4. Hình vẽ mẫu Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B. Hansen 1. Cây mang cụm hoa đực, 2. Hoa đực, 3. Các hoa cái và vảy bảo vệ, 4. Cây mang cụm hoa cái Tên Việt Nam: Dó đất sần. Phân bố: Hà Giang (Quản Bạ), Ninh Bình (VQG Cúc Phương), Lâm Đồng (Lạc Dương, VQG Bidoup - Núi Bà). Nước ngoài: Inđônêxia (Java). Tiêu bản mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP/18641/21), Phòng Tài nguyên Thực vật – Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật (IEBR/TNTV-05), Khoa sinh học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024066) và Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam (BFG). 3.1.1.3. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BS Đặc điểm hình thái: Cây đơn tính cùng gốc. Thân thoái hóa thành khối dạng củ; màu nâu vàng, phân nhánh hoặc tập trung thành khối nhỏ, gần hình cầu, đường kính 1,5 - 2,0 cm, bề mặt có mụn hạt và rải rác nốt sần hình sao màu vàng. Cuống cụm hoa hơi đỏ, kích thước 2 - 6 × 0,3 - 0,5 cm. Lá 5-8, xếp xoắn, hình trứng rộng, 0,6 - 1,2 × 0,8 - 1,0 cm, đỉnh tù, hơi lõm. Hoa đực và hoa cái tập trung với nhau thành dạng bông nạc hình elip, kích thước 0,8 - 2 × 0,5 - 0,8 cm. Hoa đực mọc ở phần gốc của cụm hoa, đối xứng tỏa tròn, đối diện với bẹ hoa có hình 75 dạng khác nhau; cuống hoa ngắn, đường kính 0,8 mm; thùy thường 4, hình elip đến hình trứng rộng, đỉnh nhọn hoặc cắt cụt, kích thước nhỏ hơn 1,5 mm. Hoa cái mọc ở gốc vảy bảo vệ và trên trục chính cụm hoa (Hình 3.3). Hình 3.5. Hình thái mẫu BS (Balanophora subcupularis P.C. Tam) 1. Toàn cây, 2. Bề mặt củ, 3. Cụm hoa lưỡng tính; 4. Hoa đực; 5. Các hoa cái (5b) và vảy bảo vệ (5a) ; 6. Cuống cụm hoa mang lá Hình 3.6. Hình vẽ mẫu Balanophora subcupularis P.C.Tam 1. Toàn cây, 2. Các hoa đực, 3. Các hoa cái và vảy bảo vệ 76 Dựa trên đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa phân loại chi Balanophora trong Thực vật chí Trung Quốc, tên khoa học mẫu ký hiệu BS được giám định là Balanophora subcupularis P.C.Tam, 1982, Fl. Fujianica 1:602. Đây là loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam. Phân bố: Hà Giang (Quản Bạ), Điện Biên (Mường Lay), Lạc Dương (Lâm Đồng). Nước ngoài: Trung Quốc (Phúc Kiến), Nhật Bản (Kumamoto). Tiêu bản mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP/18638/21), Phòng Tài nguyên Thực vật – Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật (IEBR/TNTV-03), Khoa sinh học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024068). 3.1.1.4. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BT Đặc điểm hình thái: Cây đơn tính cùng gốc, màu vàng nhạt đến đỏ sẫm. Thân thoái hóa thành khối dạng củ, phân nhánh, bề mặt sần sùi; nhánh phụ đường kính 1,0-2,0 cm. Lá 4-8, dạng vảy, hình thuôn dài tới hình trứng thuôn, đỉnh tù, màu vàng nhạt, kích thước 1-6 x 0,5-0,7 cm. Hoa đực và hoa cái tập trung trên cùng cụm hoa dạng bông nạc, hình trứng thuôn dài đến hình trứng, tù, che phủ dày đặc bởi các hoa cái và vảy bảo vệ. Hoa đực nằm rải rác giữa hoa cái và vảy bảo vệ, có cuống nhỏ; thùy hoa đực 3, hình trứng, kích thước < 1,5 mm; bao phấn 3, mở ngang. Hoa cái có màu vàng nhạt hoặc hơi đỏ, nằm trên trục chính của hoa. (Hình 3.7) Dựa trên đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa phân loại chi Balanophora trong Thực vật chí Trung Quốc, tên khoa học mẫu BT được xác định là Balanophora tobiracola Makino, 1910, Bot. Mag. (Tokyo) 24: 290, tên đồng nghĩa: Balanophora wrightii Makino, Balanophora harlandii var. spiralis P.C.Tam. Đây là loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam. Phân bố: Lạng Sơn (Bắc Sơn). Nước ngoài: Trung Quốc, Nhật Bản. Tiêu bản mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP/18640/21), Phòng Tài nguyên Thực vật – Viện sinh thái và 77 tài nguyên sinh vật (IEBR/TNTV-07), Khoa sinh học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024068). Hình 3.7. Hình thái mẫu BT (Balanophora tobiracola Makino) 1,2. Toàn cây mang cụm hoa lưỡng tính (2a); 3. Hoa đực mọc chen giữa các hoa cái và vảy bảo vệ; 4. Hoa đực; 5. Các hoa cái (5b, 5d) và vảy bảo vệ (5a, 5c);6. Cuống cụm hoa mang lá; 7. Lá Hình 3.8. Hình vẽ mẫu Balanophora tobiracola Makino 1. Toàn cây; 2,3,4. Hoa đực; 5. Các hoa cái và vảy bảo vệ 78 3.1.2. Kết quả nghiên cứu về hình thái hạt phấn các loài nghiên cứu Kết quả quan sát cho thấy hạt phấn của các mẫu nghiên cứu đều có dạng hạt nhỏ (Hình 3.9). Dữ liệu về hình dạng và kích thước hạt phấn của các mẫu nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.1. Hình 3.9. Hình thái hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora BFI: B. fungosa subsp. indica (a: VT cực, b: VT xích đạo), BFG: B. fungosa var. globosa (a: VT cực, b: VT xích đạo), BS: B. subcupularis (a: VT cực, b: VT xích đạo), BT: B. tobiracola Bảng 3.1. Dữ liệu về hạt phấn các mẫu nghiên cứu Mẫu E (µm)* P(µm)** P/E Min TB Max Min TB Max BFI (B. fungosa subsp. indica) 17,99 19,58 20,62 11,21 14,8 17,53 0,76 79 Từ bảng kết quả, có thể thấy hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora đều có kích thước nhỏ (10 – 25 µm). Hình dạng hạt phấn có sự khác nhau giữa các loài trong chi, được mô tả qua hình ảnh chụp từ vị trí cực và vị trí xích đạo (Hình 3.8). Trong đó hạt phấn các loài B. fungosa subsp. indica, B. fungosa var. globosa, B. subcupularis có phân biệt rõ mặt phẳng cực và mặt phẳng xích đạo. Hạt phấn của loài B. fungosa subsp. indica, B. fungosa var. globosa khi nhìn từ vị trí cực có hình tam giác trong khi nhìn từ vị trí xích đạo có hình cầu-dẹt (0,74 < P/E < 0,88). Hạt phấn loài B. subcupularis ở vị trí cực có hình tam giác lồi, ở vị trí xích đạo có dạng dài (1,14 < P/E < 1,3). Trong khi đó hạt phấn của loài B. tobiracola không phân biệt mặt phẳng cực và mặt phẳng xích đạo, hạt phấn có hình cầu. 3.1.3. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hiển vi các loài nghiên cứu 3.1.3.1. Đặc điểm vi phẫu củ các loài nghiên cứu a, Vi phẫu “củ” mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) Củ có cấu tạo gồm: 1-3 hàng tế bào kiểu biểu bì, có kích thước to nhỏ khác nhau. Phía trong là mô mềm có hình đa giác, bên trong chứa các khối nhựa. Các bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm. Mỗi bó libe-gỗ có cấu tạo gồm gỗ ở phía trong được bao bởi libe, ngoài cùng là các lớp tế bào mô mềm bao quanh libe-gỗ có kích thước nhỏ hơn taọ thành một vòng rõ. (Hình 3.10) b, Vi phẫu “củ” mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa) BFG (B. fungosa var. globosa) 16,94 19,70 22,33 15,39 16,24 17,58 0,82 BS (B. subcupularis) 13,02 13,81 15,23 15,15 16,05 17,84 1,16 BT (B. tobiracola) 19,37 20,72 22,13 *E: kích thước trục xích đạo hoặc đường kính lớn nhất **P: kích thước trục cực Min: kích thước nhỏ nhất, Max: kích thước lớn nhất, TB: kích thước trung bình 80 Củ có cấu tạo đơn giản với 4-6 hàng tế bào kiểu biểu bì ở bên ngoài. Các tế bào kiểu biểu bì có thành phía ngoài hơi dày lên. Các tế bào mô mềm xếp sít nhau, bên trong có các khối nhựa hình tròn. Bó libe-gỗ được sắp xếp thành một vòng tròn trong mô mềm. Mỗi bó có libe bên ngoài, bên trong là gỗ và các tế bào mô mềm trung tâm. Các tế bào xung quanh bó libe-gỗ với kích thước nhỏ hơn, bắt màu xanh và tạo ra một ranh rới rõ ràng. (Hình 3.11) Hình 3.10. Vi phẫu “củ” mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Gỗ, 5. Libe, 6. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ Hình 3.11. Vi phẫu “củ” mẫu BFG (B. fungosa var. globosa) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Gỗ, 5. Libe, 6. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ c, Vi phẫu “củ” mẫu BS (Balanophora subcupularis) Củ có cấu tạo đơn giản, ngoài cùng là 3-5 hàng tế bào kiểu biểu bì (1). Phía trong mô mềm (2) chiếm chủ yếu, rải rác có các bó libe-gỗ. Các tế bào kiểu biểu bì có thành hơi dày lên. Tế bào mô mềm hình đa giác. Trong mô mềm, có thể có các khối nhựa (3). Các bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm. Trong mỗi bó, libe (6) ở phía ngoài bao quanh gỗ (5) ở phía trong. Các tế bào mô mềm bao quanh bó libe-gỗ (4) bắt màu xanh, tạo thành một vòng rõ. (Hình 3.12) d, Vi phẫu “củ” mẫu BT (Balanophora tobiracola) 81 Củ có cấu tạo đơn giản, ngoài cùng là 1-3 hàng tế bào kiểu biểu bì. Phía trong mô mềm chiếm chủ yếu, rải rác có các bó libe-gỗ. Các tế bào kiểu biểu bì có thành hơi dày lên. Tế bào mô mềm hơi dài. Trong mô mềm, có thể có các khối nhựa. Các bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm, đôi khi tập trung lại gần nhau. Trong mỗi bó, libe ở phía ngoài bao quanh gỗ ở phía trong. Các tế bào mô mềm bao quanh bó libe-gỗ bắt màu xanh, tạo thành một vòng rõ. (Hình 3.13) Hình 3.12. Vi phẫu “củ” mẫu BS (B. subcupularis) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ, 5. Gỗ, 6. Libe Hình 3.13. Vi phẫu “củ” mẫu BT (B. tobiracola) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ, 5. Gỗ, 6. Libe 3.1.3.2. Đặc điểm vi phẫu lá các loài nghiên cứu a, Vi phẫu lá mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì có hình dạng, kích thước không đều, xếp sít nhau, phía ngoài phủ cutin. Phía trong mô mềm chiếm chủ yếu, có các bó libe-gỗ nhỏ nằm rải rác. Trong mỗi bó, gỗ ở phía trong được bao quanh bởi libe. (Hình 3.14) 82 b, Vi phẫu lá mẫu BFG (B. fungosa var. globosa) Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì. Các tế bào mô mềm có kích thước không đều, trong mô mềm có thể quan sát thấy các khối nhựa hình tròn. Các bó libe-gỗ nhỏ nằm rải rác. Mỗi bó libe-gỗ có cấu tạo gồm các libe phía ngoài bao quanh gỗ phía trong. (Hình 3.15) c, Vi phẫu lá mẫu BS (B. subcupularis) Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì phía ngoài phủ cutin. Phía trong mô mềm chiếm chủ yếu, kích thước không đều. Rải rác có các bó libe-gỗ nhỏ. Các khối nhựa hình tròn rải rác trong mô mềm. (Hình 3.16) d, Vi phẫu lá mẫu BT (B. tobiracola) Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì kích thước không đều, phía ngoài phủ cutin. Phía trong mô mềm chiếm chủ yếu, các tế bào mô mềm thành mỏng. Rải rác có các bó libe-gỗ nhỏ. (Hình 3.17) Hình 3.14. Vi phẫu lá mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 1. Biểu bì trên, 2. Mô mềm, 3. Gỗ, 4. Libe, 5. Biểu bì dưới Hình 3.15. Vi phẫu lá mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa) 1. Biểu bì trên, 2. Gỗ, 3. Libe, 4. Mô mềm; 5. Khối nhựa, 6. Biểu bì dưới 83 Hình 3.16. Vi phẫu lá mẫu BS (B. subcupularis) 1.Biểu bì trên, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Libe-gỗ, 5. Biểu bì dưới Hình 3.17. Vi phẫu lá mẫu BT (B. tobiracola) 1.Biểu bì trên, 2. Mô mềm, 3. Libe-gỗ, 4. Biểu bì dưới 3.1.3.3. Đặc điểm bột các loài nghiên cứu a, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica): Bột màu vàng nâu, mùi đặc trưng, vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Mảnh tế bào kiểu biểu bì (1); các mảnh mô mềm chứa khối nhựa (2, 3); tế bào cứng (4); mảnh mang màu (5). Vảy bảo vệ (6). Vòi nhụy thuôn dài (7). Rải rác có hạt phấn (8). (Hình 3.18) Hình 3.18. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 1. Mảnh biểu bì; 2,3. Mảnh mô mềm; 4. Tế bào cứng ; 5.Mảnh mang màu; 6. Vảy bảo vệ; 7. Vòi nhụy; 8. Hạt phấn hoa 84 b, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BFG (B. fungosa var. globosa): Bột màu nâu, mùi đặc trưng, vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Các mảnh mô mềm tế bào thành mỏng (1), đôi khi mang mảnh mạch (3). Rải rác có các tế bào cứng (2), tinh thể canxi oxalat hình khối (4). Sợi dài, đơn lẻ (5). Mảnh vảy bảo vệ màu nâu đỏ (6). Nhụy dài (7). Có thể quan sát thấy các hạt phấn (8). (Hình 3.19) Hình 3.19. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFG (B. fungosa var. globosa) 1. Mảnh mô mềm; 2. Mảnh biểu bì; 3. Mảnh mô mềm mang mảnh mạch; 4. Tinh thể canxi oxalat; 5. Sợi; 6. Tế bào cứng; 7. Vòi nhụy; 8. Hạt phấn hoa c, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BS (B. subcupularis): Bột màu nâu nhạt, mùi đặc trưng, vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì (1), các mảnh mô mềm (2,3,5). Sợi dài, tập trung thành bó (4); rải rác có các vòi nhụy dài (6). Hạt phấn hoa tập trung thành đám (7) hoặc rải rác, hình tam giác khi quan sát ở vị trí cực (8). (Hình 3.20) d, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BT (B. tobiracola): Bột màu vàng nâu, không mùi, vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Các mảnh mô mềm tế bào thành mỏng (1,4,5). Các hoa cái chỉ có một vòi nhụy, tập trung thành đám (2). Vảy bảo vệ hoa cái (3). Mảnh mạch xoắn (6), mảnh biểu bì (7). Hạt phấn hoa hình tròn (8). (Hình 3.21) 85 Hình 3.20. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BS (B. subcupularis) 1. Mảnh biểu bì; 2,3,5. Mảnh mô mềm; 4. Bó sợi; 6. Vòi nhụy hoa cái; 7,8. Hạt phấn Hình 3.21. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BT (B. tobiracola) 1,4,5. Mảnh mô mềm; 2. Các vòi nhụy; 3. Vảy bảo vệ; 4,5. Mảnh mô mềm; 6. Mảnh mạch; 7. Mảnh biểu bì; 8. Hạt phấn 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 3.2.1. Định tính các nhóm chất Kết quả định tính cho thấy thành phần hóa học chính trong các loài thuộc chi Dó đất bao gồm: tanin, acid hữu cơ, triterpen. Bên cạnh đó một số mẫu có 86 phản ứng dương tính yếu với thuốc thử flavonoid. Kết quả cụ thể trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học các mẫu nghiên cứu Nhóm chất Phản ứng/Thí nghiệm BFI BFG BS BT Saponin Thí nghiệm tạo bọt – – – – Anthranoid P/ư Borntraeger – – – – Flavonoid P/ư Cyanidin P/ư với kiềm P/ư với FeCl3 P/ư với TT Diazo – + + + – + + + + + + + + + + + Coumarin Mở đóng vòng lacton Quan sát huỳnh quang ± ± ± ± ± ± ± ± Tanin P/ư với TT FeCl3 5% P/ư với chì acetat 10% P/ư với gelatin 1% + + + + + + + + + + + + Alcaloid P/ư với TT Mayer P/ư với TT Bouchardat P/ư với TT Dragendorff – – – – – – – – – – – – Acid hữu cơ P/ư với Na2CO3 + + + + Đường khử P/ư với TT Fehling + + + + Acid amin P/ư với TT Ninhydrin - - - - Caroten P/ư với H2SO4 - - - - Triterpen P/ư Liebermann + + + + Chú thích: (+): Phản ứng dương tính yếu, (–): Phản ứng âm tính, (±) không rõ ràng 87 3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ một số loài nghiên cứu 3.2.2.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica) Dược liệu đã sấy khô của loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica) (BFI) được xay thành bột (2.8 kg), sau đó được ngâm chiết bằng methanol (10 lít x 3 lần). Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết methanol 245 g. Một phần cao chiết được giữ lại để đánh giá các tác dụng in vitro cũng như một số nội dung nghiên cứu khác. Phần cao chiết còn lại được chia thành 02 mẻ, mỗi mẻ được phân tán với nước (1,5 lít) rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan (1 lít x 3 lần) và ethyl acetat (1 lít x 3 lần). Gộp các dịch chiết n-hexan và ethyl acetat, tiến hành thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, kết quả thu được các cao chiết tương ứng n-hexan (17,9 g), ethyl acetat (152 g) và lớp nước. Tiến hành sắc ký cột silica gel (Φ 8,5 cm) đối với cao ethyl acetat, rửa giải với hệ dung môi gradient dicloromethan – methanol (1,10, 20, 40, 80 và 100 % methanol, V = 1000 ml cho mỗi hệ dung môi) thu được 6 phân đoạn ký hiệu BFE1-6. Phân đoạn BFE2 (2 g) được sắc ký qua cột silica gel (40 g, Φ 3,0 cm) với hệ dung môi rửa giải dicloromethan – ethyl acetat (10:1, v/v) thu được hai phân đoạn BFE2.1 và BFE2.2. Tiếp tục tinh chế BFE2.1 (250 mg) qua cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải dicloromethan – methanol (30:1, v/v) thu được BdD2.7 (12,5mg). Sắc ký cột silica gel phân đoạn BFE4 (0,5 g) rửa giải với hệ dung môi Dicloromethan – methanol – nước (6:1:0,1, v/v/v) (V = 700 ml) thu được hai phân đoạn BFE4.1 và BFE4.2. Phân đoạn BFE4.2 (50 mg) được đưa lên cột sắc ký silica gel (2 g, Φ 1,3 cm) rửa giải với hệ dung môi Dicloromethan – methanol – nước (8:1:0,05,v/v/v) (V = 600 ml) thu được hai hợp chất sạch tương ứng: BdD5.6 (12,4 mg) và BdD5.9 (7,2 mg). (Hình 3.22). 88 Dựa trên các dữ liệu phổ (phổ NMR, phổ khối lượng phân tử), cấu trúc các hợp chất được xác định. Hình 3.22. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BFI (Balanophora fungosa subsp. indica) Hợp chất BdD2.7: (+)-pinoresinol Hợp chất BdD2.7 thu được dưới dạng bột màu trắng. Số liệu phổ của BdD2.7: 1H NMR (500 MHz, MeOH): δH 6.93 (2H, s, C2,2’-H); 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, C6,6ʹ-H), 6.77 (2H, d, J = 8.0 Hz, C5,5ʹ-H), 4.67 (2H, d, J = 3.5 Hz, C7,7ʹ-H), 4.18 – 4.15 (2H, dd, J = 7.0, 8.5, H-9a, H-9ʹa), 3.80 (2H, d, J = 1.5 Hz, H-9b, H- 9’b), 3.78 (6H, s, 2 x MeO), 3.05 (2H, m, C8,8ʹ-H). 89 13C NMR (125 MHz, MeOH): 133.6 (C-1, C-1’), 110.7 (C-2, C-2’), 148.7 (C-3, C-3’), 146.9 (C-4, C-4’), 115.9 (C-5, C-5’), 119.8 (C-6, C-6’), 87.0 (C-7, C- 7’), 55.0 (C-8, C-8’), 72.3 (C-9, C-9’). Trên phổ proton xuất hiện tín hiệu của 3 proton thuộc vòng thơm tại δH 6.93 (2H, s, C2,2’-H); 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, C6,6ʹ-H), 6.77 (2H, d, J = 8.0 Hz, C5,5ʹ-H), một nhóm oximetin được xác định tại 4.67 (2H, d, J = 3.5, C7,7ʹ-H). Một nhóm oximetylen được xác định tai vị trí δH 4.18 – 3.80 (4H, m,C9,9’-H) và một nhóm metin tại δH 3.05 (2H, m,C8,8’-H). Tại độ dịch chuyển δH 3.78 (6H, s, 2 x MeO) xuất hiện tín hiệu của một nhóm methoxy . Trên phổ 13C và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 10 nguyên tử cacbon trong đó có 6 cacbon thuộc vòng thơm với độ dịch chuyển từ 110.7 – 148.7 ppm. Hai nhóm metin và metylen đính với oxy được xác định tại 87.0 (C-7, C-7ʹ) và 72.3 (C-9, C-9ʹ); gợi ý cho ta sự xuất hiện của khung benzofuran. Một nhóm methoxy được xác định tại δC 56.2. Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện pic ion [M+H]+ ở m/z 359,1496, điều này gợi ý rằng hợp chất BdD2.7 có CTPT C20H22O6; số lượng hydro và cacbon này gấp đôi số hydro và cacbon trên phổ 1H và 13C-NMR. Như vậy có thể nhận định hợp chất BdD2.7 có trục đối xứng bậc 1 trong phân tử. Theo các nghiên cứu gần đầy, độ dịch chuyển hóa học của của ΔδH-9 và ΔδH- 9’ của các lignan furofuran 8H chịu ảnh hưởng trực tiếp từ cấu hình tương đối của C-7/C-8 và C-7’/C-8’ [99]. Sự sai khác về độ dịch chuyển hóa học của H2-9 và H2-9’(ΔδH-9 và ΔδH-9’) đều có giá trị trung bình (~0.37 ppm) gợi ý cấu hình (I) 7- H/8-H trans, 7’-H/8’-H trans [99].Theo các nghiên cứu gần đầy, độ dịch chuyển hóa học của của ΔδH-9 và ΔδH-9’ của các lignan furofuran 8H chịu ảnh hưởng trực tiếp từ cấu hình tương đối của C-7/C-8 và C-7’/C-8’ [99]. Từ các dữ kiện phân tích trên kết hợp so sánh tài liệu đã công bố [40][99] có thể nhận định BdD2.7 là (+)-pinoresinol. Đây là cấu hình thường gặp trong tự nhiên so với cấu hình (-)- pinoresinol [28]. 90 Hợp chất BdD5.6: (+)-7,9':7',9-Diepoxy-3-methoxy-4,4'-lignandiol Hợp chất BdD5.6 thu dưới dưới dạng bột màu trắng. Số liệu phổ của BdD5.6: 1H NMR (500 MHz, MeOH): δH 7.22 (2H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, C3ʹ,5ʹ-H), 6.96 (1H, d, J = 2.0 Hz, C2ʹ-H), 6.84 – 6.81 (1H, m, C6ʹ-H), 6.80 – 6.77 (3H, m, C2,5,6- H), 4.72 – 4.71 (2H, m, C7,7ʹ-H), 4.26 – 4.21 (2H, m, H-9a, H-9ʹa), 3.87 (3H, br s, OMe), 3.86 – 3.82 (2H, m, H-9b, H-9’b), 3.16 – 3.13 (2H, m, C8,8ʹ-H); 13C NMR (125 MHz, MeOH): 158.2 (C-4’), 149.1 (C-3), 147.3 (C-4), 133.8 (C-1), 133.1 (C-1’), 128.7 (C-2’,C-6’), 120.1 (C-6), 116.2 (C-3’, C-5’), 116.1 (C- 5), 111.0 (C-2), 87.6 (C-7), 87.4 (C-7’), 72.6 (C-9), 72.4 (C-9’), 56.4 (OMe), 55.2 (C-8), 49.5 (C-8’) Trên phổ proton xuất hiện tín hiệu của 7 proton thuộc vòng thơm. Trong đó có 4 proton thế kiểu A2B2 tại δH 6.97 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2ʹ); 6.84 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6ʹ), 7.23 (2H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-3ʹ, H-5ʹ). Tín hiệu của hai nhóm oxymethin được xác định tại 4.72 – 4.71 (2H, m, C7,7ʹ-H), hai nhóm oxymethylen được xác định tai vị trí δH 4.26 – 4.21 (2H, m, H-9a, H-9ʹa), 3.86 – 3.82 (2H, m, H-9b, H-9’b). Tại độ dịch chuyển δH 3.87 (3H, br s, OMe) xuất hiện tín hiệu của một nhóm oxymethyl. Trên phổ 13C và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 10 nguyên tử cacbon trong đó có 6 cacbon thuộc vòng thơm với độ dịch chuyển từ 111.01 – 158.2 ppm. Hai nhóm methin được xác định tại 87.6 (C-7) và 87.4 (C-7ʹ)) và hai nhóm methylen đính với oxy 72.4 (C-9ʹ) và 72.6 (C-9); gợi ý cho ta sự xuất hiện của benzofuran. Một nhóm methoxy được xác định tại δC 56.4 ppm. 91 Từ các phân tích trên cho thấy các tín hiệu thu được từ phổ NMR của BdD5.6 có sự tương đồng với hợp chất BdD2.7 [(+)-pinoresinol] ngoại trừ thiếu đi một nhóm methoxy tại vị trí C-3ʹ. Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện pic ion [M+H]+ ở m/z 329,3. Điều này gợi ý hợp chất BdD5.6 có CTPT C19H20O5 (M = 328), phù hợp với các phân tích trên phổ NMR. Cấu hình không gian của hợp chất BdD5.6 có một số khác biệt với cấu hình của hợp chất (-)-epi-(4-hydroxyphenylguaicyl) tetrahydrodurofuran lignan được Casabuono phân lập và xác định cấu trúc [28]. Cụ thể, các tín hiệu proton trên phổ 1H NMR của C7-H và C7’-H đều được dịch chuyển về vùng trường thấp (δH 4.72 và 4.71) cho thấy nhóm aryl cùng là equatorial (hướng xích đạo) hoặc axial (hướng trục). Trong khi đó, với cấu hình epi của hệ diepoxy, các tín hiệu của proton benzylic H-7 và H-7’ không có sự tương đồng do sự dịch chuyển về các vùng trường khác nhau [28]. Bên cạnh đó, tính toán giá trị sai khác về độ dịch chuyển hóa học của H2-9 và H2-9’(ΔδH-9 và ΔδH-9’) đều có giá trị trung bình (~0.39 ppm), tương tự hợp chất BdD2.7. Như vậy, từ các dữ kiện phân tích trên kết hợp so sánh tài liệu đã công bố [35] có thể xác định BdD5.6 là: (+)-7,9':7',9-Diepoxy-3-methoxy-4,4'- lignandiol. Hợp chất BdD5.9: Balanophonin Hợp chất BdD5.9 phân lập dưới dạng dầu màu vàng. Dữ liệu phổ của BdD5.9: 1H-NMR (500 MHz, MeOD): δH 9.59 (1H, d, J = 7.5 Hz, C9’-H), 7.63 (1H, d, J = 16 Hz, C7’-H), 7.28 (1H, s, C6’-H), 6.97 (1H, d, J = 2 Hz, C2’-H), 6.85 (1H, 92 d, J = 2 Hz, C2-H), 6.84 (1H, d, J = 2 Hz, C6-H), 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz, C5-H), 6.71 (1H, dd, J = 8.0, 15.5 Hz, C8’-H), 5.62 (1H, d, J = 6.5 Hz, C7-H), 3.92 (3H, s, 3’-OCH3), 3.87 – 3.85 (2H, m, C9-H), 3.83 (3H, s, 3-OCH3), 3.59 (1H, dd, J = 6, 12.5 Hz, C8-H). 13C-NMR (125 MHz, MeOD): δC 196.1 (C-9’), 156.0 (C-7’), 152.9 (C-4’), 149.1 (C-3), 147.8 (C-4), 145.9 (C-3’), 133.9 (C-1), 131.2 (C-5’), 129.6 (C-1’), 127.0 (C-8’), 119.9 (C-6), 119.8 (C-6’), 116.2 (C-5), 114.2 (C-2’), 110.6 (C-2), 90.0 (C-7), 64.5 (C-9), 56.8 (3-OCH3), 56.4 (3’-OCH3), 54.5 (C-8). Phổ NMR cho thấy chất BdD5.9 cho thấy các tín hiệu của một neolignan. Tín hiệu của hai nhóm metin tại δH 3.59 (1H, dd, J = 6, 12.5 Hz, C8-H)/δC 54.5 và 5.62 (1H, d, J = 6.5 Hz, C7-H)/ δC 90.0, cùng tín hiệu proton của nhóm oxymetylen (-OCH2-) liên kết với vòng ở δH 3.87 – 3.85 (2H, m, C9-H) cho phép ta khẳng định sự có mặt của một vòng dihydrofuran, nhận định này được khẳng định thêm bởi phổ HMBC xuất hiện các tương tác của H-9/C-5’, H-9/C-7 và H-7/C-9, H-7/C- 4’. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất BdD5.9 xuất hiện tín hiệu của 3 proton thơm vòng benzen bị thế kiểu ABX tại δH 6.85 (1H, d, J = 2 Hz, C2-H), 6.84 (1H, d, J = 2 Hz, C6-H), 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz, C5-H) và hai proton vòng thơm khác tại δH 7,28 (1H, s, C6’-H), 6.97 (1H, d, J = 2 Hz, C2’-H), hai tín hiệu proton singlet của nhóm methoxy ở δH 3.83 (3H, s, 3-OCH3), 3.92 (3H, s, 3’-OCH3) cùng tín hiệu proton của nhóm aldehyd tại δH 9.59 (1H, d, J = 7.5 Hz, C9’-H), và tín hiệu cộng hưởng ngoài vòng tại δH 7.63 (1H, d, J = 16 Hz, C7’-H), 6.71 (1H, dd, J = 8.0, 15.5 Hz, C8’-H) với hằng số tương tác J = 16 Hz đặc trưng cho liên kết - CH=CH- ngoài vòng. Trên phổ HMBC, tương tác xa giữa các nhóm methoxy ở δH 3.83 và 3.92 với các nguyên tử cacbon tại 145.9 (C-3’) và 149.1 (C-3). Công thức phân tử được xác định dựa trên số liệu phổ khối ESI-MS với pic ion tại m/z 357,09 [M+H]+, vì vậy dự đoán công thức phân tử của BdD5.9 là C20H20O6. 93 Từ các phân tích phổ ở trên, kết hợp so sánh với tài liệu hợp chất Balanophonin đã công bố cho thấy sự tương đồng ở tất cả các vị trí, đặc biệt là độ dịch chuyển hóa học của proton tại C7-H và C8-H; như vậy có thể khẳng định BdD5.9 là Balanophonin với cấu hình 7S,8R [56]. 3.2.2.2. Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Dó đất sần (Balanophora fungosa var. globosa) Dược liệu đã sấy khô của loài Dó đất sần (Balanophora fungosa var. globosa) được xay thành bột (3,4 kg), sau đó được ngâm chiết bằng methanol (10 lít x 3 lần). Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết methanol 550 g. Một phần cao chiết cũng được giữ lại, phần còn lại được chia thành 03 mẻ, mỗi mẻ được phân tán với nước (1,5 lít) rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan (1 lít x 3 lần) và ethyl acetat (1 lít x3 lần). Gộp các dịch chiết n- hexan và ethyl acetat, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm t