Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium Falciparum với Dihydroartemisinin-Piperaquin phosphate ở một số vùng sốt rét lưu hành tại Việt Nam

Đột biến C496F 0 0 0 0 Đột biến H384Q 0 0 0 0 Đột biến Y511H 0 0 0 0 Kiểu hoang dại 27 87,10 12 66,67 Tổng 31 100 18 100 77 Nhận xét: Tỷ lệ đột biến gen K13 trên bệnh nhân nam 12,90% (4/31)thấp hơn bệnh nhân nữ 33,33% (6/18). Bảng 3.16. Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Quảng Trị Kiểu gen <15 tuổi (n=11) ≥15 tuổi (n=38) Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ% Đột biến P553L 0 0 0 0 Đột biến C580Y 4 36,36 6 15,39 Đột biến C496F 0 0% 0 0 Đột biến H384Q 0 0% 0 0 Đột biến Y511H 0 0% 0 0 Kiểu hoang dại 7 63,64 32 84,61 Tổng 11 100 38 100 Nhận xét: Quảng trị chỉ phát hiện đƣợc 1 vị trí đột biến gen K13 (C580Y), tỷ lệ đột biến gen K13 ỏ nhóm bệnh nhân dƣới 15 tuổi (36,36%) cao hơn nhóm ≥15 tuổi (15,39%). 3.1.4. Tỷ lệ đột biến gen K13 của 5 tỉnh thực hiện nghiên cứu Bảng 3.17. Tổng hợp kết quả tỷ lệ đột biến gen K13 tại các điểm nghiên cứu TT Tỉnh Mẫu phân tích Mẫu có đột biến gen K13 P SL % 1 Bình Phƣớc 39 38 97,44 0,00063 2 Gia Lai 108 67 62,04 3 Khánh Hòa 52 17 32,69 4 Ninh Thuận 44 3 6,82 5 Quảng Trị 49 10 20,41 Tổng số 292 135 46,23 78 Nhận xét: Từ kết quả phân tích giải trình tự xác định vị trí và tần suất đột biến K13 của P. falciparum tại 5 tỉnh nghiên cứu với 292 mẫu phân lập. Kết quả tổng hợp thu đƣợc tỷ lệ đột biến gen K13 chung là 135/292 (46,23%). Tỷ lệ có đột biến gen K13 của P. falciparum giữa các tỉnh nghiên cứu có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05, cao nhất ở Bình Phƣớc với tỷ lệ 94,44% và thấp nhất là Ninh Thuận với tỷ lệ 6,82% (Bảng 3.16, Hình 3.7) Hình 3.7. Bản đồ phân bố mức độ đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. falciparum tại các điểm nghiên cứu 79 Bảng 3.18. Đặc điểm đột biến gen K13 của 5 tỉnh nghiên cứu Kiểu gen Số lƣợng Tỷ lệ% Phân loại Đột biến P553L 18 6,16 Xác định kháng Đột biến C580Y 103 35,27 Xác định kháng Đột biến C469F 4 1,37 Liên quan/ứng viên Đột biến H384Q 1 0,34 Chƣa xác định vai trò Đột biến Y511H 5 1,71 Chƣa xác định vai trò Đột biến K503N 2 0,68 Chƣa xác định vai trò Đột biến G638E 1 0,34 Chƣa xác định vai trò Đột biến G639D 1 0,34 Chƣa xác định vai trò Kiểu hoang dại 157 53,77 Nhạy với ART Tổng 292 100% Nhận xét: Trong các điểm đột biến gen K13 kiểu đột biến C580Y chiếm tỷ lệ cao nhất 35,27% (103/292), tiếp đến là điểm P553L chiếm 6,16% (18/292) đây cũng là 2 điểm đƣợc xác định là kháng ART, điểm đột biến có liên quan đến kháng ART C496F chỉ phát hiện đƣợc với tỷ lệ nhỏ (1,37%). Ngoài ra còn phát 5 vị trí đột biến khác chƣa xác định đƣợc vai trò có liệu có khẳng định kháng hay liên quan hay vô nghĩa với tỷ lệ rất nhỏ. 80 Bảng 3.19. Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo giới tính của 5 tỉnh Tỉnh Mẫu phân tích Mẫu có đột biến gen K13 Nam Nữ Bình Phƣớc 39 26/26 (100%) 12/13 (92,31%) Gia Lai 108 60/97 (61,86%) 7/11 (63,64%) Ninh Thuận 44 3/41 (7,32%) 0 (0%) Khánh Hòa 52 10/35 (28,57%) 7/17 (41,18%) Quảng Trị 49 4/31 (12,90%) 6/18 (33,33%) Tổng số 292 103/230 (44,78%) 32/62 (51,61%) Nhận xét: Tỷ lệ đột biến chung của bệnh nhân nam 44,78% thấp hơn bệnh nhân nữ 51,61%, trong đó tỷ lệ đột biến của bệnh nhân nam cao nhất là ở Bình Phƣớc chiếm tỷ lệ 100% và thấp nhất ở Ninh Thuận 7,32%. Ở bệnh nhân nữ tỷ lệ đột biến gen K13 cao nhất Bình Phƣớc và thấp nhất ỏ Ninh Thuận, tỷ lệ này cũng phù hợp với tỷ lệ đột biến chung của các điểm nghiên cứu. Bảng 3.20. Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo nhóm tuổi của 5 tỉnh Tỉnh Mẫu phân tích Mẫu có đột biến gen K13 <15 tuổi ≥ 15 tuổi Bình Phƣớc 39 5/5 (100%) 33/34 (97,06%) Gia Lai 108 9/12 (75,00%) 58/96 (60,42%) Ninh Thuận 44 1/11 (9,09%) 2/33 (6,06%) Khánh Hòa 52 9/21 (42,86%) 8/31 (25,81%) Quảng Trị 49 4/11 (36,36%) 6/38 (15,79%) Tổng số 292 25/58 (43,10%) 110/234 (47,00%) 81 Nhận xét: Tỷ lệ đột biến chung ở nhóm ≥ 15 tuổi (47,00%) cao hơn dƣới tuổi 15 (43,10%), tỷ lệ đột biến cao nhất của nhóm ≥15 cao nhất là Bình Phƣớc, thấp nhất ỏ Ninh Thuận, Sự khác biệt đột biến gen K13 giữa nhóm ≥ 15 và nhóm dƣới 15 tuổi có ý nghĩa thống kê (p = 0,004). 3.1.5. So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 của các quần thể P. falciparum tại các điểm nghiên cứu. Hình 3.8. Biểu đồ so sánh tỷ lệ đột biến gen K13 phát hiện đƣợc tại các điểm nghiên cứu Hình 3.8 cho thấy đột biến kháng artemisinin C580Y phát hiện đƣợc ở cả 5 tỉnh nghiên cứu, cao nhất tại Bình Phƣớc với tần suất kiểu gen đột biến chiếm 97,44% (38/39 mẫu) và phát hiện với tỷ lệ thấp tại Khánh Hòa 5,77 % (3/52 mẫu) tại Ninh Thuận chiếm tỷ lệ 6,82% (3/44 mẫu), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,001. Đột biến kháng artemisinin P553L phát hiện đƣợc tại 2 tỉnh là Gia Lai 5,56% (6/108 mẫu) và ở Khánh Hòa với tỷ lệ 21,15% (11/52 mẫu). Đột biến C496F chỉ phát hiện đƣợc ở tỉnh Gia Lai với tỷ lệ 4,63% (5/108 mẫu). Một số đột biến chƣa xác định tính kháng khác phát hiện đƣợc ở Gia Lai nhƣ K503N với tỷ lệ 1,85% (2/108 mẫu), Y511H với tỷ lệ 4,63% (5/108 mẫu), các đột biến H384Q, G638E, G639D chỉ phát hiện đƣợc ở tỉnh Khánh Hòa với tỷ lệ thấp 1,92% (1/52 mẫu). 82 3.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphate tại các điểm nghiên cứu Trong tổng số 292 bệnh nhân KSTSR P. falciparum thu thâp đƣợc từ 5 tỉnh nghiên cứu đƣợc đƣa vào phân tích gen K13, có 201 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đƣợc lựa chọn đƣa vào nghiên cứu đánh giá đáp ứng của KST P. falciparum với thuốc DHA-PPQ với số lƣợng từng tỉnh nhƣ sau: Tỉnh Bình Phƣớc 39 bệnh nhân, tỉnh Gia Lai 48 bệnh nhân, tỉnh Ninh Thuận 40 bệnh nhân, tỉnh Khánh Hòa 43 bệnh nhân và Quảng Trị 31 bệnh nhân kết quả nhƣ sau: 3.2.1. Đặc điểm chung về dân số của nhóm nghiên cứu Bảng 3.21. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu Đặc điểm Bình Phƣớc n= 39 Gia Lai n=48 Khánh Hòa n= 43 Ninh Thuận n=40 Quảng Trị n=31 Giới tính Nam Nữ SL(%) 26 (66,7) 13 (33,3) SL(%) 46 (95,8) 2 (4,2) SL(%) 29 (67,4) 14 (32,6) SL(%) 38 (95) 2 (5) SL(%) 18 (58,1) 13 (41,9) Nhóm tuổi Trung bình <5 ≥ 5 - < 15 ≥ 15 Mean±SD 26,8 ± 12,4 0 5 (12,8) 34 (87,2) Mean±SD 27,6 ± 9 0 1 (2,1) 47 (97,9) Mean±SD 26,3 ±18,0 1(2,4) 17 (39,5) 25 (58,1) Mean±SD 26,9 ± 14,8 1 (2,5) 9 (22,5) 30 (75,0) Mean±SD 25,1 ± 16,9 2 (6,4) 6 (19,4) 23 (74,2)) - Nhiệt độ (0C) - Cân nặng (kg) 38,7 ± 0,6 51 ± 10,7 38,7 ± 0,9 53,4 ± 8,2 38,8 ± 0,9 37,6 ± 13,4 38,9 ± 0,4 42,8 ± 13,8 38,8 ± 0,8 40,4 ± 12,7 Mật độ KST 8.030/L (1128-97764) 10.770/L (1019-98765) 11.736/L (1020- 99555) 26.530/L (3111-97666) 11.087/L (1441 -98234) Nhận xét: - Phân tích các đặc điểm dân số học của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu TES đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ trong điều trị bệnh nhân sốt rét nhiễm P. falciparum chƣa biến chứng cho thấy nam chiếm cao hơn nữ trong cơ 83 cấu tại tất cả điểm thực hiện TES, lần lƣợt nam chiếm 66,7%; 95,8%; 67,4%; 95% và 58,1% tại Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị. - Phần lớn bệnh nhân đều là ngƣời lớn trƣởng thành (≥ 15 tuổi) tại Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị lần lƣợt là 87,2%; 97,9; 58,1%, 75,0% và 74,2%. - Tại thời điểm vào nghiên cứu và chƣa dùng thuốc sốt rét, thân nhiệt trung bình của nhóm bệnh nhân tại các tỉnh nghiên cứu Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Khánh Hòa và Quảng Trị tham gia lần lƣợt là (38,7 ± 0,6)0C; (38,7 ± 0,9)0C; (38,8 ± 0,9)0C; (38,9 ± 0,4)0C và (38,8 ± 0,8)0C và cân nặng trung bình lần lƣợt là (51 ± 10,7) kg; (53,4 ± 8,2) kg; (37,6 ± 13,4) kg; (42,8 ± 13,8) kg và (40,4 ± 12,7) kg. - Mật độ KSTSR thể vô tính P. falciparum trung bình tại các tỉnh dao động từ 8030 đến 26530/L trong máu ngoại vi, không có trƣờng hợp nào dƣới 1000 hay trên 100.000/L, phù hợp tiêu chuẩn chọn bệnh. 3.2.2. Tỷ lệ, đặc điểm đột biến gen K13 của nhóm nghiên cứu in vivo Bảng 3.22. Tỷ lệ đột biến gen K13 của các mẫu đƣa vào nghiên cứu in vivo Tỉnh Mẫu phân tích Mẫu có đột biến gen K13 p SL % 0,00056 Bình Phƣớc 39 38 97,44 Gia Lai 48 28 58,33 Ninh Thuận 40 2 5,00 Khánh Hòa 43 16 37,21 Quảng Trị 31 10 32,26 Tổng số 201 94 46,77 Nhận xét: 84 Tổng số 201 mẫu phân lập P. falciparum thu thập, số mẫu có đột biến gen K13 chung là 94/201 (46,77%). Trong đó, tỷ lệ có đột biến gen K13 tại các tỉnh Bình Phƣớc là cao nhất chiếm 97, 44% và thấp nhất tại Ninh Thuận chiếm 5%. Tỷ lệ đột biến gen K13 giữa các tỉnh khác nhau có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Bảng 3.23. Đặc điểm đột biến gen K13 của bệnh nhân nghiên cứu in vivo Kiểu gen Bình Phƣớc n=39 Gia Lai n =48 Khánh Hòa n =43 Ninh Thuận n =40 Quảng Trị n =31 Phân loại Đột biến P553L 0 (0 %) 3 (6,25%) 11 (25,58%) 0 (0 %) 0 (0 %) Xác định kháng Đột biến C580Y 38 (97,44%) 21 (43,75%) 2 4,65% 2 (5,0%) 10 (32,26%) Xác định kháng Đột biến C496F 0 (0 %) 2 (4,17%) 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0 %) Liên quan/ ứng viên Đột biến H384Q 0 (0 %) 0 (0 %) 1 (2,32%) 0 (0 %) 0 (0 %) Chƣa xác định vai trò Đột biến Y511H 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0 %) Chƣa xác định vai trò Đột biến K503N 0 (0 %) 2 (4,17%) 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0 %) Chƣa xác định vai trò Đột biến G638E 0 (0 %) 0 (0 %) 1 (2,32%) 0 (0 %) 0 (0 %) Chƣa xác định vai trò Đột biến G639D 0 (0 %) 0 (0 %) 1 (2,32%) 0 (0 %) 0 (0 %) Chƣa xác định vai trò Nhận xét: - Qua phân tích mẫu giấy thấm của máu bệnh nhân P. falciparum trong nghiên cứu in vivo phát hiện đƣợc 7 kiểu đột biến gen (C580Y, P553L, C469F, H384Q, K503N, G638E, G639D) không phát hiện đƣợc kiểu Y511H. Trong đó đột biến gen K13 liên quan đến kháng ART C580Y trên quần thể P. falciparum là 85 phổ biến nhất với tỷ lệ lần lƣợt 97,44%; 43,75%; 32,26%%; 5,00%; 4,65 tại Bình Phƣớc, Gia Lai, Quảng Trị, Ninh Thuận, Khánh Hòa. Đột biến P553L cũng là chỉ điểm xác định kháng ART chỉ phát hiện đƣợc ở Khánh Hòa, Gia Lai mà chƣa phát hiện đƣợc ở các tỉnh khác với tỷ lệ lần lƣợt là 21,15% và 5,56%. - Kiểu đột biến C469F có thể liên quan đến kháng ART, phát hiện ở Gia Lai với tỷ lệ thấp 4,17%. Ngoài ra, còn có 4 loại đột biến K13 khác:Khánh Hòa 3 đột biến gồm có H384Q (2,32%), G638E (2,32%), G639D (2,32%) và Gia Lai 1 đột biến, K503N (4,17%), hiện chƣa xác định vai trò liệu có khẳng định kháng hay liên quan hay vô nghĩa. 3.2.3. Thời gian làm sạch ký sinh trùng và cắt sốt sau điều trị DHA-PPQ Bảng 3.24. Hiệu lực làm sạch ký sinh trùng P. falciparum và cắt sốt Nội dung phân tích Bình Phƣớc Gia Lai Khánh Hòa Ninh Thuận Quảng Trị Mật độ KSTSR/l ngày D0 8030 10770 11736 26530 11087 Thời gian sạch KST (giờ) 52,1 ± 20,1 45,5 ± 22,2 38,1 ± 16,6 31,2 ± 11,1 24,6 ± 1,5 Nhiệt độ ngày D0 ( 0C) 38,7 ± 0,6 38,7 ± 0,9 38,8 ± 0,9 38,9 ± 0,4 38,8 ± 0,8 Thời gian cắt sốt (giờ) 30,2 ± 12,7 33,3 ± 14,9 31,4 ± 11,5 30 ± 11,5 34,2 ± 12,8 Nhận xét: Sau điều trị thuốc DHA-PPQ cho thấy thời gian sạch KST trung bình của các tỉnh lần lƣợt là: Bình Phƣớc 52,1 ± 20,1 giờ; Gia Lai 45,5 ± 22,2 giờ; Khánh Hòa 38,1 ± 16,6 giờ; Ninh Thuận 31,2 ± 11,1 giờ; Quảng Trị 24,6 ± 1,5 giờ.thời gian sạch KSTtrung bình giữa các tỉnh khác nhau có ý nghĩa thống kê (p <0,05). Song song đó, thời gian cắt sốt trung bình lần lƣợt là: Bình Phƣớc 30,2±12,7 giờ, Gia Lai 33,3 ± 14,9 giờ, Khánh Hòa 31,4 ± 11,5 giờ; Ninh Thuận 30 ± 11,5 giờ và Quảng Trị 34,2 ±12,8 giờ. 86 Bảng 3.25. Tỷ lệ tồn tại ký sinh trùng thể vô tính 72 giờ hoặc ngày D3 Thời gian sạch KSTSR Bình Phƣớc Gia Lai Khánh Hòa Ninh Thuận Quảng Trị Mật độ KSTSR/l ngày D0 8030 10770 11736 26530 11087 Số ca còn thể vô tính ngày D1 35/39 (89,7%) 38/48 (79,2%) 37/43 (86,1%) 17/40 (42,5%) 6/31 (19,4%) Số ca còn thể vô tính ngày D2 27/39 (69,2%) 24/48 (50,0%) 25/43 (58,1%) 1/40 (2,5%) 0/31 (0,0%) Số ca còn thể vô tính ngày D3 16/39 (41,0%) 7/48 (14,6%) 8/43 (18,6%) 0/40 (0%) 0/31 (0%) Nhận xét: Phân tích về tỷ lệ tồn tại KST thể vô tính sau điều trị DHA-PPQ ở ngày D3 kể từ liều thuốc DHA-PPQ đầu tiên cho thấy tại các điểm theo dõi của tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, tỷ lệ KST ngày D3 >10% lần lƣợt là 41,0% (16/39), 14,6% (7/48), 18,6% (8/43).Ninh Thuận và Quảng Trị không có trƣờng hợp nào còn KST ngày D3. Bảng 3.26. So sánh ký sinh trùng ngày D3 với đột biến gen K13 tại các điểm nghiên cứu. Tỉnh Đột biến gen K13 Tổng cộng Có KST D3(%) Không Có KST D3 Bình Phƣớc n=39 16 41% 22 56,4% 38 Gia Lai n=48 7 14,6% 21 43,7% 28 Khánh Hòa n= 43 8 18,6% 8 18,6% 16 Ninh Thuận n=40 0 0% 2 5,0% 2 Quảng Trị n=31 0 0% 10 32,6% 10 Tổng cộng 31 63 94 94 87 Nhận xét: Trong số 201 bệnh nhân theo dõi đến ngày D3 của 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị có tất cả 31 bệnh nhân có KST ngày D3 đều có điểm đột biến gen K13 xác định kháng ART (24.C580Y, 7.P553L) lần lƣợt tại các tỉnh là Bình Phƣớc 41%, Khánh Hòa 18,6% và Gia Lai14,6 % và 63/94 bệnh nhân có đột biến gen K13 nhƣng không có KST ngày D3. Nhƣ vậy các tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa có tỷ lệ KST ngày D3 lớn hơn 10% kết hợp với đột biến K13 ở những vị trí xác định kháng ART > 5% đƣợc xác định là vùng kháng ART. Bảng 3.27. Đặc điểm kiểu gen của những bệnh nhân có ký sinh trùng ngày D3 Kiểu gen Bình Phƣớc n=16 Gia Lai n =7 Khánh Hòa n =8 Tổng Phân loại Đột biến P553L 0 (0 %) 1 (14,28%) 7 (87,5%) 8 Xác định kháng Đột biến C580Y 16 (100%) 6 (85,72%) 1 12,5% 23 Xác định kháng Đột biến C496F 0 (0 %) 0 (0%) 0 (0 %) 0 Liên quan/ ứng viên Đột biến Khác 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0%) 0 Chƣa xác định vai trò Nhận xét: Trong số 31 bệnh nhân có KST ngày D3 và có điểm đột biến gen K13 có 23 mẫu có đột biến C580Y (Bình Phƣớc 16 mẫu, Gia Lai 6 mẫu và Khánh Hòa 1mẫu), 8 mẫu có đột biến P553L (Khánh Hòa 7 mẫu và Gia Lai1 mẫu). Tất cả các đột biến này đều đƣợc phân loại là xác định kháng artemisinin. 88 3.2.4. Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét P. falciparum Bảng 3.28. Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét do P. falciparum tại các tỉnh nghiên cứu Hiệu lực phác đồ DHA-PPQ Bình Phƣớc Gia Lai Khánh Hòa Ninh Thuận Quảng Trị SL(%) SL(%) SL(%) SL(%) SL(%) Thất bại điều trị sớm (ETF) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Thất bại LS muộn (LCF) 2 (6,1%) 1 (2,2%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Thất bại KST muộn (LPF) 4 (12,2%) 0 (0%) 1 (2,6%) 0 (0%) 0 (0%) Đáp ứng LS và KST (ACPR) 27 (81,8%) 44 (97,8%) 38 (97,4%) 33 (100%) 26 (100%) Tổng số phân tích 33 45 39 33 26 Mất theo dõi/rút nghiên cứu 6 (15,4%) 3 (6,3%) 4 (9,3%) 7 (17,5%) 5 (16,1%) Tổng số nghiên cứu 39 48 43 40 31 Nhận xét: Trong số 201 ca bệnh tham gia nghiên cứu TES, có đến 25/201 (12,4%) ca mất theo dõi hoặc rút khỏi nghiên cứu chỉ còn 176 bệnh nhân đƣợc theo dõi đánh giá đầy đủ. Kết quả chỉ ra đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ (ACPR) tại hai tỉnh Ninh Thuận và Quảng Trị đều 100%, tại tỉnh Khánh Hòa và Gia Lai hiệu lực vẫn còn trên 95% lần lƣợt 96,4% và 97,4%, trong khi đó tại Bình Phƣớc tỷ lệ ACPR này chỉ còn 81,8% (< 90%) và tỷ lệ thất bại trên 10%, kèm theo thất bại lâm sàng muộn (LCF) là 2 ca (6,1%), thất bại KST muộn (LPF) là 4 ca (12,2%). Đặc biệt, tại cả 5 tỉnh chƣa có trƣờng hợp nào thất bại điều trị sớm (ETF), riêng ở Khánh Hòa và Gia Lai có 1 trƣờng hợp thất bại muộn. 89 Hình 3.9. Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá tại Bình Phƣớc Phân tích đƣờng cong Kaplan Meier tại Bình Phƣớc cho phép ta ƣớc tính đƣợc số bệnh nhân tham gia trong suốt quá trình điều trị và ca thất bại trong quá trình theo dõi tại những ngày D14, D21, D28 đƣờng cong đi xuống tƣơng ứng với những ngày xuất hiện bệnh nhân thất bại điều trị. Hình 3.10. Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá tại Gia Lai Tất cả 8 bệnh nhân thất bại điều trị đều đƣợc lấy mẫu máu giấy thấm để phân tích tái phát, tái nhiễm kết quả cả 8 mầu này đều là tái phát không có mẫu nào nhiễm mới. 90 Hình 3.11. Hình ảnh điện di phân tích tái phát, tái nhiễm Đây là hình ảnh tái phát vì chiều dài của các marker ngày xuất hiện lại KST trùng khớp với ngày D0. Bảng 3.29.So sánh thất bại điều trị và đáp ứng lâm sàng đầy đủ với các điểm đột biến gen K13 có liên quan đến kháng artemisinin. Tỉnh Thất bại điều trị Đáp ứng lâm sàng đầy đủ Tổng cộng Có đột biến K13 Không đột biến K13 Có đột biến K13 Không đột biến K13 Bình Phƣớc 6 0 26 1 33 Gia Lai 1 0 25 19 45 Khánh Hòa 1 0 12 26 39 Ninh Thuận 0 0 2 31 33 Quảng Trị 0 0 10 16 26 Tổng cộng 8 0 75 93 176 91 Nhận xét: Trong số 201 bệnh nhân đƣa vào theo dõi có 176 bệnh nhân theo dõi đủ 42 ngày. Trong 5 tỉnh, có 3 tỉnh xuất hiện bệnh nhân thất bại điều trị muộn là Bình Phƣớc 6 bệnh nhân, Gia Lai 1 bệnh nhân, Khánh Hòa 1 bệnh nhân, tất cả những bệnh nhân này đều có điểm đột biến gen K13 xác định hoặc liện quan đến kháng ART. Đáp ứng lâm sàng đầy đủ là 168 bệnh nhân trong đó có 75 bệnh nhân có điểm đột biến gen K13 xác định hoặc liện quan đến kháng ART và 93 bệnh nhân không có đột biến gen K13. 3.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc sốt rét bằng kỹ thuật invitro tại Gia Lai - Nghiên cứu thử nghiệm thuốc SR với các phân lập thu thập tại thực địa trên in vitro nhằm phát hiện sớm các dấu hiệu của sốt rét P. falciparum kháng thuốc và đánh giá độ nhạy cảm những thuốc mới có khả năng thay thế những thuốc đã bị kháng. Trong 292 ca đƣa vào phân tích đột biến gen K13 thu thập đƣợc 54 phân lập P. falciparum tại Gia Lai để đánh giá nhạy cảm của KSTSR với với một số thuốc sốt rét. Trong đó 54 mẫu tiến hành nuôi cấy, tỷ lệ KST phát triển thành thể phân liệt ở giếng chứng trên 10% là 42/54 mẫu (77,7%). 3.3.1 Đặc điểm đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. falciparum trên các mẫu đƣa vào thử thuốc sốt rét Bảng 3.30. Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu đƣa vào thử thuốc TT Kiểu gen Số lƣợng n=54 Tỷ lệ % Tình trạng phân loại 1 Đột biến P553L 3 5,56 Xác định kháng 2 Đột biến C580Y 26 48,15 Xác định kháng 3 Đột biến C496F 3 5,56 Liên quan/ứng viên 4 Đột biến H384Q 0 0 Chƣa xác định vai trò 5 Đột biến Y511H 5 9,26 Chƣa xác định vai trò 6 Đột biến K503N 0 0 Chƣa xác định vai trò 7 Đột biến G638E 0 0 Chƣa xác định vai trò 8 Đột biến G639D 0 0 Chƣa xác định vai trò 9 Kiểu hoang dại 17 31,48 Nhạy với ART Tổng 54 100 92 Nhận xét: - Qua phân tích có 37/54 (68,52%) mẫu phát hiện có đột biến gen K13: Kiểu đột biến C580Y chiếm 48,15% (26/54), P553L là 5,56% (3/54) là hai đột biến xác định kháng artemisinin và Liên quan,ứng viên C496F là 5,56% (3/54) Ngoài ra còn phát hiện vị trí đột biến Y511H là 9,26% (5/54) hiện chƣa xác định vai trò. Bảng 3.31. Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu nuôi cấy thành công TT Kiểu gen Số lƣợng n=42 Tỷ lệ % Tình trạng phân loại 1 Đột biến P553L 2 4,76 Xác định kháng 2 Đột biến C580Y 20 47,62 Xác định kháng 3 Đột biến C496F 3 7,14 Liên quan/ứng viên 4 Đột biến H384Q 0 0 Chƣa xác định vai trò 5 Đột biến Y511H 4 9,52 Chƣa xác định vai trò 6 Đột biến K503N 0 0 Chƣa xác định vai trò 7 Đột biến G638E 0 0 Chƣa xác định vai trò 8 Đột biến G639D 0 0 Chƣa xác định vai trò 9 Kiểu hoang dại 13 30,95 Nhạy với ART Tổng 42 100 Nhận xét: - Qua phân tích có 29/42 mẫu phát hiện nhiều đột biến: Kiểu đột biến C580Y chiếm 47,62% (20/42), P553L là 4,76% (2/42) là hai đột biến xác định kháng artemisinin và đột biến ứng viên C496F 7,14% (3/42). Đột biến gen K13 vị trí Y511H là 9,52% (4/42) hiện chƣa xác định vai trò liệu có khẳng định kháng hay liên quan hay vô nghĩa. 93 3.3.2. Đánh giá nhậy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với một số thuốc sốt rét 3.3.2.1. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với artesunat Hình 3.12. Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc artesunat - Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 trung bình của AS đối với 42 mẫu phân lập P. falciparum là IC50 là 3,06 ± 3,10 nmol/L. Trong đó, giá trị IC50 thấp nhất là 0,41 nmol/L và cao nhất 14,55 nmol/L. 3.3.2.2. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với dihydroartemisinin - Tƣơng tự nhƣ thuốc artesunat (AS), hiện nay dẫn suất diydroartemisinin (DHA) là một trong những dẫn suất và là thành phần thuốc sốt rét quan trọng trong các viên thuốc phối hợp có thành phần (ACTs). - Dữ liệu cho thấy tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của DHA ở nồng độ 2 nmol/L là 38,6%, tƣơng ứng ở nồng độ 4 nmol/L là 67,8%, ở nồng độ 8 nmol/L là 87,2%, ở nồng độ 16 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên 94% sự phát triển thành thể phân liệt của P. falciparum nhƣng nồng độ thuốc cao gấp 2 lần (32 nmol/L) cũng chƣa đủ để toàn bộ KST phát triển thành thể phân liệt. Nồng độ (nmol/l) Tỷ lệ (%) 94 0 9.4 20.8 38.6 67.8 87.2 94.7 97.8 0 20 40 60 80 100 120 0 0.5 1 2 4 8 16 32 Hình 3.13. Tỷ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc Dihydroartemisinin - Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 trung bình của DHA đối với 42 phân lập P. falciparum là IC50 là 2,95 ± 2,19 nmol/L. Giá trị IC50 thấp nhất là 0,52 nmol/L và cao nhất là 9,94 nmol/L. 3.3.2.3. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với chloroquin Hình 3.14. Tỷ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc Chloroquin Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) Nồng độ (nmol/l) Nồng độ (nmol/l) 95 - Kết quả cho thấy ở nồng độ thuốc CQ là 100 nmol/L (nồng độ xác định kháng CQ) ức chế đƣợc 76,5% số KST P. falciparum phát triển thành thể phân liệt, ở nồng độ thuốc CQ là 200 nmol/L ức chế đƣợc trên 95% KST, ở nồng độ thuốc cao nhất đƣợc thử nghiệm là 800 nmol/L ức chế đƣợc 100% KST phát triển thành thể phân liệt. Giá trị IC50 trung bình thu đƣợc 67,7± 53,1 nmol/L. - Giá trị IC50 thấp nhất là 12,3 nmol/L và cao nhất là 338,3 nmol/L. Trong đó, có 21,4% (9/42) số mẫu ở bệnh nhân có IC50 >100 nmol/L (xác định kháng CQ). 3.3.2.4. Đánh giá tính nhạy cảm của P. falciparum với piperaquin Hình 3.15. Tỷ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc piperaquin - Kết quả nghiên cứu trình bày ở hình trên cho thấy tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của PPQ ở nồng độ 50 nmol/L là 43,7%, tƣơng ứng ở nồng độ 100 nmol/L là 94,5%, ở nồng độ 200 nmol/L đã có tác dụng ức chế trên 95% sự phát triển thành thể phân liệt của KST P. falciparum nhƣng nồng độ thuốc cao gấp 2 lần (32 nmol/L) cũng chƣa đủ để toàn bộ KST phát triển thành thể phân liệt. - Giá trị IC50 trung bình thu đƣợc 43,5 ± 24,9 nmol/L, giá trị IC50 thấp nhất là 4,66 nmol/L và cao nhất là 105,8 nmol/L. Tỷ lệ (%) Nồng độ (nmol/L) 96 3.3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. falciparum với một số thuốc sốt rét trên in vitro tại Gia Lai 3.3.3.1. Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC50 của thuốc artesunat trên các mẫu nuôi cấy Bảng 3.32. So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc artesunat trên các mẫu nuôi cấy Kiểu gen Mẫu nuôi cấy (n=42) IC50 (nmol/L) P Có đột biến K13 liên quan đến kháng ART 25/42 3,50 0,0034 Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART 17/42 2,18 Nhận xét: Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, các mẫu này có chỉ số IC50 của thuốc artesunat trung bình là 3,50 nmol/L và có 17/42 mẫu Không có đột biến K13 hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình là 2,18 nmol/L thấp hơn so với các mẫu có đột biến là 3,50. Sự khác biệt của 2 nhóm này có ý nghĩa thống kê với (p < 0,05) 3.3.3.2. Mối liên quan giữa đột biến gen K13 và IC50 của thuốc chloroquine trên các mẫu nuôi cấy Bảng 3.33. So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc chloroquin trên các mẫu nuôi cấy Kiểu gen Mẫu nuôi cấy (n=42) IC50 (nmol/L) Có đột biến K13 liên quan đến kháng ART 25/42 75,23 Kiểu hoang dại hoặc đột biến K13 không liên quan đến kháng ART 17/42 52,99 97 Nhận xét: Qua phân tích 42 mẫu nuôi cấy thành công ta thấy có 25/42 mẫu có đột biến K13 liên quan đến kháng ART và dẫn chất, trong đó có 6/25 mẫu có chỉ số các mẫu này có chỉ số IC50 trung bình của t