Luận án Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen egfr và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi

nh quang ở các ống đối chứng dương, nội chứng và không có tín hiệu ở đối chứng âm. Hình 3.1. Kết quả phát hiện đột biến EGFR. (A): Đối chứng dương, (B):Đối chứng âm, (C): Đột biến mất đoạn exon 19, (D): Đột biến thay thế L858R exon 21. Đột biến EGFR được phát hiện ở 35,3% (49/139) bệnh nhân, với 12 dạng đột biến khác nhau. Đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến L858R chiếm 85,5% với tỷ lệ lần lượt là 42,9% và 32,7% (Bảng 3.2). Đột biến kháng TKIs thế hệ thứ nhất và thứ hai T790M (thay thế Threonine bằng Methionine tại vị trí axit amin 790) trên exon 20 xuất hiện ở 3/139 (4,1%) bệnh nhân trong nghiên cứu (Hình 3.1). Bên cạnh đó, 6 trường hợp phát hiện 2 đột biến xảy ra đồng thời. Đột biến thay thế G719X (bao gồm: G719A thay thế Glycine bằng Alanine; G719C thay thế Glycine bằng Cysteine và G719S thay thế Glycine bằng Serine tại axit amin 719) thường xảy ra đồng thời với những đột biến khác (4/5 trường hợp) như S768I (thay thế Serine bằng Isoleucine tại axit amin 768), L861Q (thay thế Leucine bằng Glutamine tại axit amin 861), L858R và mất đoạn ở exon 19. 54 3.2.1.2. Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân Sự tương quan của đột biến EGFR với các yếu liên quan bao gồm: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, tình trạng khối u và giai đoạn bệnh được trình bày trong Bảng 3.3. Bảng 3.3. Tương quan giữa đột biến gen EGFR với các đặc điểm bệnh nhân ĐỘT BIẾN GEN EGFR Số lƣợng (%) Đột biến (%) Kiểu dại (%) Giá trị p ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 49 (35,3) 90 (64,75) Tuổi (57,4 ±10,67) ≤57,4 67 (48,2) 30 (44,8) 37 (55,2) 0,023 >57,4 72 (51,8) 19 (26,4) 53 (73,6) Giới tính Nam 94 (67,6) 23 (24,5) 71 (75,5) Nữ 45 (33,4) 26 (57,8) 19 (42,2) <0,001 Tình trạng hút thuốc Hút thuốc 79 (56,8) 20 (25,3) 59 (74,7) Không hút thuốc 60 (43,2) 29 (48,3) 31 (51,7) 0,005 Phân típ mô bệnh học Tuyến chùm nang 79 (56,8) 32 (40,5) 47 (59,5) 0,065 Tuyến nhú 22 (15,8) 7 (31,8) 15 (68,2) 0,714 Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 (66,7) 1 (33,3) 0,190 Tuyến đặc 34 (24,5) 7 (20,6) 27 (79,4) 0,040 Típ hỗn hợp 1 (0,7) 1 (100) 0 (0,0) Tình trạng U Nguyên phát 104 (74,8) 36 (34,6) 68 (63,4) 0,787 Di căn 35 (25,2) 13 (37,1) 22 (62,9) Giai đoạn I & II 12 (8,6) 6 (50,0) 6 (50,0) 0,263 III & IV 127 (91,4) 43 (33,9) 84 (67,1) 55 Độ tuổi trung bình trong nghiên cứu là 57,4, trong đó 67 trường hợp dưới 57,4 tuổi và 72 trường hợp trên 57,4 tuổi. Đột biến EGFR ở nhóm bệnh nhân thấp hơn tuổi trung bình là 44,8% (30/67) và ở nhóm cao hơn tuổi trung bình là 26,4% (19/72). Tần suất đột biến EGFR giữa hai nhóm tuổi có khác biệt có ý nghĩa, với p<0,05 (Bảng 3.3). Kết quả cho thấy đột biến EGFR có xu hướng xảy ra ở những bệnh nhân trẻ tuổi mắc ung thư phổi dạng biểu mô tuyến. Kết quả phân tích số liệu ở Bảng 3.3 cho thấy, tỷ lệ đột biến EGFR ở bệnh nhân nữ giới là 57,8% (26/45). Trong khi đó ở nhóm bệnh nhân là nam giới, tỷ lệ này là 24,5% (23/94). Như vậy, đột biến EGFR xảy ra phổ biến hơn ở bệnh nhân nữ giới so với nam giới với p<0,05. Bảng 3.4. Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh nhân nam giới ĐỘT BIẾN EGFR HÚT THUỐC Đột biến (%) Kiểu dại (%) Tổng số Giá trị p Không 9 (45,0) 11 (55,0) 20 0,016 Có 14 (18,9) 60 (81,1) 74 Trong 139 bệnh nhân của nghiên cứu, 79 trường hợp có tiền sử hút thuốc lá và 60 trường hợp chưa từng sử dụng thuốc lá. Tiền sử hút thuốc lá của bệnh nhân và hiện tượng đột biến gen EGFR có mối liên quan ngược với p<0,05. Cụ thể, ở bệnh nhân có hoặc đã từng hút thuốc, tỷ lệ đột biến EGFR là 23,3% (20/79), trong khi tỷ lệ này ở bệnh nhân không sử dụng thuốc lá là 48,3% (29/60) (Bảng 3.3). Do số lượng bệnh nhân có tiền sử hút thuốc ở nữ giới có 3 trường hợp nên nghiên cứu chỉ phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến EGFR và tiền sử hút thuốc ở nhóm bệnh nhân nam giới. Tỷ lệ hút thuốc và không hút thuốc ở nam giới lần lượt là 78,7% (74/94) và 21,3%. Ngược lại, tỷ lệ đột biến EGFR ở hai nhóm này là 18,9% (14/60) và 45,0% (9/20) (Bảng 3.4). Phân tích mối tương quan giữa tiền sử hút thuốc lá và đột biến gen EGFR ở bệnh nhân nam giới cho thấy đột biến gen xảy ra ở những bệnh nhân chưa từng hút thuốc cao hơn những bệnh nhân hút thuốc với p<0,05. 56 Ba phân típ mô bệnh học chính trong nghiên cứu là tuyến chùm nang; tuyến nhú và típ tuyến đặc, tỷ lệ đột biến tính riêng cho từng phân típ lần lượt là 40,5% (32/79), 31,8% (7/22) và 20,6% (7/34). Phân tích mối tương quan giữa đột biến EGFR với các típ mô bệnh học, kết quả cho thấy ở những bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến dạng típ đặc có tỷ lệ đột biến EGFR thấp hơn những típ mô bệnh học khác với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Bảng 3.3). Tần suất đột biến EGFR ở những khối u nguyên phát và khối u di căn lần lượt là 34,6% (36/104) và 37,1% (13/35). Đột biến ở những khối u di căn có xu hướng cao hơn ở khối u nguyên phát, tuy nhiên sự sai khác là ngẫu nhiên, không có ý nghĩa với p>0,05 (Bảng 3.3). Đồng thời, kết quả phân tích cũng không cho thấy có sự khác biệt trong tỷ lệ đột biến gen EGFR giữa nhóm bệnh nhân giai đoạn muộn và giai đoạn sớm (33,9% so với 50,0%), với p>0,05 (Bảng 3.3). 3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân 3.2.2.1. Biểu hiện protein EGFR Hình 3.2. Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR. A: Kết quả nhuộm H&E, B: Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch, (0): Không biểu hiện, (1+): Biểu hiện yếu, (2+): Biểu hiện trung bình, (3+): Biểu hiện mạnh. Sự biểu hiện protetin EGFR được đánh giá bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (HMMD). Cường độ biểu hiện của EGFR trên bề mặt tế bào được chia thành 4 mức độ từ 0 đến 3+, trong đó: Không có sự biểu hiện (0), biểu hiện yếu (1+), biểu hiện trung bình (2+), biểu hiện mạnh (3+). Kết quả phân tích trên 139 mẫu bệnh phẩm cho thấy, 32 mẫu bệnh phẩm không biểu hiện protein EGFR, mức độ biểu 57 hiện tăng dần từ 1+ đến 3+ được xác định trên các mẫu bệnh phẩm lần lượt là 25; 6 và 20 trường hợp. Dựa trên kết quả phân tích mức độ biểu hiện của protein trong xét nghiệm hóa mô miễn dịch, những trường hợp cho kết quả HMMD 0 và 1+ được cho âm tính, những trường hợp có kết quả HMMD là 2+ và 3+ được cho là dương tính với protein EGFR. Như vậy, nghiên cứu thu được 57 (41,0%) mẫu bệnh phẩm âm tính và 82 (59,0%) mẫu dương tính với sự biểu hiện protein EGFR (Bảng 3.4 và phụ lục 7). Bảng 3.5. Mức biểu hiện protein EGFR BIỂU HIỆN PROTEIN EGFR Cƣờng độ 0 1+ 2+ 3+ Tổng số Số lƣợng (%) 32 (23,0) 25 (18,0) 62 (44,6) 20 (13,4) 139 (100) Cƣờng độ Âm tính (%) Dương tính (%) Số lƣợng (%) 57 (41,0) 82 (59,0) 139 (100) 3.2.2.2. Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với đặc điểm bệnh nhân Sự tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với các yếu liên quan bao gồm: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, trình trạng khối u và giai đoạn bệnh được trình bày trong Bảng 3.6. Phân tích mối liên quan giữa biểu hiện EGFR với nhóm tuổi, kết quả cho thấy ở những bệnh nhân trên độ tuổi trung bình (57,4) có sự biểu hiện protein EGFR cao hơn so với nhóm bệnh nhân độ tuổi thấp (61,1% so với 56,7%). Tuy nhiên, sự khác biệt là ngẫu nhiên (p>0,05). Ở nhóm protein EGFR dương tính cho thấy phần lớn mẫu bệnh phẩm biểu hiện ở mức độ trung bình ở cả hai nhóm tuổi với tỷ lệ lần lượt là 79,0% (30/38) và 72,7% (23/44) (Bảng 3.6). Nghiên cứu cũng chỉ ra không có sự khác biệt về sự biểu hiện EGFR giữa nhóm bệnh nhân là nam giới và nữ giới. Bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi là nam giới có tỷ lệ biểu hiện protein EGFR là 62,8% và ở nữ giới là 51,1%. Tuy nhiên, tần suất biểu hiện quá mức protein EGFR (3+) ở bệnh nhân nam giới và nữ giới có sự khác biệt với tỷ lệ lần lượt là 30,5% và 8,0%, sự sai khác có ý nghĩa 58 thống kê với p<0,05. Như vậy, ở nam giới có mức độ biểu hiện EGFR quá mức cao hơn ở bệnh nhân nữ giới (Bảng 3.6). Bảng 3.6. Tương quan giữa mức độ biểu hiện EGFR với đặc điểm bệnh nhân BIỂU HIỆN PROTEIN EGFR Số lƣợng 0 + 1+ 2+ 3+ Âm tính Dƣơng tính Giá trị p ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 32 25 62 20 57 (41,0) 82 (59,0) Tuổi (57,4 ±10,67) ≤57,4 67 (48,2) 16 13 30 8 29 (43,3) 38 (56,7) 0,599 >57,4 72 (51,8) 16 12 32 12 28 (38,9) 44 (61,1) Giới tính Nam 94 (67,6) 20 15 41 18 35 (37,2) 59 (62,8) 0,191 Nữ 45 (33,4) 12 10 21 2 22 (48,9) 23 (51,1) Tình trạng hút thuốc Hút thuốc 79 (56,8) 17 14 35 13 31 (39,2) 48 (60,8) 0,627 Không hút thuốc 60 (43,2) 15 11 27 7 26 (43,3) 34 (56,7) Phân típ mô bệnh học Tuyến chùm nang 79 (56,8) 13 14 38 14 27 (34,2) 52 (65,8) 0,060 Tuyến nhú 22 (15,8) 4 5 11 2 9 (40,9) 13 (51,1) 0,992 Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 0 1 0 2 (66,7) 1 (33,3) 0,361 Tuyến đặc 34 (24,5) 12 6 12 4 18 (52,9) 16 (47,1) 0,104 Típ hỗn hợp 1 (0,7) 1 0 0 0 1 (100) 0 (0,0) 0,229 Tình trạng U Nguyên phát 104 (74,8) 23 16 50 14 39 (37,5) 64 (72,50) 0,203 Di căn 35 (25,2) 9 9 12 6 18 (50,0) 18 (50,0) Giai đoạn I & II 12 (8,6) 2 2 5 3 4 (33,3) 8 (66,7) 0,572 III & IV 127 (91,4) 30 23 57 17 53 (33,8) 74 (66,2) Nghiên cứu không cho thấy có sự ảnh hưởng của thói quen hút thuốc, sự khác nhau trong các phân típ mô bệnh học, cũng như giai đoạn bệnh đến sự biểu hiện của protein EGFR trên bề mặt tế bào (Bảng 3.6). Tỷ lệ biểu hiện và biểu hiện quá mức protein EGFR ở khối u nguyên phát là 72,5% và 21,9% và ở khối u di căn 59 là 50,0% và 33,3%. Như vậy, khối u nguyên phát có xu hướng biểu hiện EGFR với cường độ trung bình, ngược lại ở những khối u di căn có xu hướng biểu hiện quá mức protein này. Tuy nhiên, với sự khác biệt về mức độ biểu hiện quá mức EGFR không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 3.6). 3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thƣ biểu mô tuyến của phổi 3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân 3.3.1.1. Methyl hóa gen EGFR Trạng thái methyl hóa vùng promoter gen EGFR được xác định thông qua kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa (MS-PCR). Sau đó sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrilamide 10% (Hình 3.3). Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen EGFR. B: mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1-N2: Mẫu phổi lành tính, S1-S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: Thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm EGFR methyl hóa (158 bp), U: Sản phẩm EGFR không methyl hóa (150 bp), NTC: Đối chứng âm. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm EGFR methyl hóa và EGFR không methyl hóa có kích thước là 150 bp và 158 bp. Hiện tượng methyl EGFR có thể xảy ra ba trường hợp: (1) Mẫu không methyl khi đó MS-PCR chỉ khuếch đại trình tự EGFR không methyl hóa; (2) Mẫu methyl hoàn toàn khi MS-PCR chỉ khuếch đại trình tự EGFR methyl hóa và (3) Mẫu methyl hóa không hoàn toàn khi MS – PCR khuếch đại đồng thời trình tự EGFR methyl hóa và trình tự EGFR không methyl hóa. Trong nghiên cứu, mẫu được sử dụng là mẫu bệnh phẩm mổ hoặc sinh thiết vì 60 vậy ngoài DNA được tách chiết từ tế bào ung thư sẽ có cả DNA từ những tế bào lành không mang gen EGFR methyl hóa. Dẫn đến kết quả điện di sản phẩm MS- PCR luôn xuất hiện băng EGFR không methyl hóa. Bảng 3.7. Tương quan giữa methyl EGFR với đặc điểm bệnh nhân METHY HÓA EGFR Số lƣợng (%) Methyl (%) Không Methyl (%) Giá trị p ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 33 (23,7) 106 (76,3) Tuổi (57,4 ±10,67) ≤57,4 67 (48,2) 15 (22,4) 52 (77,6) 0,718 >57,4 72 (51,8) 18 (25,0) 54 (75,0) Giới tính Nam 94 (67,6) 22 (23,4) 72 (76,6) 0,893 Nữ 45 (33,4) 11 (23,9) 34 (76,1) Tình trạng hút thuốc Hút thuốc 79 (56,8) 20 (25,3) 59 (74,7) 0,616 Không hút thuốc 60 (43,2) 13 (21,7) 47 (78,2) Phân típ mô bệnh học Tuyến chùm nang 79 (56,8) 16 (20,3) 63 (79,7) 0,267 Tuyến nhú 22 (15,8) 5 (22,7) 17 (77,3) 0,903 Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 (66,7) 1 (33,3) 0,077 Tuyến đặc 34 (24,5) 10 (29,4) 24 (70,6) 0,371 Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,575 Tình trạng U Nguyên phát 104 (74,8) 24 (23,1) 80 (76,9) 0,751 Di căn 35 (25,2) 9 (25,7) 26 (74,3) Giai đoạn I & II 12 (8,6) 1 (8,3) 11 (91,7) 0,189 III & IV 127 (91,4) 32 (25,2) 95 (74,8) Phân tích 139 mẫu bệnh phẩm kết quả cho thấy 23,7% (33/139) trường hợp có vùng promoter gen EGFR bị methyl hóa và 76,5% (106/139) không có sự 61 methyl. Để khẳng định kết quả của quá trình xử lý bisulfite và tính đặc hiệu của phản ứng MS-PCR khuếch đại trình tự promoter EGFR, sản phẩm MS-PCR được tiến hành giải trình tự trực tiếp với cặp mồi tương ứng cho trình tự EGFR bị methyl và không methyl hóa. Kết quả giải trình tự được trình bày trong Phụ lục 5. 3.3.1.2. Tương quan giữa methyl hóa gen EGFR với các đặc điểm bệnh nhân Sự tương quan giữa methyl hóa gen EGFR với các yếu tố liên quan bao gồm: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, trình trạng khối u và giai đoạn bệnh được trình bày trong Bảng 3.7. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tình trạng methyl hóa vùng promoter gen EGFR ở các nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tuyển của phổi khác nhau về những đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trong nghiên cứu với p>0,05 (Bảng 3.7). 3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân 3.3.2.1. Methyl hóa BRCA1 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen BRCA1. B: mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1 – N2: Mẫu phổi lành tính, S1 – S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm BRCA1 methyl (70 bp), U: Sản phẩm BRCA1 không methyl (77 bp), NTC: Đối chứng âm. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 được đánh giá dựa trên kết quả điện di polyacrimamide 10% sản phẩm MS-PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự BRCA1 bị methyl và BRCA1 không bị methyl. Kích thước sản phẩm MS-PCR lần lượt là 70 bp (BRCA1 bị methyl ) và 77 bp (BRCA1 không bị methyl) (Hình 3.4) 62 Kết quả phân tích tình trạng methyl hóa gen BRCA1 trên 139 bệnh nhân cho thấy 41 (29,5 %) mẫu bệnh phẩm mang gen BRCA1 bị methyl hóa và 98 (70,5%) mẫu bệnh phẩm không xảy ra hiện tượng methyl hóa BRCA1. 3.3.2.2. Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân Bảng 3.8. Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân METHYL HÓA BRCA1 Số lƣợng (%) Methyl (%) Không meyhly (%) Giá trị p ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 41 (29,5) 98 (70,5) Tuổi (57,4 ±10,67) ≤57,4 67 (48,2) 18 (26,9) 49 (73,1) 0,512 >57,4 72 (51,8) 23 (31,9) 49 (68,1) Giới tính Nam 94 (67,6) 31 (33,0) 63 (67,0) 0,193 Nữ 45 (33,4) 10 (22,2) 35 (77,8) Tình trạng hút thuốc Hút thuốc 79 (56,8) 26 (32,9) 53 (67,1) 0,311 Không hút thuốc 60 (43,2) 15 (25,0) 45 (75,0) Phân típ mô bệnh học Tuyến chùm nang 79 (56,8) 21 (26,6) 58 (73,4) 0,387 Tuyến nhú 22 (15,8) 7 (31,8) 15 (68,2) 0,795 Tuyến vi nhú 3 (2,2) 1 (33,3) 2 (66,7) 0,883 Tuyến đặc 34 (24,5) 11 (3,4) 23 (67,6) 0,674 Típ hỗn hợp 1 (0,7) 1 (100,0) 0 (0,0) 0,121 Tình trạng U Nguyên phát 104 (74,8) 30 (28,9) 74 (71,1) 0,772 Di căn 35 (25,2) 11 (31,4) 24 (68,6) Giai đoạn I & II 12 (8,6) 3 (25,0) 9 (75,0) 0,721 III & IV 127 (91,4) 38 (29,9) 89 (70,1) 63 Sự tương quan giữa tình trạng methyl BRCA1 với các yếu tố liên quan được trình bày trong Bảng 3.8. Kết quả cho thấy methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 không có sự khác biệt giữa với các yếu tố: Độ tuổi, giới tình, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, đặc điểm khối u và giai đoạn bệnh vói p>0,05. 3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân 3.3.3.1. Methyl hóa MGMT Kết quả xác định tình trạng methyl hóa MGMT được đánh giá thông qua phương pháp điên di sản phẩm MS – PCR với cặp mồi đặc hiệu trên gel polyacrilamide 10% được minh họa trong Hình 3.5. Sản phẩm MS – PCR đặc hiệu cho MGMT methyl hóa có kích thước 81 bp và MGMT không methyl hóa có kích thước 93 bp. Tần suất methyl hóa vùng promoter gen MGMT trên 139 mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu là 33,1% (46/139) (Bảng 3.9). Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen MGMT. B: Mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1 – N2: Mẫu phổi lành tính, S1 – S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MGMT methyl (81 bp), U: Sản phẩm MGMT không methyl (93 bp), NTC: Đối chứng âm. 3.3.2.2. Tương quan giữa methyl hóa gen MGMT với đặc điểm bệnh nhân Sự tương quan giữa trình trạng methyl MGMT với các yếu tố liên quan được trình bày trong Bảng 3.9. Kết quả cho thấy không có sự ảnh hưởng của các đặc điểm như: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, đặc điểm mô bệnh học và giai đoạn bệnh đến sự methyl MGMT (p>0,05) (Bảng 3.9). Sự khác biệt duy nhất giữa tình trạng methyl hóa MGMT với các đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu được tìm thấy đó là đặc điểm khối u nghiên cứu. Trong 104 mẫu bệnh phẩm thu được từ 64 những khối u nguyên phát chỉ có 28,2% (29/104) trường hợp có sự methyl MGMT. Ngược lại, tỷ lệ methyl gen MGMT ở nhóm mẫu thu thập từ 35 khối u di căn là 47,2% (17/35). Như vậy, tại những khối u di căn của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi, hiện tượng methyl hóa MGMT xảy ra phổ biến hơn so với tại những khối u nguyên phát (p<0,05) (Bảng 3.9). Bảng 3.9. Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân METHYL HÓA MGMT Số lƣợng (%) Methyl (%) Không methyl (%) Giá trị p ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 46 (33,1) 93 (66,9) Tuổi (57,4 ±10,67) ≤57,4 67 (48,2) 17 (25,4) 50 (74,6) 0,062 >57,4 72 (51,8) 29 (40,3) 43 (59,7) Giới tính Nam 94 (67,6) 32 (34,0) 62 (66,0) 0,731 Nữ 45 (33,4) 14 (31,1) 31 (68,9) Tình trạng hút thuốc Hút thuốc 79 (56,8) 29 (36,7) 50 (63,3) 0,299 Không hút thuốc 60 (43,2) 17 (28,3) 43 (71,7) Phân típ mô bệnh học Tuyến chùm nang 79 (56,8) 26 (32,9) 53 (67,1) 0,958 Tuyến nhú 22 (15,8) 6 (27,3) 16 (72,7) 0,527 Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 (66,7) 1 (33,3) 0,212 Tuyến đặc 34 (24,5) 12 (35,3) 22 (64,7) 0,754 Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,480 Tình trạng U Nguyên phát 104 (74,8) 29 (28,2) 75 (72,8) 0,024 Di căn 35 (25,2) 17 (47,2) 18 (52,8) Giai đoạn I & II 12 (8,6) 3 (25,0) 9 (75,0) 0,533 III & IV 127 (91,4) 43 (33,9) 84 (66,1) 65 3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân 3.3.4.1. Methyl hóa MLH1 Sự methyl hóa vùng promoter gen MLH1 được đánh dựa trên kết quả điện di polyacrimamide 10% sản phẩm MS-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho DNA bị methyl và không bị methyl. Kích thước sản phẩm MS-PCR khuếch đại trình tự MLH1 methyl hóa là 301 bp và trình tự MLH1 không methyl hóa là 303 bp (Hình 3.6) Kết quả phân tích tình trạng methyl hóa MLH1 trên 139 bệnh nhân cho thấy có 28 (20,1%) mẫu bệnh phẩm mang gen MLH1 bị methyl và 111 (79,9%) mẫu bệnh phẩm không xảy ra hiện tượng này. Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa MLH1. B: Mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1– N2: Mẫu phổi lành tính, S1 – S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MLH1 methyl (303 bp), U: Sản phẩm MLH1 không methyl (301 bp), NTC: Đối chứng âm. 3.3.4.2. Tương quan giữa methyl hóa gen MLH1 với đặc điểm bệnh nhân Sự tương quan giữa tình trạng methyl hóa vùng promoter gen MLH1 với các đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.10. Tuy nhiên, không cho thấy sự khác biệt về tình trạng methyl MLH1 giữa các nhóm bệnh nhân khác nhau về những đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng với giá trị p>00,5 (Bảng 3.10). 66 Bảng 3.10. Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân METHYL HÓA MLH1 Số lƣợng (%) Methyl (%) Không methyl (%) Giá trị p ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 28 (20,1) 111 (79,9) Tuổi (57,4 ±10,67) ≤57,4 67 (48,2) 12 (17,9) 55 (82,1) 0,527 >57,4 72 (51,8) 16 (22,2) 56 (77,8) Giới tính Nam 94 (67,6) 18 (19,2) 76 (80,8) 0,673 Nữ 45 (33,4) 10 (22,2) 35 (77,8) Tình trạng hút thuốc Hút thuốc 79 (56,8) 16 (20,3) 63 (79,7) 0,971 Không hút thuốc 60 (43,2) 12 (20,0) 48 (80,0) Phân típ mô bệnh học Tuyến chùm nang 79 (56,8) 15 (19,0) 64 (81,0) 0,697 Tuyến nhú 22 (15,8) 5 (22,7) 17 (77,3) 0,742 Tuyến vi nhú 3 (2,2) 1 (33,3) 2 (66,7) 0,476 Tuyến đặc 34 (24,5) 7 (20,6) 27 (79,4) 0,941 Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,614 Tình trạng U Nguyên phát 104 (74,8) 19 (18,3) 85 (81,7) 0,341 Di căn 35 (25,2) 9 (25,7) 26 (74,3) Giai đoạn I & II 12 (8,6) 2 (16,7) 10 (83,3) 0,753 III & IV 127 (91,4) 26 (20,5) 101 (79,5) 3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân 3.3.5.1. Methyl hóa gen RASSF1A Tỷ lệ bệnh nhân mang gen RASSF1A có vùng promoter bị methyl hóa trong nghiên cứu là 29,5% (41/139). Sự methyl hóa RASSF1A được đánh giá thông qua kết quả điện di trên gel Polyacrimadide 10%. Phản ứng MS-PCR sử dụng cặp mồi 67 đặc hiệu khuếch đại trình tự RASSF1A methyl hóa có kích thước 175 bp và trình tự RASSF1A không methyl hóa có kích thước 137 bp (Hình 3.7). Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen RASSF1A. B: Mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1- N2: Mẫu phổi lành tính, S1-S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm RASSSF1A methyl (175 bp), U: Sản phẩm RASSF1A không methyl (137 bp), NTC: Đối chứng âm. 3.3.4.2. Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với các đặc điểm bệnh nhân Sự tương quan giữa trình trạng methyl hóa RASSF1A với các yếu tố liên quan được trình bày trong Bảng 3.11. Kết quả cho thấy không có sự ảnh hưởng của các đặc điểm như: Tuổi, giới tính, đặc điểm mô bệnh học và giai đoạn bệnh đến sự methyl RASSF1A. Ngược lại, tình trạng methyl RASSF1A ở bệnh nhân hút thuốc và những khối u di căn cao hơn có ý nghĩa thống kê so với những bệnh nhân không hút thuốc và tại những khối u nguyên phát. Ở nhóm bệnh nhân khác nhau về tiền sử hút thuốc là, tỷ lệ methyl hóa RASSF1A ở nhóm hút thuốc lá lên đến 36,7%, trong khi ở nhóm không hút thuốc chỉ 20,0% trường hợp được phát hiện có gen RASSF1A methyl (p<0,05). (Bảng 3.11). Bên cạnh đó, nghiên cứu chỉ ra có sự khác nhau về tình trạng methyl hóa RASSF1A và tình trạng khối u của bệnh nhân. Phân tích trên hai nhóm u nguyên phát và di căn cho thấy, tỷ lệ methyl hóa RASSF1A tại khối u di căn cao hơn so với khối u nguyên phát (42,9% so với 25,0% với p<0,05). Như vậy, sự methyl RASSF1A sẽ tăng lên cùng với mức độ di căn của khối u trong ung thư biểu mô tuyến của phổi (Bảng 3.11) 68 Bảng 3.11. Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân METHYL HÓA RASSF1A Số lƣợng (%) Methyl (%) Không methyl (%) Giá trị p ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 41 (29,5) 98 (70,5) Tuổi (57,4 ±10,67) ≤57,4 67 (48,2) 20 (29,9) 47 (70,1) 0,93 >57,4 72 (51,8) 21 (29,2) 51 (70,8) Giới tính Nam 94 (67,6) 29 (30,9) 65 (69,1) 0,613 Nữ 45 (33,4) 12 (26,7) 33 (73,3) Tình trạng hút thuốc Hút thuốc 79 (56,8) 29 (36,7) 50 (63,3) 0,032 Không hút thuốc 60 (43,2) 12 (20,0) 48 (80,0) Phân típ mô bệnh học Tuyến chùm nang 79 (56,8) 22 (27,9) 57 (72,1) 0,625 Tuyến nhú 22 (15,8) 7 (31,8) 15 (68,2) 0,795 Tuyến vi nhú 3 (2,2) 1 (33,3) 2 (66,7) 0,883 Tuyến đặc 34 (24,5) 11 (32,4) 23 (67,6) 0,674 Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,521 Tình trạng U Nguyên phát 104 (74,8) 26 (25,0) 78 (75,0) 0,045 Di căn 35 (25,2) 15 (42,9) 20 (57,1) Giai đoạn I & II 12 (8,6) 4 (33,3) 8 (66,7) 0,760 III & IV 127 (91,4) 37 (29,1) 90 (70,9) 3.4. Tƣơng quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một số gen liên quan đến ung thƣ tuyến của phổi 3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR Sự tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa vùng promoter và biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến của phổi được trình bày trong Bảng 3.12. 69 Bảng 3.12. Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein EGFR Methyl EGFR Đột biến EGFR M U p + - p 33 106 49 90 Biểu hiện EGFR - 21 36 0,002 20 37 0,973 + 12 70 29 53 Đột biến EGFR + 15 34 0,160 - 18 72 Kết quả phân tích cho thấy không có mối tương quan giữa đột biến gen với sự methyl vùng promoter và sự biểu hiện của protein EGFR. Ở nhóm bệnh nhân mang đột biến EGFR, 30,6% (15/49) trường hợp xảy ra hiện tượng methyl hóa EGFR và 59,2% (29/49) có biểu hiện protein EGFR. Trong khi đó ở nhóm không mang đột biến, 20,0% (18/90) có gen EGFR bị methyl hóa và 58,9% (53/90) biểu hiện protein bề mặt. Tuy nhiên, sự khác biệt trên không có ý nghĩ thống kê (p>0,05) (Bảng 3.12). Ngược lại, nghiên cứu chỉ ra có sự tương quan chặt chẽ giữa sự methyl hóa vùng promoter E