Luận án Nghiên cứu khả năng sinh enzym protease của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Nhỏ 0,1ml (2giọt) dung dịch ở mỗi nồng độ lên hộp petri có chứa môi trường (MT2). Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục sang đĩa MT 2 và 3. Sau đó, ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Tách các KL riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cuối cùng, cấy giống sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của NS [32], [43]. c. Yêu cầu Các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết. 2.2.1.3 Giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng a. Nguyên tắc: Tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của NS . b. Tiến hành Cho 0,2 ml dầu khoáng (như paraffin lỏng hay vazơlin) vào ống eppendoff, khử trùng bằng cách hấp ở 1210C trong 30 phút, để nguội. Nuôi cấy NS đạt đến độ trưởng thành. Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng BT cho vào ống eppendoff, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện lạnh 4- 6 0C [32]. 2.2.1.4 Quan sát hình thái NS * Quan sát đại thể NS NS sau khi cấy chuyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng. - Dùng que cấy lấy một ít BT của NS từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm trên chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2, 3 hộp. Lưu ý không để điểm chấm loang trên mặt thạch. - Nuôi cấy NS trong tủ ấm 3-7 ngày rồi quan sát.và mô tả các đặc điểm KL: + Hình dạng, kích thước KL. + Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL. + Giọt nước đọng, mùi, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL …[5] * Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch (J.T.Dunean ) Chuẩn bị MT thích hợp (YEA), đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2. Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hoặc giấy thấm) nước vô trùng. Đặt khối thạch lên phiến kính. Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp petri có sẵn bông (hoặc giấy thấm) được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C. Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản để quan sát hình thái NS. Quan sát dưới vật kính 40, 100 và mô tả các đặc điểm: + Giá BTT, thể bình và cuống thể bình. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai. 2.2.1.5. Hoạt tính enzym ngoại bào của NS [30] a. Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzym của NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt quanh KL b.Tiến hành  Phương pháp cấy chấm điểm Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT6, MT7, MT8, MT9, MT10. Cấy chấm điểm các chủng NS lên bề mặt MT ( 3 điểm/ hộp) Ủ các hộp petri trên trong tủ ấm 300C trong 3-5 ngày. c. Kiểm tra kết quả Kiểm tra họat tính xellulase, amylase, kitinase. Cả ba loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch: - Nếu NS có hoạt tính xellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL do cellulose bị phân giải. Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt. - Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL . Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm - Nếu NS có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giả có màu nâu đỏ nhạt Kiểm tra hoạt tính protease : Dùng HgCl2 10% nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu NS sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa. d. Đánh giá khả năng tạo enzym Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.1.6 Khả năng chịu mặn của NS [6] a. Nguyên tắc Mỗi loài NS thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện khả năng sinh trưởng và hoạt tính protease khác nhau. b. Tiến hành Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%. Cấy 3 điểm các chủng NS nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối khác nhau. Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 280 – 300C. Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl. c. Kết quả Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng NS nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng. Thử hoạt tính enzym ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 ứng với từng nồng độ muối. 2.2.1.7 Khả năng phân giải dầu [21]. Cấy NS trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml MT khoáng MT8. Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó đo sinh khối của NS, sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải của NS. Sau khi nuôi cấy 15 ngày, tiến hành quan sát bình tam giác. Nếu NS sinh trưởng được có nghĩa NS đó có khả năng phân giải dầu, ngược lại NS chết thì NS đó không có khả phân giải dầu. 2.2.1.8. Kiểm tra hoạt tính kháng sinh (Egorov và cộng sự, 1969) [19]. a. Nguyên tắc Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất kháng sinh thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. b. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và các MT thích hợp, không dùng nước biển mà dùng nước cất thay thế. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có chủng NS cần thử hoạt tính kháng sinh. Đặt các khối thạch vào đĩa petri có MT đã cấy VSV kiểm định. c. Kiểm tra kết quả Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Xác định hoạt độ protease [16] Định nghĩa Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn ( 35,50C, pH 7.6) Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất là casein( hoặc hemoglobin), sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt độ protease. Hóa chất: Dung dịch Na2HPO41/15M: hòa tan 5,96g Na2HPO4 . 12H2O trong nước thành 250ml. Dung dịch KH2PO4 1/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177mldung dịch Na2HPO41/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đo và chỉnh lại pH cho đúng . Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm Sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng Sorensen cho đủ 100ml. Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 500ml. Dung dịch tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosine trong dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l: pha loãng 5ml tyrosine 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml. Tiến hành: Dựng đường chuẩn tyrosine: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Dung dịch HCl 0,2N 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 Lượng tyrosine (micromole) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆ OD) theo lượng tyrosine ở các ống. Xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu: Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Casein 1%(ml) 5 5 TCA 10%(ml) 0 5 Dịch enzym mẫu (ml) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,50C trong 30 phút. TCA 10%(ml) 5 0 Dịch enzym mẫu (ml) 0 1 Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử folin 0.6 0.6 Lắc đều và để 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm Cách tính: Hoạt độ protease: Hoặc HT (UI) = mvT KVX .. .. (UI/g) X: số µ mol tyrosine suy ra từ đường chuẩn V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng (11ml) v: thể tích lọc đem phân tích (1ml) K: độ pha loãng mẫu T: thời gian phản ứng (phút) m: Khối lượng mẫu enzim đem xác định hoạt tính (g) 1UI (Anson) = 1 micromol tyrosine/ml/ phút hoặc = 1 micromol tyrosine / g /phút 2.2.2.2 Phân loại NS bằng Di truyền phân tử Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại 1 trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel agarose 2%. Giải trình tự sản phẩm này và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gen NCBI để định danh NS. Tiến hành  Ly trích DNA và nhân bản Lấy một lượng mẫu NS khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendoff. Cho thêm 180 µl TE1X và 20 µl proKprep rồi đem ủ ở 56oC qua đêm vT KVX UIHT . .. )(  (UI/ml) Thêm 500 µl Phenol Buffer và 500 µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 100oC trong 15 phút. Sau đó cho thêm 250 µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex. Ly tâm 14.000 vòng / phút trong 10 phút. Hút 450 µl dịch nổi sang một tube eppendoff mới. Sau đó thêm vào 500 µl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ -20oC trong 1 – 2 giờ. Ly tâm 14.000 vòng / phút ở 4oC trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi. Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500 µl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3 – 4 lần. Ly tâm 14.000 vòng / phút trong 15 phút rồi đổ bỏ dịch nổi Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10 – 15 phút. Hòa tan cặn DNA trong 50 µl TE1X. Lấy 5 µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR - Bước 1 ( biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao thường khoảng 950C, trong vòng 30 giây đến 1 phút. - Bước 2 (lai) : nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30 giây đến 1 phút. - Bước 3( tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất . Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến 1 phút.  Giải trình tự gen Nhằm xác định trình tự nucleotit dựa vào 2 phương pháp: - Phương pháp hóa học: ( phương pháp Maxam và Gilbert) : dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA. tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotit - Phương pháp enzym học ( phương pháp Sanger và phương pháp cải biên): Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzym DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotit cùng với các deoxynucleotit thông thường. Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotit Phân tích kết quả: Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% hoặc điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Sản phẩm PCR có độ dài là 260 bp. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và tiến hành giải trình tự gen 28 S rARN và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và loài của chủng nghiên cứu. Hình sau đây minh họa kết quả Fungi PCR được điện di trên gel agarose 2% 2.2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng NS a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ [18] - Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự sinh trưởng của chủng NS nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 trong đó glucose lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon khác như: lactose, sucrose, maltose, sorbitol. Trọng lượng các chất thay thế được lấy bằng lượng cacbon trong MT1. Mẫu đối chứng là MT1. - Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ, chúng tôi dùng MT1, thay NaNO3 bằng các nguồn nitơ khác : bột đậu, cao thịt, casein, NH4NO3. với lượng tương tự. Mẫu đối chứng là MT1. Cách tiến hành: Cấy chấm điểm NS nghiên cứu lên bề mặt các MT tương ứng để tủ ấm trong 3 ngày, đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon và nitơ của chủng nghiên cứu. Quy ước: d = 0 mm : không mọc d= 1- 2mm : mọc yếu d= 2,1- 5 mm : mọc trung bình d= 5,5 – 10 mm : mọc tốt d= 11- 30 mm : mọc rất tốt b. Ảnh hưởng của pH [18] Để xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của NS nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 và điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hoặc HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 7.0, 7.5, 8.0 . Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm NS, nuôi đạt đến độ trưởng thành và đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng của chủng ứng với từng pH khác nhau. c. Ảnh hưởng của nhiệt độ[18] Sử dụng MT1, cấy chấm điểm các chủng NS, nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C. Khi NS đạt đến độ trưởng thành tiến hành đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng. 1 3 2 4 5 6 7 MK d. Ảnh hưởng của thời gian [18] Sử dụng MT1, cấy chấm điểm các giống NS nghiên cứu. sau đó ủ trong tủ ấm ở các thời gian khác nhau: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ. Đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng. e. Ảnh hưởng của độ mặn Sử dụng MT2 có bổ sung muối NaCl với các nồng độ khác nhau từ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, . Mẫu đối chứng nuôi trên MT không có NaCl Cấy chấm điểm chủng nấm nghiên cứu lên lên các MT có nồng độ muối khác nhau. Nuôi đạt đến độ trưởng thành và đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng chịu mặn. 2.2.2.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng NS [4][18] a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Nhằm chọn MT thích hợp nuôi NS sinh protease, chúng tôi chọn các MT ký hiệu M1, M2, M3, M4, M5 để khảo sát quá trình nuôi cấy chủng NS . - Môi trường M1 (MT đối chứng) gồm: Cám : trấu : đậu nành tỉ lệ :70 : 25 : 5% - Môi trường M2 gồm: Cám : trấu : casein - tỉ lệ 70: 25: 5% - Môi trường M3 gồm: Cám : trấu - tỉ lệ 70: 30%: - Môi trường M4: cám : trấu : cao nấm men - tỉ lệ 70: 25: 5% - MT5: Cám: trấu: cao thịt –tỉ lệ 70: 25: 5% Độ ẩm các MT 60%, nhiệt độ 300C Chủng NS được nuôi đạt đến độ trưởng thành, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ dịch nuôi cấy ứng với từng loại MT trên bằng phương pháp Anson b. Ảnh hưởng của thời gian Để xác định thời gian thích hợp cho quá trình tổng hợp protease, tiến hành nuôi chủng NS trên MT đã chọn trong các khoảng thời gian khác nhau: 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60giờ, 72 giờ. Sau đó, xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson c. Ảnh hưởng của pH Để xác định pH thích hợp cho quá trình tổng hợp protease. Chúng tôi nuôi chủng NS trên MT đã chọn dùng HCL 5% hoặc NaOH 5%, điều chỉnh pH MT về các độ pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ dịch nuôi cấy ứng với từng pH bằng phương pháp Anson d. Ảnh hưởng của nhiệt độ Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình tổng hợp protease. Nuôi chủng NS trên MT đã chọn ở các nhiệt độ khác nhau: 200C , 250C, 300C, 350C, 400C, 450C khi đạt đến độ trưởng thành, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson e. Ảnh hưởng của độ mặn Để xác định độ mặn thích hợp cho quá trình tổng hợp protease . Chúng tôi nuôi chủng NS trên MT đã chọn với các nồng độ muối khác nhau: 0%, 1%, 2%, 3%, 4% 5%, 6%, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson. f. Ảnh hưởng của độ ẩm Để xác định độ ẩm thích hợp cho quá trình tổng hợp protease. Chúng tôi nuôi chủng NS trên MT đã chọn điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độ ẩm: 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson. 2.2.3 Động thái quá trình tổng hợp protease Từ các điều kiện tối ưu sẽ tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt lực của enzym protease. 2.2.4 Khảo sát một số đặc tính của enzym thô thu được từ chuûng NS a. Tách và thu nhận protease Tiến hành tủa với các tác nhân : ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh.  Tác nhân tủa là aceton và ethanol 960 Nguyên tắc: Dung môi hữu cơ bổ sung vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là làm protein mất nước và tạo tủa. Tiến hành: Bước 1: Thu dịch enzym từ canh trường nuôi cấy NS giữ lạnh dịch enzym và dung môi hữu cơ ( aceton, ethanol 960) sao cho nhiệt độ đạt từ 0 – 40C. Khảo sát với tỷ lệ Ethanol: tỉ lệ 1:3 ( dung dịch enzym: cồn) Aceton: tỉ lệ 1:2 ( dung dịch enzym : aceton) Bước 2: Tiến hành tủa: Cho từ từ dung môi hữu cơ vào dung dịch enzym và khuấy đều, giữ ở nhiệt độ lạnh 30 – 45 phút, ly tâm 4500 vòng / phút trong 15 phút thu tủa, sấy khô ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh.  Tác nhân tủa là muối sulfate amon (NH4)2SO4 Nguyên tắc: Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa. Tiến hành: Bước 1: Thu dung dịch enzym từ dịch nuôi cấy Bước 2: Tiến hành tủa: Cho muối vào dung dịch enzym tỉ lệ 1:3 rồi khuấy đều, giữ ở nhiệt độ phòng 45 – 60 phút, ly tâm 4500vòng/ phút trong 15 phút, thu tủa. Bước 3: Chế phẩm enzym thô thu được còn lẫn nhiều muối. Thẩm tách qua màng thẩm tách là phương pháp dùng để tách các phân tử muối ra khỏi protein. Màng này chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ ( muối, đường...) khuyếch tán qua màng và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn ( protein, enzym). Màng thẩm tách thường làm bằng collodion hay celophan. Bước 4: Sấy khô chế phẩm enzym ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh. Hiệu suất thu nhận H = m/v Trong đó: m là khối lượng enzym thu được sau khi tủa V là thể tích dung dịch có chứa enzym trước tủa tính bằng ml. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzym Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu,sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50 ,60, 70, 800C. c. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của enzym Dịch enzym thu được xử lí ở các nhiệt độ khác nhau 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100oC trong pH thích hợp. Sau đó xác định hoạt độ . Độ bền enzym được tính bằng số % hoạt độ còn lại trong các dịch đã xử lý nhiệt độ, đối chứng là hoạt độ của dịch enzym không xử lý nhiệt độ và giữ ở nhiệt độ 4oC. d. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của enzym Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu, sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các khoảng thời gian khác nhau:10’, 20’,30’, 40’, 50’, 60’, 70’, 80’, 90’, 100’ e. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzym Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu, sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các khoảng pH khác nhau: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 2.2.5. So sánh hoạt độ protease của chủng A. oryzae với chế phẩm protease trên thị trường. Tiến hành khảo sát với 0,1g chế phẩm enzym protease của A. oryzae và enzym protease ngoài thị trường, mỗi loại hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ enzym protease bằng phương pháp Anson trong cùng một điều kiện nhiêt độ, pH, thời gian phản ứng. 2.3 Phương pháp toán học Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản - Phương pháp tính giá trị trung bình  : Giá trị trung bình n lần thí nghiệm. Xi : Giá trị lần thí nghiệm thứ i n : Số lần lặp lại thí nghiệm - Phương pháp tính khoảng ước lượng Trong đó: tα tra bảng phân phối student với n –1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng hai phía. Sn +2(X) là phương sai mẫu. Sn +2(X) = 1/(n-1)∑ (Xi - )2 a =  ± tα S + 2n (X) √n CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu theo hai cách: truyền thống và sử dụng MT có chất cảm ứng để phân lập NS. Kết quả thu 333 chủng và được trình bày ở bảng sau: Bảng 3.1 Kết quả phân lập NS từ RNM Cần Giờ Nguồn cơ chất Số lượng chủng NS Tỷ lệ % Đất: - Đất mặt - Đất sâu 10 cm 66 45 21 .9% 13.5% 6.3% Lá: - Lá vàng - Lá mục 75 25 50 22.5% 7.5% 15.01% Thân: - Thân khô - Thân mục 91 31 70 27.3% 3.9% 23.4% MT có chất cảm ứng 101 30.3% Từ kết quả ở bảng trên cho thấy khu hệ NS ở RNM Cần Giờ rất phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên thân, lá, đất mặt, đất sâu 5- 10cm. Trong đó, ở MT có chất cảm ứng số chủng NS nhiều nhất (101/333) chiếm 30.3% tổng số chủng phân lập được. Số chủng NS sống trên lớp đất mặt, trên lá mục và trên thân mục nhiều hơn lớp đất sâu. Điều này có thể giải thích vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc. Hơn nữa, đây là những nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn dồi dào nhất do xác lá, thân, cành cây, xác các động vật như tôm, cua, giáp xác,….đang bị phân hủy [22] . Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả khi phân lập NS tại RNM như Mai Thị Hằng ( 2000), Khưu Phương Yến Anh (2007), Phan Thạnh Phương (2004). Võ Thị Bích Viên (2009) 3.2 Khảo sát và tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao. * Tuyển chọn lần 1 Để kiểm tra khả năng sinh protease của 333 chủng NS đã phân lập được chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.1.5. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Khả năng sinh protease của 333 chủng NS phân lập từ RNM STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 1 C-Ư16 20 75 C-Ư64 12 149 TK208 9 2 C-Ư16.2 17 76 C-Ư60 15 150 TK5 2 3 C-Ư9 20 77 C-Ư71 11 151 TM6 9 4 C-Ư25.1 21 78 C-Ư72 10 152 TM8 6 5 C-Ư13 11 79 C-Ư75 1 153 TM162 11 6 C-Ư20.1 20.5 80 C-Ư61 16 154 TM153 3 7 C-Ư32 25 81 C-Ư36 17 155 TM186 2 8 C-Ư3 12 82 C-Ư47 17 156 TM200 4 9 C-Ư20 20 83 C-Ư46 22.5 157 TM221 2 10 C-Ư24.1 16 84 C-Ư37 15 158 TM216 1 11 C-Ư1 8 85 C-Ư5.2 15 159 TM165 1 12 C-Ư56 14 86 C-Ư69 16 160 TM179 1 13 C-Ư68 26 87 C-Ư74 2 161 TM120 7 14 C-Ư36.1 16 88 C-Ư73 2 162 TM212 9 15 C-Ư23 13 89 C-Ư51 15 163 TM135 4 16 C-Ư8 16 90 C-Ư58 14 164 TM232 1 17 C-Ư20.2 17 91 C-Ư25.1 4 165 TM228 14 18 C-Ư16.1 15 92 C-Ư70.1 16 166 TM214 6 19 C-Ư24.1 13 93 C-Ư43 6 167 TM342 2 20 C-Ư25.2 19 94 C-Ư21 2 168 TM217 24 21 C-Ư29 18 95 C-Ư 11 169 TM215 2 22 C-Ư41 11 96 C-Ư27 7 170 TM221 3 23 C-Ư45 14 97 C-Ư28 5 171 TM150 4 24 C-Ư70 16 98 C-Ư67 17 172 L6 12 25 C-Ư35.1 17 99 C-Ư10 1 173 L90 0.5 26 C-Ư44 16 100 C-Ư30 2 174 L72 3 27 C-Ư50 18 101 C-Ư2 4 175 L67 0.5 28 C-Ư63 11 102 Đ238 24.5 176 L89 0.5 29 C-Ư35 17 103 Đ239 12 177 L91 6 30 C-Ư39 15 104 Đ242 17 178 L66 11 31 C-Ư29.2 12 105 Đ272 18 179 L74 12 32 C-Ư15 9 106 Đ267 3 180 L60 6 33 C-Ư14.1 13 107 Đ240 12 181 L76 9 34 C-Ư14 12 108 Đ246 13 182 L60.1 15 35 C-Ư12 1 109 Đ24 3 183 L90.1 6 36 C-Ư7 8 110 Đ244 2 184 L67.1 7 37 C-Ư3 9 111 Đ279 8 185 L3 6 38 C-Ư29.1 6 112 Đ48 2 186 L69 14 39 C-Ư33 12 113 Đ269 11 187 L63. 13 40 C-Ư4 3 114 Đ7 14 188 L77 12 41 C-Ư6 7 115 Đ100 11 189 L95 14 42 C-Ư31 1 116 Đ11 4 190 L87 11 43 C-Ư11 15 117 Đ10 6 191 L63.1 14 44 C-Ư17 5 118 Đ273 7 192 LM122 2.5 45 C-Ư18 2 119 Đ2 18 193 LM108 4.5 46 C-Ư5.1 12 120 Đ9 3 194 LM120 47 C-Ư90 2 121 ĐS77 12 195 LM122.1 15.5 48 C-Ư81 7 122 ĐS79 13 196 LM138 13 49 C-Ư89 16 123 ĐS266 4 197 LM125 12.5 50 C-Ư83 8 124 ĐS253 7 198 LM89 17 51 C-Ư82 14 125 ĐS253.1 4 199 LM131 16 52 C-Ư85 15 126 ĐS46 3 200 LM136 15 53 C-Ư88 18 127 ĐS46.1 12 201 LM137 11 54 C-Ư84 11 128 ĐS1 17 202 LM1 8.5 55 C-Ư80 16 129 ĐS255 4 203 LM117 17 56 C-Ư86 9 130 ĐS256 1 204 LM1 15 57 C-Ư87 12 131 ĐS260 5 205 LM110 8 58 C-Ư34.2 16 132 ĐS262 8 206 LM61 1 59 C-Ư44 16 133 ĐS263 5 207 LM204 4 60 C-Ư42 15 134 ĐS265 11 208 LM112 8 61 C-Ư57 12 135 ĐS258 10 209 LM1.1 13 62 C-Ư45 12 136 ĐS259 16 210 LM109 18 63 C-Ư54 15 137 ĐS267 14 211 LM105 14 64 C-Ư38 13 138 TK144 12 212 LM78 1 65 C-Ư53 16 139 TK141 8 213 LM132 1 66 C-Ư34.3 17 140 TK1 9 214 LM44 2 67 C-Ư48 16 141 TK2 20 215 LM86 8 68 C-Ư40 12 142 TK145 1 216 LM75 2.5 69 C-Ư41 11 143 TK43 11 217 LM118 5 70 C-Ư66 13 144 TK216 1 218 LM78.1 4 71 C-Ư62 11 145 TK2 5 219 LM27 4 72 C-Ư52 15 146