Luận án Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển anthenea sibogae và anthenea aspera của Việt Nam

LỜI CAM ĐOAN .i

LỜI CẢM ƠN.iv

MỤC LỤC.v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU.xi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .xii

MỞ ĐẦU.1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .2

1. 1. Giới thiệu về sao biển .2

1.1.1. Cấu tạo của sao biển và phân bố .2

1.1.2. Các loài sao biển ở Việt Nam.4

1.1.3. Họ sao biển Oreasteridae .5

1.2. Thành phần hóa học họ sao biển Oreasteridae.5

1.2.1. Steroid .6

1.2.2. Các dẫn xuất ceramide .21

1.3. Hoạt tính sinh học của sao biển.27

1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào .27

1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 31

1.3.3. Hoạt tính tán huyết . 31

1.3.4. Hoạt tính neuritogenesis (tạo tế bào thần kinh hình sợi). 32

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .33

2.1. Đối tượng nghiên cứu . 33

2.1.1. Sao biển Anthenea sibogae .33

2.1.2. Sao biển Anthenea aspera.34

2.2. Phương pháp nghiên cứu .35

2.2.1. Phương pháp phân lập các chất.35

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc .35

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học. 37

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .40

3.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea sibogae . 40

3.1.1. Xử lý mẫu sao biển A. sibogae .40

pdf225 trang | Chia sẻ: honganh20 | Ngày: 02/03/2022 | Lượt xem: 315 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển anthenea sibogae và anthenea aspera của Việt Nam, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
DCM/ MeOH (5/1) thu được hợp chất AA3 (1,02 g). Phân đoạn SDH9 được tách trên cột pha đảo RP18 (MeOH/H2O/NH4OH, 70/29/1) thu được hợp chất AA4 (15 mg). Phần cặn SDE được tách trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải chloroform/ methanol gradient (100/0 - 0/100) thu 9 phân đoạn kí hiệu SDE1-SDE9. Phân đoạn SDE3 được tách trên cột silica gel với dung môi rửa giải chloroform/methanol /nước (4/1/0,1) thu được 2 hợp chất: AA5 (48 mg) và AA6 (30 mg). Phân đoạn SDE7 tách trên cột silica gel với dung môi rửa giải chloroform/ methanol /nước (5/1/0,1) thu được 2 hợp chất AA7 (17 mg) và AA8 (33 mg). Cặn SDM được chạy sắc ký trên silica gel rửa giải với dichloromethane/methanol (10:0-8:2) thu 11 phân đoạn được ký hiệu SDM1-SDM11. Phần SDM7 đã chạy cột silica gel và tách rửa giải với hệ dichloromethane/metanol (10:0-9:1) thu được hợp chất AA9 (9 mg). Phần SDM4 đã chạy cột silica gel và tách rửa giải với hệ dichloromethane/metanol (10:0-9:1) thu được hợp chất AA10 (10 mg) và hợp chất AA11 (8 mg). 46 Hình 3.2. Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. aspera 47 3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được từ loài sao biển Anthenea aspera Hợp chất AA1: Cholesterol Tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 144-145 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): xem bảng 4.1 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): xem bảng 4.1 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA2: Lathosterol (Cholest-7,8-ene-3-ol) Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy là 126-127 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm):xem bảng 4.12 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm):xem bảng 4.12 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA3: Cholest-4-ene-3β,6β-diol Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy ở 243-245 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): bảng 4.13 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR(125 MHz, CDCl3)  (ppm):bảng 4.13 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA4: Cholestane 3,5,6,15,16,26-hexol Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy ở 256-258 0C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm):bảng 4.14 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): bảng 4.14 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA5: Cyclo(L-glycine-L-proline) Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 220-2220C. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): xem bảng 4.15 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): xem bảng 4.15 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA6: L-glycine-L-prolin Tinh thể hình kim không màu, tan trong methanol, không tan trong dichloromethane, Rf = 0,35 (DCM/MeOH: 85:15). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): xem bảng 4.16 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): xem bảng 4.16 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA7: Cyclo(L-alanine-4-hydroxyl-L-proline) Tinhthể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 232 0C. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): xem bảng 4.17 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): xem bảng 4.17 (phần kết quả và thảo luận). 48 Hợp chất AA8: L-Phenylalanine Chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 173 0C. 1H NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm):xem bảng 4.18 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): xem bảng 4.18 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA9: Tyramine Chấtbột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 1640C -165 0C. 1H NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): xem bảng 4.19 (phần kết quả và thảo luận). 13C NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): xem bảng 4.19 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA10: Thymine Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 3160C -317 0C. 1H-NMR và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): xem bảng 4.2 của hợp chất ASB2 (phần kết quả và thảo luận). Hợp chất AA11: Uracil Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 335-336 0C. 1H-NMR (DMSO-d6)  (ppm): xem bảng 4.20 (phần kết quả và thảo luận). 13C-NMR (DMSO-d6)  (ppm): xem bảng 4.20 (phần kết quả và thảo luận). 49 CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea sibogae Từ loài sao biển Anthenea sibogae đã phân lập 11 hợp chất trong đó có 6 chất steroid glycoside mới, các chất còn lại lần đầu tiên phân lập từ chi Anthenea. Bảng 4.1. Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Anthenea sibogae STT Tên chất Cấu trúc Ghi chú 01 Cholesterol (ASB1) - Lần đầu tiên phân lập từ chi Anthenea 02 Thymine (ASB2) 03 L-tyrosine (ASB3) 04 Tryptophan (ASB4) 05 Hợp chất (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl- -D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O- methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor- 5-cholesta -8(14),22(23)-diene- 3,6,7,16-tetraol (Anthenoside S1) (ASB5) Chất mới 06 Hợp chất (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl- -D-galactofuranosyl)-16-O-(4-O- methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor- 5-cholesta -8(14),22(23)-diene- 3,6,7,16-tetraol (Anthenoside S2)(ASB6) Chất mới 50 07 Hợp chất (20R)-7-O-(6-O-methyl-- D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O- methyl--D-glucopyranosyl)-5- cholesta-8(14),24(25)-diene-3,6,7, 16-tetraol (Anthenoside S3) (ASB7) Chất mới 08 Hợp chất (20R)-7-O-(6-O-methyl-- D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O- methyl--D-glucopyranosyl)-24- methyl-5-cholesta-8(14),24(28)- diene-3,6,7,16-tetraol (Anthenoside S4) (ASB8) Chất mới 09 Hợp chất (20R,20E)-16-O-(3-O- methyl--D-galactofuranosyl)-5- cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7, 16-tetraol (Anthenoside S5) (ASB9) Chất mới 10 Hợp chất (20R)-7-O-(6-O-methyl-- D-galactofuranosyl)-16-O-(-D- galactofuranosyl)-24-methyl-5- cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7, 16-tetraol (Anthenoside S6) (ASB10) Chất mới 11 Hỗn hợp Anthenoside J ((20R,24R)-7- O-(6-O-methyl-β-D-galactofura nosyl)-16-O-(6-Omethyl-β-D-galacto furanosyl)-24-ethyl-5α-cholest-8(14)- ene-3α,6β,7β,16α-tetraol) và Anthenoside K ((20R,24S)-7-O-(6-O- methyl-β-D-galactofuranosyl)-16-O- (6-O-methyl-β-Dgalactofuranosyl)- 24-ethyl-5α-cholest-8(14)-ene- 3α,6β,7β,16α-tetraol) (ASB11) - Lần đầu tiên phân lập từ chi Anthenea 51 4.1.1. Hợp chất ASB1: cholesterol Hợp chất ASB1 phân lập được dưới dạng các tinh thể hình kim, không màu, có điểm nóng chảy đo được là 146 0C. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB1 cho thấy có tín hiệu của 5 nhóm methyl trong đó có 2 tín hiệu singlet H 0,67 (3H, s, CH3-18); H 1,00 (3H, s, CH3-19) và 3 tín hiệu doublet H 0,86 (3H, d, J = 6,5 Hz); H 0,87 (3H, d, J = 6,0 Hz); H 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1 proton olefin (H 5,34 ppm ) và 1 nhóm CH-O (H 3,52 ppm). Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu của 27 nguyên tử cacbon trong đó có 5 nhóm methyl, 11 nhóm CH2, 8 nhóm CH trong đó có 1 CH olefin (C121,7 ppm) và 1 nhóm CH-O (C 71,7ppm), và 3 cacbon bậc 4 trong đó có 1 cacbon sp2 (C 140,7 ppm). Các dữ liệu này cho phép dự đoán hợp chất A là một steroid khung cholestane có 1 nối đôi và có 1 nhóm OH gắn với khung steroid. Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB1 52 Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB1 Hình 4.1.3. Phổ DEPT của hợp chất ASB1 53 Hình 4.1.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất ASB1 Hình 4.1.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB1 54 Hình 4.1.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB1 Phổ COSY 1H-1H (phụ lục I) cho phép xác định các hệ spin như trong hình dưới đây (in đậm): 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 HO 19 20 22 23 24 25 26 27 21 18 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 20 21 22 23 24 25 27 HO 19 18 26 Hình 4.1.7. Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY và HMBC của ASB1 Phân tích phổ HSQC (phụ lục I) cho phép gán các tín hiệu proton và cacbon tương ứng. Phổ HMBC (phụ lục I) cho thấy có tương tác giữa proton của Me-19 với C-1, C-9,và C-10; giữa H-4 với C(3)-OH, C-5, H-6 với C-4, C-5, C-10, và C-8; giữa proton Me-18 với C-12, C-13, C-14 và C-17; giữa H-15 với C-14, C-16; giữa proton Me-21 với C-17, C-20 và C-22; giữa H-24 với C-26,27, H-23 với C-24, H-26, H-27 với C- 24 và C-25. Các tương tác này cho phép liên kết các hệ spin để tạo thành khung steroid như trong hình 4.1.7. Ngoài ra, tương tác HMBC giữa H-4 với C(OH)-3 (C 71,7 ppm) và C-5 (C 140,7 ppm), H-6 (olefin) với C-4, C-5, C-10 và C-8 cho phép dự đoán hợp chất ASB1 có nhóm OH ở vị trí C-3 và nối đôi ở vị trí C-5, C-6. 55 Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASB1 với hợp chất cholesterol đã được phân lập trước đó [69] thì thấy hoàn toàn trùng khớp (bảng 4.2). Do đó có thể khẳng định ASB1 là hợp chất cholesterol với cấu trúc như hình 4.1.8. 2 3 4 5 10 1 6 7 89 14 13 12 11 15 16 17 HO 19 20 22 23 24 25 26 27 21 18 Hình 4.1.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB1 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của ASB1 và hợp chất tham khảo Vị trí δCa,b (ppm) δHa,c (mult., J = Hz) #δC (ppm) C δCa,b (ppm) δHa,c (mult., J = Hz) #δC (ppm) 1 37,2 1,83 (m); 1,10 (m) 37,2 15 24,3 1,54 (m); 1,51 (m) 24,2 2 31,6 1,53 (m); 2,09 (m) 31,5 16 28,2 1,85 ( m), 1,23 (m) 28,2 3 71,7 3,52 (1H, m) 71,4 17 56,1 1,12 (m) 56,1 4 42,3 2,26 (m) 42,2 18 11,8 0,67 (s) 11,8 5 140,7 - 140,5 19 19,4 1,00 (3s) 19,2 6 121,7 5,34 (m) 121,3 20 35,8 1,37 (m) 35,7 7 31,9 1,85 (m); 1,52 (m) 31,8 21 18,7 0,91 (d, 6,5) 18,7 8 31,9 1,44 (m) 31,8 22 36,2 1,33 (m); 1,00 (m) 36,1 9 50,1 0,94 (m) 50,0 23 23,8 1,05 (m); 1,11 (m) 23,8 10 36,5 36,4 24 39,5 1,10-1,15 (m) 39,4 11 21,1 1,43-1,51 (m) 21,0 25 28,0 1,49 (m) 27,9 12 39,7 2,00 (m) 39,7 26 22,5 0,87 (d, 6,5) 22,5 13 42,2 - 42,2 27 22,8 0,86 (d, 6,5) 22,7 56 14 56,7 1,00 (m) 56,6 aCDCl3, b125 MHz, c500 MHz, #δC số liệu của TLTK [69] 4.1.2. Hợp chất ASB2: Thymine Hợp chất ASB2 phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 316-317 0C. Phổ 1H-NMR của ASB2 có các tín hiệu của 1 proton thơm dạng singlet tại δH 7,24 ppm và của nhóm methyl tại δH 1,87 ppm. Hình 4.1.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB2 Trên phổ 13C-NMR của ASB2 có thể quan sát thấy các tín hiệu cộng hưởng của 5 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nguyên tử cacbon của 2 nhóm carbonyl tại C 167,5 (C-1) và 150,4 (C-4), 1 cacbon bậc 4 sp2 (C 110,4; C-2) 1 nhóm CH sp2 (C139,2; C-3) và 1 nhóm CH3 (C 12,1; C-5). 57 Hình 4.1.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB2 Phổ HSQC cho phép xác định các proton và cacbon liên kết trực tiếp như C(3)- H, C(5)-H3. Phổ HMBC xuất hiện tương tác giữa H-5 với C-2 (δC 110,4 ppm), C-3 (δC 139,2 ppm) và C-1 (δC 167,5 ppm). Ngoài ra còn có các tương tác giữa H-3 với C-5 (δC 12,1 ppm), C-4 (δC 150,3 ppm), C-2 (δC 110,4 ppm) và C-1 (δC 167,5 ppm). Các dữ kiện này gợi ý phân tử ASB2 có cấu trúc dạng vòng và có nhóm N-H bên cạnh CH-3. Hình 4.1.11. Phổ HSQC của hợp chất ASB2 58 Hình 4.1.12. Phổ HMBC của hợp chất ASB2 Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASB2 với hợp chất thymine đã được phân lập trước đó từ sao biển Acanthaster planci [71] thì thấy hoàn toàn trùng khớp (Bảng 4.3). Do đó có thể khẳng định ASB2 là hợp chất thymine với cấu trúc như hình 4.1.13. Đây là hợp chất thường tìm thấy trong các loài sao biển. Hình 4.1.13. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất ASB2 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của ASB2 và hợp chất tham khảo Vị trí #δc Cac Hab, mult (J = Hz) HMBC (HC) 1 164,9 167,5 - 2 107,7 110,4 - 3 137,7 139,2 7,24 s C-2, C-4, C-5 4 151,5 150,3 - 5 11,8 12,1 1,87 s C-1, C-2, C-3 aCD3OD, b500 MHz, c125 MHz,#δc số liệu của TLTK [70,71]. 59 4.1.3. Hợp chất ASB3: L-Tyrosine Hợp chất ASB3 phân lập được dưới dạng chất rắn màu trắng, nóng chảy tại 342 0C. Phổ 1H-NMR của ASB3 có các tín hiệu của 4 proton thơm dưới dạng 2 doublet tại H 6,72 (J = 8,0 Hz) và 7,05 (J = 8,0 Hz), 1 nhóm CH gắn với nitơ tại H 4,31 (dd, J = 8,0; 5,0 Hz) và 1 nhóm CH2 tại H 2,84 (dd, J = 8,5 Hz; 13,5 Hz); 3,06 (dd, J = 5,0 Hz; 14,0 Hz). Hình 4.1.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB3 Hình 4.1.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB3 Phổ 13C-NMR của ASB3 cho thấy phân tử hợp chất này có tín hiệu của 9 nguyên tử cacbon, trong đó có 1 nhóm C=O axit (C 175,5); 6 nguyên tử cacbon thơm 60 C 157,2 (C-7), 131,3 (C-6,C-8), 129,2 (C-4), 116,1 (C-5, C-9); 1 nhóm methin gắn với dị tử nito cộng hưởng ở 56,4 (C-2) và 1 nhóm methylen cộng hưởng ở 37,9 (C- 3). Các tín hiệu 1H và 13C-NMR cho thấy ASB3 có một vòng thơm thế 1,4 gắn với 1 nhóm CH2-CH-COOH. Ngoài ra độ dịch chuyển hóa học của C-7 cho thấy C-7 có gắn với nhóm OH. Do đó có thể dự đoán ASB3 là L-tyrosine. So sánh dữ liệu phổ NMR và điểm nóng chảy của ASB3 với dữ liệu công bố của L-tyrosine [72] thì thấy hoàn toàn trùng khớp. Vậy có thể khẳng định ASB3 là tyrosine. Hình 4.1.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB3 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của ASB3 và hợp chất tham khảo C #C Cac Hab (mult., J = Hz) 1 172,6 175,5 - 2 55,4 56,4 4,31 (dd, 8,0, 5,0) 3 35,9 37,9 2,84 (dd, 8,5, 13,5) 3,06 (dd, 5,0, 14,0) 4 126,8 129,2 - 5 117,2 116,1 7,05 (d, 8,0) 6 132 131,3 6,72(d, 8,0) 7 156,4 157,2 - 8 132 131,3 7,05 (d, 8,0) 9 117,2 116,1 6,72(d, 8,0) aCD3OD, b125 MHz, c500 MHz,#δc dữ liệu của TLTK [72]. 4.1.4. Hợp chất ASB4: L-Tryptophan ASB4 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 280-282 0C. Phổ1H-NMR của ASB4 có các tín hiệu của 5 proton trong vùng trường thấp bao gồm 1 doublet tại H 7,59 (J = 8,0 Hz, H-9), 1 doublet tại H 7,34 (J = 8,0 Hz, H-8), 61 2 triplet tại H 7,10 (tín hiệu chồng chập) và 7,025 (J = 7,5 Hz) (H-9, H-10), 1 singlet tại H 7,10 (H-5). Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng của 1 nhóm methin gắn với dị tử nito cộng hưởng ở H 4,45 (dd, J = 5,5; 7,0 Hz, H-2) và 1 nhóm CH2 tại H [3,33 (m) và 3,15 (dd, J = 7,5; 14,5 Hz); H-3]. Hình 4.1.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB4 Hinh 4.1.18. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB4 Phổ 13C NMR của ASB4 có tín hiệu cộng hưởng của 11 nguyên tử cacbon, trong đó có 1 nhóm C=O axit (C 175,9, C-1); 8 cacbon sp2 bao gồm C-7 (138,0), C- 62 6 (128,9), C-5 (124,4), 122,3, 119,7, 119,3, 112,2, 111,0 (C-4, C-8, C-9, C-10, C-11); 1 nhóm methin gắn với dị tử nito cộng hưởng ở 55,9 (C-2) và 1 nhóm methylen cộng hưởng ở 28,6 (C-3). Các dữ kiện này gợi ý cấu trúc của ASB4 là một amino acid có chứa hệ vòng thơm bao gồm 8 nguyên tử cacbon gắn với mạch nhánh có 3 nguyên tử cacbon. Khi so sánh các dữ liệu phổ NMR của ASB4 với L-tryptophan [73] thì thấy hoàn toàn trùng khớp. Do đó ASB4 được xác định là L-tryptophan. Hình 4.1.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB4 Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của ASB4 và hợp chất tham khảo C #C Cac Hab (mult., J = Hz) 1 175,8 175,9 - 2 56,3 55,9 4,45 (dd, 5,5, 7,0) 3 28,0 28,6 3,33 (m) 3,15 (dd, 7,5, 14,5) 4 122,5 122,3 - 5 125,1 124,5 7,10(s) 6 128,5 128,9 - 7 138,9 138,0 8 120,0 119,7 7,34(d, 8,0) 9 118,9 119,3 7,59 (d, 8,0); 7,10 (t, 8,0) 10 112,0 112,2 7,025 (t, 7,5) 11 109,0 110,0 aCD3OD, b125 MHz, c500 MHz,#δc số liệu của TLTK [73], 100 MHz. 4.1.5. Hợp chất ASB5: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O- (3-O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6, 7,16-tetraol (anthenoside S1, hợp chất mới) Hợp chất ASB5 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình, màu trắng, độ quay cực []D25 = -51,7 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử của ASB5 được xác 63 định là C40H66O14 từ kết quả phổ khối phân giải cao (+)HR-ESI-MS với pic [M + Na+] m/z 793,4346 (tính toán lý thuyết cho công thức C40H66O14Na là 793,4345). Hình 4.1.20. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB5 Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB5 có các tín hiệu của 5 nhóm methyl trong đó có 2 tín hiệu singlet của hai nhóm methyl góc tại δH 0,84 (s, H3-19) và 0,91 (s, H3- 18), 3 tín hiệu doublet của 3 nhóm methyl bậc 2 tại δH 0,97 (d, J = 6,7 Hz, H-27), 0,98 (d, J = 6,7 Hz, H-26) và 1,10 (d, J = 7,0 Hz, H-21); 4 nhóm oxymethine tại δH 3,64 (t, J = 2,8 Hz, H-6), 4,08 (m, H-3), 4,23 (d, J = 2,8 Hz, H-7) và 4,63 (td, J = 9,0, 5,0 Hz, H-16); 2 nhóm methoxy tại δH 3,38 (s, OMe-6”) và 3,63 (s, OMe-3’). Tại vùng trường thấp hơn có 2 tín hiệu proton olefin tại δH 5,30 (dd, J = 15,3, 6,8 Hz, H-23) và 5,74 (ddd, J = 15,3, 8,8, 1,2 Hz, H-22). Ngoài ra có xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 2 proton anomer của hai gốc đường tại δH 4,33 (d, J = 7,7 Hz, H-1′) và 5,02 (d, J = 2,0 Hz, H-1′′) cùng với các tín hiệu của 10 nhóm CH-O trong vùng δH 3,09-3,91. Phổ 13C-NMR của ASB5 cho thấy sự có mặt của 40 nguyên tử carbon trong phân tử trong đó có 5 carbon methyl cộng hưởng tại δC 15,5 (C-19), 20,3 (C-18), 23,1 (C-27), 23,2 (C-26) và 23,8 (C-21); 2 carbon methoxy tại δC 59,4 (OMe-6”) và 61,0 (OMe-3’); 4 carbon sp2 tại δC 126,6 (C-8), 133,9 (C-22), 137,2 (C-23) và 147,6 (C- 14); 14 tín hiệu carbon oxymethine trong vùng δC 63-87,9 ppm và 2 tín hiệu carbon anomer tại δC 102,9 (C-1’) và 108,4 (C-1”). Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR tương ứng 186.9952 226.9878 268.9983 301.1409 1+ 385.2349 1+ 441.2974 1+ 617.3659 659.2872 793.4346 1+ +MS, 2.4min #140 0 1 2 3 6x10 Intens. 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z 64 với các tín hiệu trên phổ 13C-NMR được xác định dựa trên các tương tác trên phổ HSQC (kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.6). Hình 4.1.21. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB5 Hình 4.1.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB5. Kết hợp các dữ liệu phổ (+)-HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán ASB5 là một tetrahydroxysteroid glycoside với phần aglycon có 2 nối đôi và gắn với 65 2 phân tử đường. Độ rộng của tín hiệu multiple được dự đoán là của H-3 vào khoảng 12 Hz, tương ứng với cấu hình 3-OH (độ rộng của tín hiệu ứng với cấu hình 3-OH thường lớn hơn 30 Hz) [74]. Mặt khác độ dịch chuyển hóa học proton và cacbon của các nhóm CH3-18, CH3-19, CH-3, CH-6, CH-7 và CH-16 của ASB5 có giá trị gần tương tự với dữ liệu công bố của các nhóm tương ứng trong phân tử anthenoside R với phần cấu trúc aglycon là 8(14)-3,6,7,16-tetrahydroxy-steroid bị glycoside hóa tại C-7 và C-16 [74] (bảng 4.6). Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY của phần aglycon cho phép xác định các hệ spin giữa các proton: H-1 (δH1,53; 1,30)/H-2 (δH 1,62)/H-3 (δH 4,08)/H-4 (δH1,96; 1,37)/H-5 (δH 2,12)/H-6 (δH 3,64); H-11 (δH1,65; 1,53)/H-12 (δH1,82; 1,25); H-15 (δH2,86; 2,64)/H-16 (δH 4,63)/H-17 (δH 1,53)/H-20 (δH 2,40)/H-21 (δH 1,10); H- 20/H-22 (δH 5,74); H-23 (δH 5,30)/H-25 (δH 2,26)/H-26,27 (δH 0,97, 0,98). Từ đó có thể xác định được vị trí các nhóm OH tại C-3, C-6, C-7, C-16 và có 1 nối đôi tại C- 22/C-23. Đồng thời, giá trị hằng số tương tác JH-22/H-23 = 15,3 Hz cho thấy liên kết đôi C-22/C-23 có cấu hình trans. Phổ HMBC của phần aglycon cho thấy các tương tác giữa proton của 2 nhóm methyl góc với các cacbon lân cận, cụ thể là: H-18/C-12, C-13, C-14, C-17; H-19/C- 1, C-10, C-9. Ngoài ra còn có các tương tác giữa H-6/C-10, C-8 (C 126,6), H-18/C- 14 (C 147,6), H-15/C-8, C-14, C-13. Đồng thời, phổ HSQC cho thấy 2 cacbon sp2 là tại C 126,6 (C-8) và 147,6 (C-14) là cacbon bậc 4 do không có tương tác với proton nào. Kết hợp các dữ kiện này có thể khẳng định vị trí của nối đôi trong hệ đa vòng tại C-8/C-14. Tương tác HMBC của phần mạch nhánh giữa proton H-21 (H 1,10) với C-22 (C 133,9); H-22 (H 5,74)/C-25 (CH, C 32,3); H-23 (H 5,30)/C-20, C-25, C- 26, C-27, cùng với các dữ liệu phổ NMR và HRMS nói trên cho phép khẳng định mạch nhánh của ASB5 thiếu 1 cacbon (C-24) so với mạch nhánh của khung cholestane, và có nối đôi ở vị trí C-22/C-23. 66 Hình 4.1.23. Phổ COSY của hợp chất ASB5. Hình 4.1.24. Phổ HSQC của hợp chất ASB5 67 Hình 4.1.25. Phổ HMBC của hợp chất ASB5 Tương tác trên phổ ROESY giữa H-18/H-20, H-21/H-12 và H-22/H-16 gợi ý cấu hình tuyệt đối của C-20 là R. Theo các tài liệu công bố [75], độ dịch chuyện hóa học H của H-21 thuộc khung steroid là 1,10 ppm đối với cấu hình 20R-22 (trường hợp của ASB5) và là 1,00 ppm đối với cấu hình 20S-22. Do đó có thể khẳng định ASB5 có mạch nhánh với cấu hình 20R. Các tương tác ROESY chìa khóa giữa H-19/H-2, H-4, H-11; H-18/H-12, H-15, H-16; H-5/H-1, H-9; H-6/H-4, H-7/H-15, cùng với các giá trị của hằng số tương tác của H-6, H-7 và H-16 cho phép khẳng định cấu hình tương đối 3,6,7,16 của các nhóm OH và cấu hình 5/9/10/13 của nhân steroid. Tổng hợp tất cả các dữ liệu phổ đã phân tích, có thể xác định phần cấu trúc aglycon của ASB5 là (20R,22E)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol. Các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton anomer (δH 4,33 và 5,02) có tương tác trên phổ HSQC tương ứng với 2 carbon lần lượt tại δC 102,9 và 108,4. Phổ (+)-ESI- MS/MS của pic ion [M+Na]+ tại m/z 793 cho các mảnh pic ion tại m/z 599 ([(M+Na)- C7H14O6]+) và 217 ([C7H14O6+Na]+). Phổ (-)-ESI-MS/MS của pic ion [M-H]- tại m/z 769 cho các mảnh pic ion tại 575 ([(M-H)-C7H14O6]- và 193 ([C7H13O6]-). Các pic 68 này tương ứng với việc mất một gốc O-methyl-hexose. Độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác của H-1 đến H-6 của 2 đơn vị đường O-methyl-hexose được xác định bằng cách chiếu xạ các proton anomer trong thí nghiệm TOCSY 1D. Ngoài ra, các tín hiệu proton và cacbon của các đơn vị monosaccharide của ASB5 được xác định nhờ các phổ NMR 2D như COSY, HSQC và HMBC (hình 4.1.27, bảng 4.6). Các giá trị của độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác của hai đơn vị đường này hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu công bố về các chất có hai gốc đường cuối mạch là 3-O-methyl--glucopyranosyl và 6-O-methyl--galactofuranosyl [74]. Hình 4.1.26. Phổ ROESY của hợp chất ASB5 69 Hình 4.1.27. Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chìa khóa của hợp chất ASB5 Hình 4.1.28. Phổ 1D TOCSY của hai đơn vị đường Phản ứng thủy phân ASB5 bằng TFA 2M, sau đó cho các phân tử đường tác dụng với (R)-(-)-2-octanol và sau đó acetyl hóa, phân tích bằng GC và so sánh với thời gian lưu với các dẫn xuất acetyl (-)-2-octyl glycoside của các monosaccharide chuẩn, cho phép xác định cấu hình D của hai đơn vị đường 3-O-methyl-- glucopyranose và 6-O-methyl--galactofuranose trong phân tử ASB5. Vị trí gắn hai đơn vị đường nói trên với phần aglycon được xác định nhờ phổ HMBC và ROESY, từ các tương tác giữa H-1’ của 3-OMe-Glcp và C-16 và H-16 của phần aglycon, giữa H-1” của 6-OMe-Galf với C-7 và H-7 của phần aglycon quan sát được trên phổ. Mặt khác các dữ liệu phổ proton và cacbon của ASB5 gần như trùng khớp với dữ liệu phổ của hợp chất anthenoside R, chỉ khác là ASB5 thiếu mất một nhóm CH2 (C-24) so với anthenoside R dẫn đến các giá trị độ dịch chuyển hóa học của mạch cacbon từ C-22 đến C-27 thay đổi nhẹ. Dựa trên tất cả các dữ kiện trên, cấu trúc của ASB5 được xác định là (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofura nosyl)-16-O- 70 (3-O-methyl--D-glycopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene- 3,6,7,16-tetraol. Đây là hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là anthenoside S1. Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của ASB5 và hợp chất tham khảo Vị trí #δCa,b δCa,b #δHa,b(mult., J = Hz) δHa,c (mult., J = Hz) 1 34,6 34,6 1,53 (m)/1,30 (m) 1,53 (m)/1,30 (m) 2 29,7 29,6 1,61 (m) 1,62 (m) 3 67,5 67,5 4,07 (m) 4,08 (m) 4 33,3 33,3 1,96 (td, 14,0, 3,0) 1,37 (br dd, 14,0, 3,0) 1,96 (td, 14,0, 2,8) 1,37 (br d, 14,0) 5 38,0 38,0 2,12 (dt, 14,0, 3,0) 2,12 (dt, 14,0, 2,8) 6 75,2 75,2 3,62 (m) 3,64 (t, 2,8) 7 78,6 78,5 4,23 (d, 2,6) 4,23 (d, 2,8) 8 126,7 126,6 - - 9 46,0 45,9 2,26 (m) 2,26 (m) 10 38,9 38,8 - - 11 19,5 19,5 1,65 (m)/1,53 (m) 1,65 (m)/1,53 (m) 12 37,2 37,2 1,81 (dt, 12,2, 3,2) 1,25 (m) 1,82 (dt, 12,5, 3,3) 1,25 (m) 13 45,4 45,4 - 14 147,6 147,6 - 15 34,5 34,3 2,86 (ddd, 17,5, 9,0, 3,2) 2,64 (ddd, 17,5, 5,0, 2,1) 2,86 (ddd, 17,0, 9,0, 2,8) 2,64 (ddd, 17,0, 5,0, 2,1) 16 79,6 79,2 4,62 (td, 9,0, 5,0) 4,63 (td, 9,0, 5,0) 17 62,8 62,8 1,53 (m) 1,53 (dd, 9,0, 4,0) 18 20,2 20,3 0,91 (s) 0,91 (s) 19 15,4 15,5 0,84 (s) 0,84 (s) 20 37,3 37,2 2,41 (m) 2,40 (m) 21 24,0 23,8 1,11 (d, 6,9) 1,10 (d, 7,0) 71 22 138,1 133,9 5,79 (dd, 15,3, 9,0) 5,74 (ddd, 15,3, 8,8, 1,2) 23 128,8 137,2 5,34 (dd, 15,3, 7,3) 5,30 (dd, 15,3, 6,8) 24 43,2 1,91 (m) - 25 29,9 32,3 1,59 (m) 2,26 (m) 26 22,9 23,2 0,88 (d, 6,7) 0,98 (d, 6,7) 27 22,9 23,1 0,89 (d, 6,7) 0,97 (d, 6,7) 3-OMe-β-D-Glcp 1′ 103,1 102,9 4,33 (d, 7,9) 4,33 (d, 7,7) 2′ 75,2 75,2 3,23 (dd, 9,2, 7,9) 3,23 (dd, 9,3, 7,7) 3′ 87,9 87,9 3,09 (t, 9,2) 3,09 (t, 9,3) 4′ 71,6 71,5 3,38 (m) 3,36 (t, 9,3) 5′ 77,7 77,8 3,27 (ddd, 10,0, 5,4, 2,6) 3,27 (ddd, 9,3, 5,5, 2,5) 6′ 63,2 63,2 3,88 (dd, 11,7, 2,6) 3,72 (dd, 11,7, 5,4) 3,88 (dd, 11,6, 2,5)/ 3,70 (dd, 11,6, 5,5) 3′- OMe 61,0 61,0 3,63 (s) 3,63 (s) 6-OMe-β-D-Galf 1′′ 108,5 108,4 5,02 (br d, 2,1) 5,02 (d, 2,0) 2′′ 83,3 83,4 3,90 (m) 3,90 (dd, 3,7, 2,0) 3′′ 78,8 78,7 3,94 (dd, 6,0, 3,7) 3,94 (dd, 6,2, 3,7) 4′′ 85,1 85,0 3,91 (m) 3,91 (m) 5′′ 70,8 70,8 3,83 (ddd, 7,1, 4,6, 2,0) 3,82 (ddd, 7,0, 5,2, 3,4) 6′′ 75,5 75,5 3,52 (m) 3,

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc_hai_loai_sa.pdf
Tài liệu liên quan