Luận án Nghiên cứu nấm Bipolaris oryzae hại hạt giống lúa thu thập tại các tỉnh phía bắc và ven biển miền trung Việt Nam

4 HYT 100 30 60,0 3,9 4,9 4,8 5 HYT 103 30 63,3 3,1 2,2 4,5 6 Thanh ưu 3 30 46,7 3,0 2,9 3,5 7 LC 270 30 43,3 4,1 4,8 4,9 8 LC 215 30 50,0 1,8 2,5 2,3 9 Việt lai 20 30 73,3 2,5 3,5 3,5 10 PAC 807 30 20,0 2,1 2,6 2,8 Trung bình 59,0 2,7 2,1 3,3 4.1.2.4. Tình hình nấm B. oryzae gây hại trên hạt giống lúa ở một số vùng sinh thái nông nghiệp Khảo sát ảnh hưởng của một số vùng sinh thái nông nghiệp tới tỷ lệ hạt nhiễm nấm trên hạt giống lúa, chúng tôi tiến hành điều tra tại bốn vùng sinh thái nông nghiệp với giống Hương thơm số 1. Giống Hương thơm số 1 được lựa chọn để điều tra vì là giống lúa có chất lượng cơm gạo ngon, năng suất cao, thích nghi với mọi vùng sinh thái nên được trồng phổ biến trên khắp các tỉnh phía Bắc và ven biển miền Trung. Ngoài ra sử dụng giống Hương thơm số 1 do kết quả điều tra trên đồng ruộng và trên hạt giống, giống này khá mẫn cảm với nấm B. oryzae. Các tỉnh thuộc vùng đồng bằng sông Hồng có tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae thấp nhất, tỷ lệ cao nhất của vùng này là 8,3% vào năm 2012. Các tỉnh vùng Bắc trung bộ có tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao nhất với tỷ lệ 15,3% vào năm 2011, vùng Tây bắc có tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao nhất là 10,0% vào năm 2010; vùng Đông bắc có tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao nhất là 9,5% vào năm 2011. Ở bốn vùng đã điều tra, tỷ lệ hạt nhiễm nấm không có sự biến đổi nhiều qua các năm điều tra, tỷ lệ mẫu nhiễm từ 36,6% đến 50% (bảng 4.9). Tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ hạt nhiễm cao nhất tại vùng Bắc Trung bộ do điều kiện đất đai nghèo dinh dưỡng phù hợp cho nấm phát triển và 62 gây hại. Kết quả điều tra phù hợp với các nghiên cứu trước đó của thế giới, Viện Bảo vệ thực vật, Trường Đại học nông nghiệp Hà Nội và Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia. Bảng 4.9. Mức độ nhiễm nấm B. oryzae trên hạt giống lúa Hương thơm số 1 thu thập tại một số vùng sinh thái nông nghiệp STT Vùng sinh thái Tỷ lệ mẫu nhiễm nấm trung bình (%) Tỷ lệ hạt nhiễm (%) Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 1 Vùng Đồng bằng sông Hồng 36,6 3,6 4,6 8,3 Thái Bình 4,6 6,3 12,2 Nam Định 3,7 3,7 7,2 Hải Dương 2,5 3,8 5,5 2 Vùng Đông Bắc 43,3 8,5 9,5 7,6 Thái Nguyên 8,6 9,8 7,3 Bắc Giang 11,4 12,4 8,3 Phú Thọ 5,5 6,3 6,7 3 Vùng Tây Bắc 46,6 10,0 9,1 8,5 Điện Biên 11,5 8,3 9,7 Hòa Bình 8,5 9,9 7,3 4 Vùng Bắc Trung bộ 50,0 13,8 15,3 14,0 Nghệ an 14,3 17,6 15,5 Thanh Hóa 13,3 13,0 12,5 4.1.2.5. Tình hình nấm B. oryzae gây hại trên hạt giống lúa thu hoạch ở chế độ canh tác khác nhau Với giả thiết các chế độ canh tác khác nhau sẽ ảnh hưởng tới tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae, để tìm hiểu xem chế độ canh tác nào có tác dụng hạn chế khả năng lây lan và gây hại của nấm, chúng tôi đã tiến hành điều tra trên các ruộng có các chế độ canh tác khác nhau. Ba chế độ canh tác đã được điều tra bao gồm: sản xuất một vụ lúa, một vụ cá/ năm; luân canh cây vụ đông và chuyên canh lúa. Đối tượng điều tra được tiến hành trên giống Hương thơm số 1 vào vụ mùa và vụ xuân các năm 2010, 2011, 2012. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.10. Tỷ lệ mẫu nhiễm nấm, tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao nhất trên chế độ canh tác chuyên canh cây lúa (60% và 25,5%). Chế độ canh tác một vụ lúa sau đó nuôi thả cá có tỷ lệ hạt nhiễm thấp nhất (tỷ lệ cao nhất là 1,5%). Đất sản xuất một vụ lúa, 63 một vụ cá thường là khu đất trũng, giàu dinh dưỡng, cây lúa phát triển tốt, đẻ nhánh khỏe, các loại sâu bệnh khác cũng rất ít xuất hiện. Sau khi gặt, tất cả các tàn dư của cây đều bị ngập nước trong thời gian dài nên tỷ lệ mẫu nhiễm nấm thấp đã hạn chế việc truyền bệnh sang vụ sau. Trên đất trồng lúa luân canh sản xuất cây vụ đông (luân canh với khoai tây, rau họ thập tự, đậu tương), tỷ lệ mẫu nhiễm và hạt nhiễm nấm có nhiều hơn nhưng vẫn thấp hơn trên các chân đất chỉ trồng lúa do cây vụ đông không phải là ký chủ của B. oryzae nên cũng đã hạn chế được quá trình truyền bệnh trên đồng ruộng. Bảng 4.10. Ảnh hưởng của chế độ canh tác tới tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae của giống lúa Hương thơm số 1 STT Chế độ canh tác Tỷ lệ mẫu nhiễm nấm trung bình (%) Tỷ lệ hạt nhiễm (%) Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 1 Một vụ lúa, một vụ cá 10,0 1,0 1,0 1,5 2 Luân canh cây vụ đông 20,0 3,5 3,5 3,0 3 Chuyên canh lúa 60,0 18,5 25,5 20,0 4.1.2.6. Trên hạt giống lúa ở các địa hình canh tác Điều tra tình hình hạt giống lúa nhiễm nấm B. oryzae trên các địa hình canh tác khác nhau, tiến hành thu thập mẫu điều tra tại các tỉnh ven biển miền Trung là Hà Tĩnh, Quảng Bình, Nghệ An, Thanh Hóa. Bảy loại địa hình canh tác điển hình tại các địa phương đã thu thập mẫu để điều tra (bảng 4.11). Mẫu hạt giống lúa sử dụng để điều tra vẫn là giống Hương thơm số 1 được gieo trồng trên 7 loại địa hình canh tác. Tại các địa phương này thời vụ gieo trồng, chế độ dinh dưỡng và chăm sóc khác nhau đã ảnh hưởng đến khả năng phát triển nấm của B. oryzae trên cây lúa. Các mẫu thu thập tại Nghệ An có tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae lên tới 62,5%, khu ruộng này chuyên canh lúa và nằm trên khu vực cao, địa hình dốc, khô hạn, khó khăn trong việc tưới tiêu. Tại khu vực này quá trình chăm sóc như làm cỏ, bón phân và công tác bảo vệ thực vật còn hạn chế, sự phát triển của cây lúa trên ruộng không đạt được mức tối đa, cây phát triển kém dẫn đến nấm B. oryzae phát triển và gây hại nhiều nhất. Trên đất pha cát và bạc màu ven biển tại Quảng Bình, mẫu hạt giống thu tại ruộng chuyên canh lúa có tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae lên tới 52,5%, các mẫu thu tại ruộng đất nhiễm phèn tại tỉnh này có tỷ lệ hạt nhiễm nấm 64 B. oryzae 19,0%. Số mẫu nhiễm trên mẫu kiểm tra cao nhất cũng ở 3 loại địa hình như trên. Đất trũng có số mẫu nhiễm nấm trên mẫu kiểm tra thấp nhất (1/10), tỷ lệ hạt nhiễm nấm trên đất này cũng thấp nhất (1,5%). Bảng 4.11. Ảnh hưởng của địa hình canh tác đến tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae trên giống Hương thơm số 1 STT Đặc điểm địa hình nơi thu thập mẫu Số mẫu nhiễm nấm/ số mẫu kiểm tra Tỷ lệ hạt nhiễm nấm (%) 1 Cao, dốc, khô hạn 10/10 62,5 2 Đất pha cát, bạc màu 10/10 52,5 3 Đất vàn thấp 2/10 6,5 4 Đất vàn cao 3/10 5,5 5 Đất trũng 1/10 1,5 6 Đất dưới chân núi 5/10 13,5 7 Đất nhiễm phèn 10/10 19,0 4.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN TỬ CỦA NẤM B. ORYZAE 4.2.1. Một số đặc điểm sinh học của nấm B. oryzae 4.2.1.1. Đặc điểm phát triển của nấm trên môi trường PGA Nguồn nấm thuần được sử dụng để nuôi cấy trên môi trường PGA, quan sát đặc điểm tản nấm, cành bào tử và bào tử trong quá trình phát triển (hình 4.4). Hình 4.4. Đặc điểm phát triển của nấm B. oryzae trên môi trường PGA Hình bên trái: Nấm phát triển trên môi trường PGA sau 5 ngày nhìn phía dưới Hình bên phải: Nấm phát triển trên môi trường PGA sau 5 ngày nhìn phía trên 65 Đặc điểm phát triển trên môi trường PGA được mô tả ở bảng 4.12. Bảng 4.12. Đặc điểm của nấm B. oryzae khi phát triển trên môi trường PGA Thời gian Đặc điểm tản nấm Cành bào tử phân sinh Bào tử phân sinh Ngày 1 Màu trắng, đường kính 6,0–11,0mm, tản nấm không tròn Chưa hình thành Chưa hình thành Ngày 2 Màu trắng, đường kính 14,0–24,0mm, hơi tròn, hơi xốp Chưa hình thành Chưa hình thành Ngày 3 Tản nấm có màu xám nhạt 33,0– 52,0mm, tròn Chưa hình thành Chưa hình thành Ngày 4 Đường kính 41,0–73,0 mm, tản nấm tròn hoặc phát triển lan tỏa về các hướng, các vòng tròn xốp, xám đen hình thành trên tản nấm Một vài cành bào tử phân sinh hình thành Chưa hình thành Ngày 5 Đường kính tản nấm 50,0–88,0 mm, rìa có thể lan tỏa hoặc phân rới rõ ràng, màu xám lông chuột tới xám xanh, xốp hoặc mịn mượt. Nhiều cành bào tử phân sinh hình thành, màu nâu nhạt Bắt đầu hình thành bào tử Ngày 6 Nấm mọc kín đĩa, màu xám đen, đường kính 90,0 mm. Hình thành rất nhiều cành bào tử, màu nâu đậm Hình thành nhiều bào tử, màu xám nhạt Ngày 7 – 9 Nấm phát triển kín đĩa, sợi nấm mọc cao, màu xám đen. Tiếp tục hình thành cành bào tử, màu nâu đậm Hình thành rất nhiều bào tử, màu xám đậm. Bào tử mọc thành từng vòng tròn đồng tâm Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi phóng đại 40 lần có thể thấy vòng đậm màu đầu tiên tính từ tâm ra là vòng bào tử phát triển sau đó đến vòng có màu nhạt là các sợi nấm. Các vòng bào tử và sợi nấm này có độ dày và khoảng cách tính tới tâm 66 ra có sự biến đổi khác nhau. Sợi nấm to và sẫm màu phát triển tạo thành các tia hình rẻ quạt. Kết quả quan sát cho thấy các đặc điểm này của nấm được mô tả tương tự như Shoemaker (1959). Trong một số trường hợp nấm B. oryzae phát triển trên môi trường PGA với đặc điểm hình thái khác (hình 4.5) Về mặt hình thái, cách phát triển trên môi trường nhân tạo, các nguồn nấm thu thập tại Việt Nam phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới và không có sự khác nhau giữa các vùng miền. Hình 4.5. Đặc điểm hình thái của nấm B. oryzae trên môi trường PGA 67 Hình 4.5. Đặc điểm hình thái của nấm B. oryzae trên môi trường PGA 68 Màu sắc tản nấm nhìn chung từ màu xám lông chuột tới xám xanh, trên bề mặt tản nấm, sợi nấm phát triển có thể mịn mượt, có thể giống đám bông hoặc đám mây, có bề mặt phẳng không bông xốp; bào tử hình thành lưa thưa hoặc hình thành dầy đặc; tản nấm phát triển lan tỏa hoặc có rìa phân giới rõ ràng, tương tự với cách nhận biết nấm B. oryzae trong giám định các loài nấm Drechslera của Chidambaram (1973). Quá trình phát triển của nấm trên môi trường thường tạo thành các tia phát triển từ tâm ra ngoài có màu sắc đậm nhạt khác nhau (hình 4.4). Ngoài ra nấm có thể phát triển riêng về các hướng nhưng vẫn tạo các vòng đồng tâm (hình 4.5). Quan sát vào ngày thứ 7 trở đi có thể nhìn thấy bào tử nấm bị rụng và nằm trên bề mặt môi trường, bào tử không nảy mầm trong khoảng 48 giờ sau đó. 4.2.1.2. Kiểu nảy mầm của bào tử Sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trường PGA, bào tử nấm B. oryzae được sử dụng để nghiên cứu quá trình nảy mầm. Bào tử nấm B. oryzae được hòa vào giọt nước cất trên lam kính, đậy lại bằng lam men, bổ sung nước thường xuyên để bù vào lượng nước bị bay hơi. Quá trình nảy mầm được ghi nhận sau 2 giờ (hình 4.6). Hình 4.6. Bào tử nấm B. oryzae nảy mầm sau 2 giờ (Kiểu nảy mầm ở 2 đầu của bào tử và nảy mầm tại tế bào giữa của bào tử) 69 Theo dõi liên tục các biến động của bào tử bằng kính hiển vi quang học cho thấy quá trình nảy mầm của bào tử nấm B. oryzae xảy ra sau 2 giờ ở nhiệt độ 250C trong điều kiện đủ nước, ánh sáng nhẹ, không đòi hỏi thêm yêu cầu gì đặc biệt. Bào tử nấm B. oryzae nảy mầm theo 2 kiểu: chỉ nảy mầm ở tế bào 2 đầu của bào tử và nảy mầm tại tế bào giữa và cả tế bào tại hai đầu của bào tử (hình 4.6). Không tìm thấy bào tử nảy mầm tại một đầu. Trong quá trình quá trình nảy mầm, từ một tế bào có thể sinh ra từ 1 đến 2 ống mầm hình thành sợi nấm. Sau 24 giờ, phía đầu của các sợi nấm tạo thành dạng giác hút (hình 4.7). Tỷ lệ bào tử nấm B. oryzae nảy mầm theo kiểu ở 2 đầu bào tử xấp xỉ 70%. Kiểu nảy mầm của bào tử nấm B. oryzae trong các tài liệu được nghiên cứu trước đây đều cho rằng nảy mầm theo kiểu từ hai đầu của bào tử phân sinh là đặc trung của loài nấm này, tuy nhiên theo Dela (2006), bào tử nấm B. oryzae có 3 kiểu nảy mầm là nảy mầm ở 2 đầu bào tử, nảy mầm tại tế bào giữa bào tử và nảy mầm tại một đầu của bào tử trên môi trường RFA. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy phù hợp với nghiên cứu của Dela (2006), tuy nhiên kiểu nảy mầm ở một đầu của bào tử đã không quan sát thấy, có thể do sự đa dạng sinh học hoặc chưa bắt gặp trường hợp này trong nghiên cứu nên đã có khác biệt. Hình 4.7. Hình dạng của sợi nấm B. oryzae trong quá trình phát triển (Bào tử nảy mầm sau 24 giờ trong điều kiện đủ nước, 250C, 12 giờ dưới ánh sáng nhẹ và 12 giờ tối. Mũi tên chỉ các đầu sợi nấm tạo thành các giác hút). 4.2.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm trên môi trường PGA Nhiệt độ là một yếu tố môi trường rất quan trọng đối với sự phát sinh, phát triển và gây hại của các loài vi sinh vật đặc biệt là các loài nấm gây hại cây trồng. 70 Các loài nấm khác nhau yêu cầu các ngưỡng nhiệt độ thích hợp khác nhau để sinh trưởng và phát triển. Nếu có nhiệt độ thích hợp cho sự phát sinh, phát triển của nấm gây bệnh kết hợp với các yếu tố khác cũng thuận lợi sẽ gây thành dịch bệnh trên đồng ruộng. Vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của nấm B. oryzae nhằm tìm ra ngưỡng nhiệt độ thích hợp nhất là việc cần thiết để từ đó làm cơ sở cho biện pháp phòng trừ. Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm B. oryzae trên môi trường PGA Nhiệt độ (oC) Đường kính tản nấm sau cấy (mm) trên môi trường PGA Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 10 0,0 2,9 11,6 22,1 30,4e 15 1,0 10,1 13,5 19,4 43,4d 20 2,4 20,3 27,4 46,4 56,4c 25 5,3 20,4 34,3 61,5 70,6b 30 7,0 25,4 45,6 63,8 87,3a 35 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 40 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Kết quả trung bình trên 4 lần nhắc lại, các ký tự khác nhau có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05, CV=5,3%. Tiến hành nghiên cứu sự phát triển của nấm B. oryzae ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau trên môi trường PGA, mỗi ngưỡng cách nhau 50C với dải nhiệt độ từ 100C cho đến 400C. Theo dõi sự phát triển của nấm B. oryzae thông qua đường kính tản nấm trong các ngày từ 1 đến 5 sau khi nuôi cấy. Kết quả cho thấy ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau, sự phát triển của nấm B. oryzae sau các ngày nuôi cấy có sự khác nhau rõ rệt, nấm phát triển rất chậm ở ngưỡng 10oC, nấm phát triển chậm ở ngưỡng 15oC, phát triển nhanh ở ngưỡng 30oC và bị ức chế hoàn toàn không thể phát triển ở ngưỡng 35oC trở lên (bảng 4.13). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy phạm vi nhiệt độ thuận lợi cho sự sinh trưởng của nấm B. oryzae từ 20oC - 30oC, phù hợp với Shoemaker (1959) và các tác giả khác. Đây là phạm vi nhiệt thường có trong điều kiện tự nhiên ở cuối vụ xuân và vụ mùa của miền Bắc khi cây lúa bước vào giai đoạn trỗ và chín. Trong cả hai vụ, điều kiện nhiệt độ tự nhiên đã là một yếu tố thích hợp cho nấm xâm nhiễm và tồn tại trên hạt do trong giai đoạn phát triển sinh dưỡng ở vụ xuân nhiệt độ thấp còn ở vụ mùa nhiệt độ thường cao không phù hợp cho B. oryzae nhưng giai đoạn hình thành bông tạo hạt nhiệt độ lại phù hợp cho B. oryzae. 71 4.2.1.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Thử nghiệm sự phát triển và sinh bào tử của nấm B. oryzae trên một số môi trường nuôi cấy nhân tạo, kết quả thể hiện tại bảng 4.14 và 3.15. Môi trường thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm B. oryzae là PGA và MEA, hai loại môi trường này cung cấp nhiều cacbonhydrat, nấm phát triển nhanh chóng về kích thước, đường kính tản nấm tăng nhanh, sợi nấm phát triển dày đặc. Nấm phát triển kém nhất trên môi trường WA và RTA, hai loại môi trường này nghèo dinh dưỡng nên nấm phát triển chậm cả về kích thước lẫn sinh khối. Bảng 4.14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm B. oryzae Môi trường (25oC) Đường kính tản nấm sau cấy (mm) trên môi trường Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 PGA 7,0 25,4 45,6 63,8 87,3a RLPA 7,0 22,7 44,5 50,3 79,7b RTA 7,1 20,3 32,1 43,2 53,6ed RPA 6,9 19,8 40,1 51,3 73,6c RBLA 7,0 23,8 44,9 59,8 82,3b RLA 6,8 18,8 30,0 41,2 55,5d MEA 7,1 24,9 46,0 63,9 88,1a WA 6,8 16,7 29,5 36,8 52,6e Kết quả trung bình trên 3 lần nhắc lại, các ký tự khác nhau có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05, CV%=2,7% Lượng bào tử được đếm ở các ngày nuôi cấy thứ 4, 5, 6, 7. Bào tử sinh ra trên mỗi loại môi trường được đếm bằng cách pha loãng trong dung dịch nước muối 0,09%, sử dụng buồng đếm Marienfeld có độ sâu 0,200mm, diện tích ô 0,0625mm2. Kết quả được trình bày trong bảng 4.15. Trong điều kiện nhiệt độ 250C, ánh sáng chiếu với chu kỳ 12 giờ tối và 12 giờ sáng, môi trường thuận lợi cho sự sinh bào tử của nấm B. oryzae là PGA và MEA. Trên môi trường PGA, bào tử của nấm B. oryzae được sinh ra sớm nhất (ngày thứ tư đã xuất hiện) với số lượng nhiều nhất trong tất cả các ngày theo dõi tiếp theo. Các môi trường còn lại không thuận lợi cho sinh bào tử bào tử được sinh ra ít nhất trên môi trường RTA, môi trường WA nấm hoàn toàn không sinh bào tử sau 7 ngày. Theo một số kết quả nghiên cứu trên thế giới, môi trường PGA không phải là môi trường tốt nhất cho quá trình sinh bào tử của nấm B. oryzae. Tuy nhiên các môi trường thử nghiệm đều dễ dàng cho việc thực hiện, hiệu quả kinh tế do sử dụng với 72 các nguyên liệu dễ tìm, gần gũi với đối tượng nghiên cứu và không làm sai lệch các mục tiêu của thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với nghiên cứu của Hau (1980), Pratt (2006). Bảng 4.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh bào tử của nấm B. oryzae Môi trường (25oC) Lượng bào tử được sinh ra (103/ml) Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 PGA 0 0,01 0,93 5,63 10,72a RLPA 0 0 0,02 2,41 4,56d RTA 0 0 0 0 0,01g RPA 0 0 0,01 1,75 3,69e RBLA 0 0 0 0 0,01g RLA 0 0 0 0 0,18f MEA 0 0 0,02 2,49 8,54b WA 0 0 0 0 0 Kết quả trung bình trên 3 lần nhắc lại, các ký tự khác nhau có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05, CV%=12,9%. 4.2.1.5. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản tới khả năng lan truyền của nấm Khả năng tồn tại của nấm B.oryzae trong hạt giống lúa có ý nghĩa rất lớn trong quá trình lan truyền trên đồng ruộng. Quá trình B.oryzae tồn tại cùng với hạt qua thời gian là quá trình bảo tồn để gây hại ngay khi hạt giống được sử dụng. Việc vận chuyển các lô hạt giống bảo tồn B.oryzae từ địa phương này qua địa phương khác để gieo trồng dẫn đến tăng khả năng lan truyền của nấm. Tại Arhentina, nấm gây hại trên đồng ruộng trong đó bao gồm Alternaria, Bipolaris, Epicoccum, Curvularia, Cladosporium có tỷ lệ hạt nhiễm tăng cao nhất sau 4 tháng bảo quản và giảm dần ở các giai đoạn sau (Marii, 2013). Nghiên cứu khả năng tồn tại của nấm B.oryzae trong hạt giống lúa tại Việt Nam, chúng tôi nghiên cứu sự biến động về tỷ lệ hạt nhiễm nấm trong các lô hạt giống trong quá trình bảo quản. Để tạo hạt sạch có tỷ lệ hạt nhiễm 0%, hạt đã được xử lý sạch nấm B.oryzae bằng Till Super 300EC 0,3%. Hạt giống lúa được kiểm tra tỷ lệ hạt nhiễm nấm sau đó đựng trong túi giấy và bảo quản trong kho ở điều kiện nhiệt độ 200C. Hai giống lúa Hương thơm số 1 và Iri 352 được chọn để nghiên cứu, mỗi giống chọn mẫu thí nghiệm ở ba mức nhiễm nấm khác nhau. Sau thời gian bảo quản 3 tháng, 6 tháng và 9 tháng (tương ứng với các thời vụ sử dụng hạt giống để gieo trồng) các mẫu hạt 73 giống được kiểm tra để xác định tỷ lệ hạt nhiễm nấm B.oryzae. Nhìn chung khả năng bảo tồn để lan truyền của nấm không thay đổi sau 9 tháng (bảng 4.16). Bảng 4.16. Biến động về tỷ lệ hạt giống lúa nhiễm B. oryzae trong quá trình bảo quản Thời gian Mức độ nhiễm nấm Tỷ lệ hạt nhiễm nấm (%) IRi 352 Hương thơm số 1 Sau khi thu hoạch Không nhiễm 0 0 Nhiễm nhẹ 8,0 5,5 Nhiễm trung bình 28,0 12,5 Nhiễm nặng 50,0 45,0 Sau 3 tháng Không nhiễm 0 0 Nhiễm nhẹ 8,0 5,5 Nhiễm trung bình 28,0 12,5 Nhiễm nặng 50,0 44,5 Sau 6 tháng Không nhiễm 0 0 Nhiễm nhẹ 8,5 5,5 Nhiễm trung bình 28,0 13,5 Nhiễm nặng 51,5 44,5 Sau 9 tháng Không nhiễm 0 0 Nhiễm nhẹ 9,5 5,5 Nhiễm trung bình 29,0 13,5 Nhiễm nặng 53,0 44,5 TLB 30,0%: nhiễm nặng. Trên các mẫu hạt giống có tỷ lệ hạt nhiễm nấm thấp, 3 tháng sau thu hoạch và bảo quản tỷ lệ hạt nhiễm B.oryzae hầu hết không thay đổi, sau 6 tháng tỷ lệ hạt nhiễm nấm tăng nhẹ (trên giống IRi 352 là 1,5%). Trên nhóm các mẫu có tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao, tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae ổn định trong suốt thời gian lưu giữ 9 tháng. Kết quả nghiên cứu phù hợp với Ou (1985), Padmanabhan (1953) (nấm tồn tại trong mô bệnh 3 năm và tồn tại trên hạt giống lúa 1 năm). Như vậy để không ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng trong quá trình sản xuất, việc khuyến cáo không sử dụng các ruộng nhiễm nấm B.oryzae để làm giống là cần thiết. Để hạn chế nấm B.oryzae lan truyền, không lưu trữ và sử dụng các lô hạt giống đã nhiễm nấm B.oryzae. 74 4.2.1.6. Ảnh hưởng của hàm lượng amylose và protein tới sự phát triển của nấm Hàm lượng amylose và protein cho biết giống lúa có chất lượng cơm gạo ngon hay không, có đáp ứng mục đích của quá trình chọn tạo hay có phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng hay không. Để tìm hiểu chất lượng của hạt giống lúa có ảnh hưởng đến sự phát triển và gây hại trên hạt của nấm B. oryzaeg, chúng tôi đã tiến hành phân tích hàm lượng amylose, protein của các giống lúa đang được trồng phổ biến tại các tỉnh phía Bắc và ven biển miền Trung (bảng 4.17). Bảng 4.17. Ảnh hưởng của hàm lượng amylose, protein đến tỷ lệ hạt nhiễm nấm B. oryzae trên các giống lúa thuần STT Tên giống Tỷ lệ hạt nhiễm nấm trung bình (%) Hàm lượng amylose (% chất khô ) Hàm lượng protein (% chất khô) 1 Bắc thơm 7 4,4 17,21 7,08 2 Nàng xuân 3,2 17,18 7,51 3 LT2 4,0 21,01 7,21 4 T10 3,4 17,89 7,11 5 Hương thơm số 1 8,3 21,09 7,11 6 TBR-36 4,6 30,12 8,26 7 Bao thai lùn 4,6 18,68 8,15 8 BC 15 6,9 24,33 7,05 9 Khang dân 18 2,1 30,05 8,47 10 TBR-1 3,9 30,08 8,75 11 Q5 2,8 30,55 8,38 12 P6 3,9 22,15 6.20 13 IR 353-66 16,7 23,67 7,11 14 IR 64 5,8 24,50 7,04 15 Nếp Iri 352 8,8 6,97 6,63 16 Nếp 87 6,4 6,89 7,21 17 Nếp 97 4,9 6,11 7,36 18 Nếp cái hoa vàng 3,8 4,44 8,89 19 Nếp lang liêu 4,5 6,22 8,23 20 Nếp vải 2,4 4,41 7,98 Khi công nhận một giống lúa mới để đưa vào sản xuất, theo quy định tại 75 Việt Nam cũng như trên thế giới, 64 tính trạng được đánh giá để xem xét. Trong số đó hai chỉ tiêu chất lượng rất được quan tâm là hàm lượng amylose và protein. Hạt giống lúa có hàm lượng protein biến động từ trên 6% đến dưới 9%, với mức độ biến động này không thể xác định được mối liên quan giữa tỷ lệ hạt nhiễm nấm bệnh với hàm lượng protein. Tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao thường xuất hiện trên các giống có hàm lượng amylose thấp và trung bình, tuy nhiên mối quan hệ giữa tỷ lệ hạt nhiễm nấm và tỷ lệ amylose chưa rõ ràng nên cần có nghiên cứu sâu hơn để kết luận giống mẫn cảm với nấm B. oryzae có phụ thuộc vào hai chỉ tiêu này hay không. 4.2.2. Đặc điểm phân tử của nấm B. oryzae tại vùng gen ITS 4.2.2.1. Thu thập và phân tích mẫu Nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm B. oryzae đã được tiến hành tại một số nước, các kết quả đưa ra rất đa dạng và phong phú. Nấm B. oryzae có thể có sự đa dạng và không đa dạng tại các địa phương khác nhau hoặc trên cùng một địa điểm nghiên cứu (Misra et al., 1962; Weikert- Oliveira et al., 2002; Kamal and Mia, 2009; Burgos, 2013). Tại Việt Nam hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào được tiến hành để tìm hiểu đa dạng di truyền của nấm B. oryzae. Bước đầu tìm hiểu đa dạng của nấm B. oryzae tại các tỉnh phía Bắc và ven biển miền Trung, chúng tôi đã tiến hành thu thập các mẫu nấm gây hại trên hạt giống lúa khác nhau ở các địa phương khác nhau. Các mẫu nấm được đánh giá về hình thái trong quá trình gây hại trên hạt, được lựa chọn đại diện đặc trưng cho giống, đại diện cho các tỉnh tại hai miền Bắc và miền Trung. Các mẫu nấm sau khi được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo PGA đã được sàng lọc bằng mồi đặc hiệu với B. oryzae (Akihiro et al., 2007). Các mồi được sử dụng để nhận biết B. oryzae là PKS1Si-KpnI và PKS1Si-BglII, trình tự mồi (3‘-5‘) với vị trí giới hạn được gạch chân như sau: PKS1Si-KpnI: AAGGTACCAGTATCGCTCCTATGTTCGC; PKS1Si-BglII: CCAGATCTGATCTCGGAGACATCAACAC,. Các đặc điểm hình thái của nấm B. oryzae khi thu thập trên hạt được xắp sếp vào các nhóm từ I đến V bao gồm: - I- sợi nấm phát triển nhiều, sinh ít bào tử; - II- sợi nấm phát triển nhiều, sinh nhiều bào tử; - III- sợi nấm phát triển ít, sinh nhiều bào tử; - IV- sợi nấm phát triển ít, sinh ít bào tử; 76 - V- bao trùm toàn bộ hạt là bào tử nấm với mật độ dầy đặc gây chết cho hạt trong quá trình nảy mầm. 24 mẫu nấm đã được xác định là nấm B. oryzae (bảng 4.18). Kết quả cho thấy không có sự khác nhau giữa các địa phương, 5 nhóm hình thái đều xuất hiện tại các tỉnh. Các mẫu nấm này tiếp tục được lựa chọn để nghiên cứu giải trình tự gen trên vùng ITS tìm kiếm sự đa dạng sinh học. Bảng 4.18. Nguồn gốc các mẫu nấm B. oryzae trên hạt giống lúa thu thập tại các tỉnh phía Bắc và ven biển miền Trung STT Mẫu nấm Thu thập từ giống Địa điểm thu thập 1 BT7-I2 Bắc thơm số 7 Quảng Ninh 2 BT7-V4 Bắc thơm số 7 Ninh Bình 3 BC15-IV6 BC 15 Hải Dương 4 N97-II9 Nếp N97 Phú Thọ 5 VL50-IV10 Việt lai 50 Hà Nội (Gia Lâm) 6 VL50-III11 Việt lai 50 Hà Nội (Ba vì) 7 BT7-V12 Bắc thơm số 7 Hòa Bình 8 103S-III14 103S Lào Cai 9 NU838-III15 Nhị ưu 838 Nam Định 10 HYT100-IV16 HYT100 Hải Phòng 11 QN1-IV17 QN 1 Bắc Giang 12 Xi23-I18 Xi 23 Bắc Ninh 13 QR-III21 QR 1 Hải Phòng 14 HT1-III23 Hương thơm số 1 Bắc Cạn 15 HT1-I24 Hương thơm số 1 Thái Bình 16 Q5-III25 Q5 Thái Nguyên 17 KD18-II30 Khang dân 18 Hà Nam 18 BTL-IV31 Bao thai lùn Vĩnh Phúc