Luận án Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển acanthaster planci

DANH MỤC HÌNH .v

DANH MỤC SƠ ĐỒ. vii

DANH MỤC BẢNG.viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.x

MỞ ĐẦU.1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3

1.1. Giới thiệu chung về sao biển (Asteroidea) . 3

1.2. Các nghiên cứu về lớp chất steroid phân cực từ các loài sao biển . 4

1.2.1. Polyhydroxysteroid . 4

1.2.2. Steroid sulfate . 6

1.2.3. Steroid glycoside . 7

1.2.3.1. Polyhydroxysteroid glycoside . 8

1.2.3.2. Asterosaponin . 12

1.2.3.3. Cyclic steroid glycoside . 13

1.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực từ sao biển . 14

1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư . 15

1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus . 16

1.3.3. Hoạt tính điều hòa miễn dịch . 16

1.4. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu . 17

1.4.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của loài sao biển Acanthaster planci. 17

1.4.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci

trên thế giới . 18

1.4.2.1. Steroid tự do (sterol và polyhydroxysteroid) . 19

1.4.2.2. Polyhydroxysteroid glycoside .20

1.4.2.3. Asterosaponin . 20

1.4.2.4. Glycosphingolipid . 21

1.4.2.5. Các hợp chất khác . 24

1.4.3. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài sao biển Acanthaster planci 25

1.4.3.1. Hoạt tính tán huyết . 25

1.4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào . 25

1.4.4. Tình hình nghiên cứu loài sao biển Acanthaster planci tại Việt Nam . 26

pdf290 trang | Chia sẻ: honganh20 | Ngày: 03/03/2022 | Lượt xem: 237 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển acanthaster planci, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
olestane- 3β,4β,6α,8β,15β,16β-heptol) [95], chúng tôi nhận thấy các dữ liệu của phần nhân 64 steroid của chúng là tương tự nhau, chỉ khác nhau phần mạch nhánh ở vị trí từ C-23 đến C-25, và C-28 do vị trí liên kết glycoside và chuỗi disaccharide của chúng khác nhau. Khi so sánh độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử carbon từ C-20 đến C-28 của AP1 với hợp chất đã biết culcitoside C2, được phân lập từ sao biển Culcita novaeguineae [96], chúng tôi nhận thấy các độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử carbon hầu như tương đương nhau chỉ có sự khác biệt nhỏ ở vị trí C-24 (δC 45,9 ppm) và C-28 (δC 70,2 ppm) của AP1 chuyển dịch về phía trường yếu hơn một chút so với culcitoside C2 (δC 44,9 (C-24); 69,3 (C-28) ppm). Điều này chứng tỏ có sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate với một nhóm –CH2 vào vị trí C-24, và vị trí gắn kết của chuỗi carbonhydrate là ở vị trí C-28 (–CH2). Từ các phân tích ở trên, có thể khẳng định phần cấu trúc aglycon của AP1 có dạng 28-O-hydroxy-24-methyl-5α-cholestane- 3β,4β,6α,8β,15β,16β,28-heptol. Toàn bộ cấu trúc phẳng của phần aglycon của hợp chất AP1 được mô tả như trong hình 4.5. Phân tích dữ liệu phổ chuỗi disaccharide, phổ 1H có tín hiệu của hai proton anome ở vùng trường yếu lần lượt ở δH 4,82 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-1') và 4,94 (1H, d, J= 1,5 Hz, H-1"). Tương ứng với các tín hiệu này, trong phổ HSQC chỉ ra tín hiệu của hai carbon lần lượt ở độ chuyển dịch hóa học δC 109,7 (H-1') và 109,6 (H-1") ppm. Chiếu xạ proton anome trong phổ 1D TOCSY thu được tín hiệu độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác của H-1 đến H-6 của đường galactose và của H-1 đến H-5 của đường arabinose. Kết hợp với các dữ liệu phổ COSY, HSQC, HMBC và NOESY dẫn đến quy kết được tất cả các tín hiệu proton và carbon chuỗi carbohydrate của hợp chất AP1, ngoại trừ hai tín hiệu carbon ở δC 83,0 và 84,8 ppm của đơn vị galactose cùng có tương tác với một tín hiệu multiplet ở δH 3,98 ppm của proton H-2" và H-4" trong phổ HSQC. Phương pháp phổ H2BC đã được sử dụng để xác định độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử carbon này. Dựa trên sự xuất hiện tín hiệu tương tác của proton anome H-1" ở δH 4,94 với carbon bên cạnh là C-2" trong phổ H2BC nên giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-2" được xác định ở δC 83,0 ppm và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-4" được xác định ở δC 84,8 ppm. Các dữ liệu phổ NMR chuỗi disaccharide của AP1 (xem bảng 4.2) hoàn toàn trùng khớp với các dữ liệu phổ NMR của đơn vị đường cuối chuỗi là β-D-galactofuranosyl và đơn vị đường đầu chuỗi là α-L-arabinofuranosyl bị thế ở vị trí C-5' đã được công bố trước đây trong các hợp chất glycoside đã biết từ sao biển [30, 97, 98]. Sự gắn kết của chuỗi carbohydrate vào phần aglycon của phân tử và vị trí của liên kết glycoside của hai phân tử 65 đường được suy ra từ các đỉnh tương tác xa trong phổ NOESY và HMBC do có xuất hiện tín hiệu tương tác giữa H-1' của đường Araf với H2-28 (C-28) của phần aglycon, và tương tác giữa H-1" của đường Galf với H-5' (C-5') của đường Araf. Đơn vị đường α-arabinose được xác định ở cấu hình L và đơn vị β-galactose được xác định ở cấu hình D trong chuỗi carbohydrate của AP1 bởi có sự trùng khớp về độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác với phổ của các steroid glycoside cũng đã được phân lập từ loài sao biển A.planci và các loài sao biển khác [49, 50, 98]. Kết hợp tất cả các dữ liệu phổ 1D, 2D-NMR cho phép quy kết tín hiệu của tất cả các vị trí trong cấu trúc của AP1 (xem bảng 4.1, 4.2). Cấu hình của C-20 được xác định là 20R (20β-H) dựa trên các tương tác trong phổ NOESY của H3-18/H3-21 và H3-21/Heq-12, cũng như độ chuyển dịch hóa học của H3-21 ở δH 0,95 ppm, lớn hơn δH 0,90 ppm, đặc trưng cho các steroid đã được chứng minh có cấu hình 20R hay (20β-H) với mạch nhánh bão hòa (nếu cấu hình 20S thì δH< 0,90 ppm) [99, 100]. Để xác định cấu hình của C-24, hợp chất AP1 được tiến hành thủy phân chuỗi đường với dung dịch 2 M CF3COOH (xem 2.2.2), phần aglycon được phân lập bằng HPLC trên cột Ascentis RP-Amide. Phần aglycon (AP1a) được đo phổ 1H NMR để xác định cấu hình C-24. Kết quả cho thấy, các proton H2-28 xuất hiện dưới dạng hai tín hiệu tách biệt nhau ở δH 3,52 (dd, J = 6,3; 11,0 Hz) và 3,54 (J = 6,1; 11,0 Hz), và các proton H3-27 ở δH 0,870 (J = 6,7 Hz) và H3-26 ở δH 0,874 ((J = 6,7 Hz) có độ chuyển dịch hóa học gần nhau. Trong khi đó, trong trường hợp của epimer 24R, thì các proton H2-28 sẽ cộng hưởng như một tín hiệu broad doublet ở δH 3,52 (br d, J = 5,0 Hz) và các tín hiệu của H3-26 và H3-27 sẽ tách biệt nhau hơn [71]. Vì vậy, cấu hình của C-24 được xác định là S. Hình 4.5: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 Hình 4.6: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP1 66 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của hợp chất AP1 C δCac δH multab(J = Hz) HMBC (H→C) NOESY 1 39,7 1,70 m 0,97 m C3, C5 H19 2 26,2 1,82 m 1,54 m H19 3 73,7 3,42 m H5 4 69,1 4,26 br s C2, C10 5 57,2 0,94 m C6, C7, C10, C19 H3, H7 6 64,8 4,18 (dt, J = 4,5; 11,0 Hz) H19 7 50,1 2,46 (dd, J = 4,4; 12,2 Hz) 1,35 (t, J = 11,8 Hz) C5, C6, C8, C9 H5, H9, H14 8 77,1 - 9 58,4 0,82 (dd, J = 3,2; 12,4 Hz) H7, H14 10 38,1 - 11 18,9 1,76 m 1,40 m H18 12 43,4 1,94 m 1,11 m C9, C14 H18 H21 13 44,5 - 14 61,2 1,01 (d, J = 5,6 Hz) C8, C9, C12, C13, C15, C17 H7, H9 15 71,2 4,37 (dd, J = 5,6; 7,0 Hz) C13, C16, C17 16 72,8 4,20 (t, J = 7,0 Hz) C14, C15 17 62,8 0,96 m 18 17,9 1,23 s C12, C13, C14, C17 H11, H12, H21 19 17,0 1,15 s C1, C5, C9, C10 H1, H2, H6 20 31,4 1,90 m 21 18,6 0,95 (d, J = 6,6 Hz) C17, C20, C22 H18, H12 22 34,8 1,75 m 1,11 m 23 26,0 1,47 m 1,20 m H27 24 45,9 1,40 m C26, C27 H27 25 29,5 1,83 m C24, C26, C27 26 20,0 0,91 (d, J = 6,6 Hz) C24, C25, C27 27 19,9 0,89 (d, J = 6,6 Hz) C24, C25, C26 H23, H24, H28 28 70,2 3,71 m 3,32 m C23, C24, C25 H1', H27 H1', H27 a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz 67 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của hợp chất AP1 C δCac δH multab (J = Hz) HMBC (H→C) NOESY Araf 1' 109,7 4,82 (d, J = 1,7 Hz) C28, C3', C4' H28 2' 83,8 3,95 (dd, J = 1,7; 3,9 Hz) C3' 3' 79,1 3,89 (dd, J = 3,8; 6,5 Hz) C4', C5' 4' 83,4 4,01 m 5' 68,0 3,83 (dd, J = 5,1; 11,2 Hz) 3,66 (dd, J = 3,7; 11,2 Hz) C3', C4' C3', C4' H1" H1" Galf 1" 109,6 4,94 (d, J = 1,5 Hz) C5', C2", C3", C4" H5' 2" 83,0 3,98 m 3" 78,9 3,99 m 4" 84,8 3,98 m 5" 72,5 3,71 m C6" 6" 64,4 3,63 (dd, J = 5,8; 11,3 Hz) 3,62 (dd, J = 6,8; 11,1 Hz) C4", C5" a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz Từ tất cả các phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 được xác định là [(24S)-28-O-[(β-D-galactofuranosyl-(1→5)-α-L-arabinofuranosyl]-24-methyl- 5α-cholestane-3β,4β,6α,8β,15β,16β,28-heptol. Đơn vị đường β-D-galactofuranose ở cuối chuỗi đường và liên kết glycoside (1→5) là rất hiếm trong lớp chất polyhydroxysteroid glycoside của sao biển. Hơn nữa, chuỗi disaccharide β-D-Galf- (1→5)-α-L-Araf lần đầu tiên được tìm thấy trong nhóm các steroid từ sao biển. AP1 được xác định là chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và đặt tên là Planciside A. 4.1.2. Hợp chất AP2: Planciside B (Hợp chất mới) Hợp chất AP2 phân lập được ở dạng chất rắn, vô định hình. Phổ khối phân giải cao (+)-HR ESI-MS của AP2 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 813,4476 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C40H70O15Na = 813,4612). Phổ (–)-HR ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 789,4891 [M–H] (tính toán lý thuyết cho CTPT C40H69O15 = 789,4642). Như vậy, CTPT của AP2 được xác định là C40H70O15 (M = 790). Mảnh ion giả phân tử ở m/z 813 [M + Na]+ tiếp tục được bắn phá bằng kỹ thuật (+)-HR ESI-MS/MS thu được các pic ion lần lượt ở m/z: 667 [(M + Na) - C6H10O4]+, 521 [(M + Na) – C6H10O4 – C6H10O4]+. Đồng thời, thực hiện bắn phá tiếp mảnh ion ở m/z 789 [M – H] bằng kỹ thuật (–)-HR ESI-MS/MS cũng thu được các pic ion tương 68 ứng với sự mất lần lượt của một và hai đơn vị C6H10O4 ở các tín hiệu m/z 643 [(M – H) – C6H10O4]; 497 [(M – H) – C6H10O4 – C6H10O4]. Điều này phù hợp với sự mất của một đơn vị đường deoxyhexose và một đơn vị đường O-methyl-pentose. Hình 4.7: Phổ (+)-HR ESI-MS của hợp chất AP2 Hình 4.8: Phổ (–)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2 Hình 4.9: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2 69 So sánh các dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất AP2 với hợp chất AP1, nhận thấy các dữ liệu phổ phần aglycon của chúng gần như trùng khớp nhau, chỉ có sự khác biệt ở phần chuỗi disaccharide (xem bảng 4.1 và bảng 4.3). Như vậy, có thể kết luận rằng hợp chất AP2 cũng có cấu trúc của phần aglycon là 24-methyl-5α- cholestane-3β,4β,6α,8β,15β,16β,28-heptol. Phổ 1H-NMR của AP2 có hai tín hiệu của hai proton anome ở δH 4,31 (J = 7,2Hz) và 5,21 ppm (J = 3,0Hz), tương quan với chúng là tín hiệu của hai carbon tương ứng ở δC 103,8 và 100,1 ppm. Một đơn vị đường 6-deoxyhexose được gợi ý có mặt trong chuỗi diasaccharide bởi sự xuất hiện của một tín hiệu doublet đặc trưng cho một nhóm methyl ở δH 1,17 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-6"). Khi chiếu xạ proton anome bằng kỹ thuật 1D TOCSY thu được độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác của H-1' đến H-5' của một đơn vị đường O-methyl-pentose; và của H-1" đến H-4" của một đơn vị đường 6-deoxyhexose. Dữ liệu phổ 2D NMR cho phép gán tất cả các tín hiệu trên phổ NMR của chuỗi disaccharide (xem bảng 4.3). Một tương tác trong phổ HMBC của H-3' với carbon OMe của đơn vị đường O-methyl-pentose đã chỉ ra rằng nhóm O- methyl gắn vào phân tử đường ở vị trí C-3'. Các tín hiệu của carbon và proton, cùng với các hằng số tương tác tương ứng của đơn vị đường O-methyl-pentose giống với dữ liệu của đơn vị đường không thế 3-O-methyl-β-xylopyranosyl đã được xác định trong hợp chất milleporoside A, phân lập từ loài sao biển Fromia milleporell [101], ngoại trừ tín hiệu của C-2' và H-2' đã bị dịch chuyển về vùng trường yếu từ δC 74,5 tới 76,3 ppm và từ δH 3,23 tới 3,42 ppm là do ảnh hưởng của liên kết glycoside ở vị trí C-2' của phân tử đường. Giá trị hằng số tương tác nhỏ J = 3,0 Hz giữa H-1" và H-2" của đơn vị đường 6-deoxyhexose chỉ ra sự định hướng equatorial của proton H-1"; giá trị hằng số tương tác lớn J = 10,0 Hz giữa H-2" với H-3" chỉ ra sự định hướng axial cho cả hai proton này; và giá trị nhỏ J = 2,9 Hz giữa H-3" với H-4" biểu thị sự định hướng equatorial của proton H-4". Các dữ liệu này kết hợp cùng với tín hiệu tương tác trong phổ NOESY của H-3"/H-5", cho phép khẳng định hai proton này ở dạng cis với nhau. Như vậy, có thể kết luận rằng phân tử monosaccharide thứ hai có dạng α-fucopyranose. Thêm vào đó, dữ liệu phổ 13C-NMR của đơn vị monosaccharide này trùng khớp với dữ liệu của một đơn vị đường α-fucopyranose ở cuối mạch của hợp chất stereonsteroid G phân lập từ loài san hô mềm Stereonephthya crystalliana [102]. 70 Vị trí liên kết glycoside giữa hai phân tử đường và vị trí gắn kết của chuỗi disaccharide với phần aglycon của phân tử được xác định bằng các tương tác trong phổ HMBC và NOESY. Cụ thể là có xuất hiện tương tác giữa H-1' của đơn vị đường 3- OMe-Xylp với H2-28 (C-28) của phần aglycon trên phổ NOESY; và H-1" của đơn vị đường Fucp với H-2' (C-2') của đơn vị 3-OMe-Xylp trên phổ HMBC. Điều này thể hiện chuỗi disaccharide gắn kết với phần aglycon ở vị trí C-28, và vị trí liên kết glycoside của đơn vị Fucp với đơn vị 3-OMe-Xylp là (1→2). Đây là lần đầu tiên đơn vị đường α- fucose được tìm thấy trong lớp chất steroid glycoside của sao biển. Đơn vị đường β-D- fucose thường có mặt trong lớp chất chuyển hóa thứ cấp này. Trước đây, đơn vị đường α-L-fucopyranose đã được tìm thấy trong lớp chất steroid glycoside từ một số nguồn sinh vật biển khác, như san hô mềm hay bọt biển. Vì vậy, dựa vào sự tương đồng với các steroid glycoside này, cấu hình L được đề cử cho đơn vị α-fucopyranose. Cấu hình D của đơn vị 3-O-methyl-β-xylopyranose của AP2 được ưu tiên hơn như là β-D- xylopyranose, và đơn vị O-methyl hay di-O-methyl-β-D-xylopyranose là thường gặp nhất trong số các steroid glycoside từ sao biển. Từ tất cả các phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 được xác định là [(24S)-28-O-[α-L-fucopyranosyl-(1→2)-3-O-methyl-β-D-xylopyranosyl]-24- methyl-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,15β,16β,28-heptol. Cấu trúc của AP2 được mô tả như hình 4.10. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là Planciside B. Hình 4.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 Hình 4.11: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP2 71 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP2 C δCac δH multab (J = Hz) HMBC (H→C) NOESY 1 39,6 1,70 m 0,97 m 2 26,2 1,82 m 1,55 m 3 73,7 3,42 m H5 4 69,1 4,26 br s C10 5 57,2 0,94 m H3, H7 6 64,8 4,18 (dt, J = 4,5; 11,0 Hz) H19 7 50,0 2,46 (dd, J = 4,6; 12,0 Hz) 1,35 (t, J = 12,2 Hz) C5, C6, C8, C9 C5, C6 H5, H9, H14 8 77,1 - 9 58,4 0,82 (dd, J = 3,2; 12,4 Hz) H7, H14 10 38,2 - 11 18,9 1,76 m 1,41 m 12 43,4 1,94 m 1,11 m C9 H18, H21 H17 13 44,5 - 14 61,2 1,01 (d, J = 5,7 Hz) C8, C9, C13, C15, C17, C18 H7, H9 15 71,2 4,38 (dd, J = 5,6; 7,1 Hz) C13, C17 16 72,8 4,20 (t, J = 7,1 Hz) C13, C14 H22 17 63,0 0,94 m H12 18 17,9 1,23 s C12, C13, C14, C17 H12, H20 19 17,0 1,15 s C1, C5, C9, C10 H6 20 31,5 1,90 m H18 21 18,6 0,94 (d, J = 6,5 Hz) C17, C20, C22 H12 22 35,0 1,73 m 1,08 m H16 23 25,6 1,46 m 1,10 m H27 24 46,3 1,37 m H27, H28 25 28,9 1,86 m C27 26 20,1 0,89 (d, J = 6,8 Hz) C24, C25, C27 H28 27 19,2 0,87 (d, J = 6,8 Hz) C24, C25, C27 H23, H24, H28 28 71,6 3,78 (dd, J = 6,5; 9,5 Hz) 3,42 m C1’, C23, C24, C25 C1’, C23, C24, C25 H1', H24, H26, H27 H24, H26, H27 3-OMe-Xylp 1' 103,8 4,31 (d, J = 7,2 Hz) C28, C2', C3', C5' H28, H3', H5' 2' 76,3 3,42 (dd, J = 7,1; 8,6 Hz) 72 3' 88,2 3,27 (t, J = 8,5 Hz) OMe, C2', C4' H1' 4' 71,7 3,57 m 5'eq 5'ax 66,7 3,82 (dd, J = 5,7; 11,7 Hz) 3,20 (dd, J = 9,8; 11,5 Hz) C1', C3', C4' C1', C3', C4' H4’ H1' OMe 60,8 3,61 s C3' H3', H1" Fucp 1" 100,1 5,21 (d, J = 3,0 Hz) C2', C2", C3", C5" H2', OMe 2" 70,2 3,70 (dd, J = 3,3; 10,1 Hz) C3" 3" 71,7 3,72 (dd, J = 2,9; 10,0 Hz) C2" H5" 4" 73,8 3,65 brs C2", C3" H5", H6" 5" 67,6 4,33 (brq, J = 6,7 Hz) C1", C4", C6" H3", H4" 6" 16,8 1,17 (d, J = 6,6 Hz) C4", C5" H4" a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz 4.1.3. Hợp chất AP3: Planciside C (Hợp chất mới) Hợp chất AP3 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình. Trên phổ (+)-HR ESI-MS của chất AP3 xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 915,3855 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C40H69O18SNa2 = 915,4000). Phổ (–)-HR ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 869,4461 [M–Na] (tính toán lý thuyết cho CTPT C40H69O18S = 869,4210). Như vậy, CTPT của AP3 được xác định là C40H69O18SNa (M = 892). Mảnh ion giả phân tử ở m/z 915 [M + Na]+ tiếp tục được bắn phá bằng kỹ thuật (+)-HR ESI-MS/MS thu được pic ion ở m/z 795 tương ứng với sự mất của đơn vị NaHSO4 [(M + Na) – NaHSO4]+; mảnh ion giả phân tử ở m/z 869 tiếp tục được bắn phá bằng kỹ thuật (–)-HR ESI-MS/MS thu được pic ion ở m/z 97 tương ứng với pic ion của [HSO4] điều này khẳng định chắc chắn rằng AP3 có chứa một nhóm sulfate trong cấu trúc phân tử. Ngoài ra, trong phổ (+)-HR ESI-MS/MS khi bắn phá mảnh ion ở m/z 915 [M + Na]+ còn xuất hiện các mảnh ion ở m/z: 635 [(M + Na) – NaHSO4 – C7H12O4]+, 503 [(M + Na) – NaHSO4 – C7H12O4 – C5H8O4]+, và 315 [C7H12O4 + C5H8O4 + Na]+. Tương tự, trong phổ (–)-HR ESI-MS/MS khi bắn phá mảnh ion ở m/z 869 cũng thu được các pic ion khác được quy kết như sau: ở m/z 709 [(M – Na) – C7H12O4], 577 [(M – Na) – C7H12O4 – C5H8O4]. 73 Hình 4.12: Phổ (+)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3 Hình 4.13: Phổ (–)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3 Từ các dữ liệu phân tích phổ MS/MS ở trên, có thể xác định các mảnh ion thu được trong hai phổ này phù hợp với sự mất của đơn vị đường di-O-methyl-pentose và đơn vị đường pentose. Như vậy trong cấu trúc phân tử AP3 có chứa hai đơn vị đường, có thể là một chuỗi diasaccharide hoặc hai đơn vị monosaccharide tách biệt nhau. Khi so sánh dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của AP3 với dữ liệu phổ phần aglycon của AP1, nhận thấy các tín hiệu phần aglycon của chúng gần như trùng khớp nhau, chỉ có sự khác biệt duy nhất với phần aglycon của AP1 là có xuất hiện một tín hiệu của một nhóm sulfate ở vị trí C-6 của AP3 (xem bảng 4.1 và bảng 4.4), bởi vì có sự chuyển dịch hóa học về phía trường thấp của tín hiệu H-6 từ δH 4,26 (của AP1) tới δH 4,92 ppm (của AP3), và của C-6 từ δC 69,1 (của AP1) tới δC 74,5 (của AP3) ppm. Vì vậy, có thể khẳng định chất AP3 có phần khung aglycon giống chất AP1, chỉ khác ở vị trí C-6 của AP3 được thế bởi một nhóm sulfate (xem phụ lục phổ NMR của AP3). Cấu trúc nhân steroid của AP3 được xác định có dạng [28-O-glycosylated-24-methyl-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,15β,16β,28- 74 heptol] 6-O-sulfate. Việc kết hợp tất cả các dữ liệu phổ 1D, 2D NMR của AP3 cho phép xác định, gán được các tín hiệu H và C của AP3 (xem bảng 4.4). Khi so sánh các dữ liệu phổ chuỗi disaccharide của AP3 thấy trùng khớp với các dữ liệu chuỗi disaccharide của hợp chất đã biết Certonardoside B2 được phân lập từ sao biển Certonardoa semiregularis [12] (xem bảng 4.5). Do vậy, có thể khẳng định chuỗi disaccharide của AP3 là sự kết hợp của hai đơn vị đường 2,4-di-O-methyl-β-D- xylopyranosyl và α-L-arabinofuranosyl. Vị trí gắn kết giữa hai đường này và vị trí liên kết giữa chuỗi đường với phần aglycon được xác định bởi các tương tác trong phổ ROESY và HMBC của AP3. Do có xuất hiện tương tác giữa H-1' của đường Araf với H2-28 (C-28) của phần aglycon trong, và tương tác giữa H-1" của đơn vị đường 2,4-di- O-Me-Xylp với H-2' (C-2') của đường Araf. Như vậy, vị trí liên kết giữa hai phân tử đường trong chuỗi disaccharide là (1→2) và vị trí gắn với phần aglycon của chuỗi đường là vị trí C-28. Toàn bộ cấu trúc phẳng của phần aglycon của chất AP3 và chìa khóa tương tác giữa các vị trí trong phân tử được mô tả như trong hình 4.14 và 4.15. Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của chất AP3 Hình 4.15: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP3 Kết hợp tất cả các dữ liệu phân tích ở trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP3 được xác định là [(24S)-28-O-[2,4-di-O-methyl-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-α-L- arabinofuranosyl]-24-methyl-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,15β,16β,28-heptol] 6-O-sulfate. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là Planciside C. 75 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP3 C δCac δH multab (J = Hz) HMBC (H→C) ROESY 1 39,4 1,72 m 1,00 m H9 2 26,5 1,82 m 1,57 m 3 72,9 3,45 m H5 4 68,9 4,30 br s C3 5 56,0 1,13 m H3, H7, H9 6 74,5 4,92 (dt, J = 4,4; 11,1 Hz) H19 7 47,9 2,72 (dd, J = 4,4; 12,2 Hz) 1,54 (t, J = 12,0 Hz) C5, C6, C8,C9 C5, C6 H15 H5, H9, H14 8 77,2 9 58,1 0,84 (dd, J = 3,0; 12,5 Hz) H1, H5, H7, H12, H14 10 38,7 11 18,8 1,76 m 1,40 m H18, H19 12 43,4 1,94 m 1,11 m H21 H9, H21 13 44,6 14 61,0 1,03 (d, J = 5,6 Hz) C8, C13, C15, C17, C18 H7, H9 15 71,1 4,38 (dd, J = 5,6; 6,8 Hz) C13, C17 H7 16 72,9 4,20 (t, J = 6,8 Hz) C13, C14 H22 17 62,9 0,94 m C18 18 17,9 1,23 s C12, C13, C14, C17 H11, H20 19 16,9 1,23 s C1, C5, C9, C10 H6, H11 20 31,4 1,91 m H18 21 18,6 0,95 (d, J = 6,8 Hz) C17, C20, C22 H12, H23 22 34,8 1,75 m 1,12 m H16 H24 23 26,1 1,46 m 1,24 m H21 24 45,9 1,40 m H22, H28 25 29,5 1,83 m 26 20,1 0,89 (d, J = 7,0 Hz) C24, C25, C27 H28 27 19,8 0,91 (d, J = 7,0 Hz) C24, C25, C26 28 70,2 3,72 (dd, J = 5,8; 9,6 Hz) 3,28 m C23, C25 H1', H24, H26 H1' a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz 76 Bảng 4.5: Bảng so sánh dữ liệu chuỗi đường của AP3 với TLTK C AP3 Certonardoside B2[12] δHab δCac δHad δCae Araf 1' 4,96 (d, J = 1,5 Hz) 108,3 4,96 (br s) 108,1 2' 4,05 (dd, J = 1,5; 4,0 Hz) 91,9 4,06 (dd, J = 1,3; 3,8 Hz) 91,6 3' 3,95 (dd, J = 4,0; 7,6 Hz) 77,6 3,95 (dd, J = 3,8; 7,8 Hz) 77,7 4' 3,88 m 84,0 3,88 (ddd, J = 3,0; 5,5; 8,0 Hz) 84,3 5'eq 5'ax 3,76 (dd, J = 3,1; 12,1 Hz) 3,62 (dd, J = 5,7; 12,1 Hz) 62,7 3,76 (dd, J = 3,3; 12,0 Hz) 3,62 (dd, J = 5,5; 12,0 Hz) 62,7 2,4-di-OMe-Xylp 1" 4,41 (d, J = 7,6 Hz) 104,8 4,43 (d, J = 8,0 Hz) 104,5 2" 2,86 (dd, J = 7,6; 9,0 Hz) 84,8 2,85 (dd, J = 7,8; 9,3 Hz) 84,9 3" 3,38 (t, J = 9,0 Hz) 76,5 3,38 (t, J = 8,8 Hz) 76,5 4" 3,17 (ddd, J = 5,0; 8,7; 10,0 Hz) 80,9 3,18 (ddd, J = 4,8; 8,3; 10,0 Hz) 80,8 5"eq 5"ax 4,01 (dd, J = 5,1; 11,3 Hz) 3,12 (dd, J = 10,0; 11,3 Hz) 64,5 4,01 (dd, J = 4,5; 11,0 Hz) 3,13 (dd, J = 10,0; 11,0 Hz) 64,4 2"-OMe 3,55 s 61,2 3,56 s 61,2 4"-OMe 3,45 s 59,0 3,46 s 59,1 a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz; d500 MHz, e125 MHz 4.1.4. Hợp chất AP4: Planciside D Hợp chất AP4 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình. Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử (+)-HR ESI-MS của AP4 có xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 927,4954 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C45H76O18Na = 927,4924). Phổ (–)-HR ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 903,4951 [M – H] (tính toán lý thuyết cho CTPT C45H75O18= 903,4959). Dữ liệu phổ MS gợi ý rằng hợp chất AP4 có CTPT là C45H76O18 (M = 904). Dữ liệu phổ 13C NMR, HSQC cho thấy hợp chất này có chứa 45 nguyên tử cacbon bao gồm: 6 nhóm methyl (-CH3); 10 nhóm methylen (-CH2); 23 nhóm metin (CH) trong đó có 1 nhóm CH=; 4 carbon bậc bốn trong đó có 1 carbon liên kết trực tiếp với oxi và 1 carbon sp2; và một nhóm methoxyl. Phổ 1H, 13C NMR và HSQC của phần aglycon cho thấy tín hiệu của hai nhóm methyl góc dưới dạng singlet của H3C-18 ở δH 1,12 (δC 16,8) và H3C-19 ở δH 1,36 (δC22,7) ppm; một liên kết đôi dạng broad singlet ở δH 5,64 ppm và δC 126,9 (C4), 148,3 (C5) ppm; 4 nhóm oxymetin HC-3 (δH 4,18 ppm; δC 77,5 ppm), HC-6 (δH 4,30 ppm; δC 76,4 ppm), HC-15 (δH 4,16 ppm, dd, J = 2,6; 10,7 Hz; δC 80,9 ppm), và 77 HC-16 (δH 3,97 ppm, dd, J = 2,6; 7,4 Hz; δC 83,0 ppm); và một carbon bậc 4 có gắn với nguyên tử oxy ở δC 76,2 ppm. Dữ liệu phổ cũng cho thấy mạch nhánh của phần aglycon có ba nhóm methyl H3C-21 (δH 0,93 ppm, d, J = 6,8 Hz; δC 18,7 ppm), H3C-26 (δH 0,90 ppm, d, J = 6,8 Hz; δC 20,4 ppm), và H3C-27 (δH 0,88 ppm, d, J = 6,8 Hz; δC 19,5 ppm); và nhóm oxymethylen H2C-28 (δH 3,78 ppm, dd, J = 6,5; 9,3 Hz; δH 3,45 ppm, m; δC 71,5 ppm) liên kết với chuỗi carbohydrate bởi liên kết glycoside. Những dữ liệu của AP4 cho thấy hợp chất này có khung steroid dạng 28-O-24-methylcholestane với chuỗi glycoside ở vị trí C-28 như của các hợp chất AP1, AP2 và AP3 ở trên. Hình 4.16: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4 Hình 4.17: Phổ 13C NMR của hợp chất AP4 78 Tất cả các dữ liệu phổ 1H, 13C NMR được quy kết thông qua sự kết hợp với các phổ 2D NMR. Sự tương quan trong phổ COSY và HSQC của các proton cho thấy sự ghép nối các chuỗi cấu trúc từ C-1 đến C-4, C-6 đến C-7, C-9 đến C-12 qua C-11, từ C-14 đến C-17, C-17 đến C-21, C-22 đến C-27, và C-24 đến C-28. Phổ HMBC cho thấy các tương tác xa của proton với các cacbon xung quanh như của H-4 với C-6 và C-10; của H3-18 với C-12, C-13, C-14 và C-17; của H-14 với C-13, C15 và C-18; của H3-19 với C-1, C-5, C-9 và C-10; của H3-21 với C-17, C-20 và C-22; của H3-26 với C- 24, C-25 và C-27; và của H3-27 với C-24, C-25 và C-26, và cho phép xác định cấu trúc tổng thể của phần aglycon của hợp chất AP4. Tín hiệu cộng hưởng của C-5 ở δC 148,3 ppm và của C-10 ở δC 37,6 ppm không được quan sát thấy trên phổ 13C NMR và HSQC, chúng được tìm thấy nhờ tương tác của H3-19 với C-5 và của H-4 với C-10 trong phổ HMBC. Tất cả độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon chứng minh rằng hợp chất AP4 có cấu trúc phần aglycon là 24-methyl-cholest-4-ene- 3β,6β,8,15α,16β,28-hexaol với liên kết glycoside ở vị trí C-3 và C-28. Trên phổ proton có xuất hiện 3 tín hiệu doublet tại δH 4,30 (d, J =7,6 Hz), 4,41 (d, J =7,8 Hz), và 5,26 (d, J =2,9 Hz) ppm đặc trưng của các proton anome. Tương ứng với các tín hiệu proton này trên phổ HSQC là các carbon anome ở δC 101,0; 103,9; và 104,6 ppm. Điều này cho thấy, trong cấu trúc của AP4 có chứa 3 đơn vị monosaccharide. Đồng thời, hằng số tương tác J của hai proton anome là 7,6 và 7,8 Hz và một proton anome là 2,9 Hz chứng tỏ có hai monosaccharide dạng β và một monosaccharide dạng α. Tín hiệu doublet của một nhóm methyl ở δH 1,18 ppm chứng tỏ rằng AP4 có chứa một đơn vị đường là 6-deoxyhexose. Các phân tích này cũng phù hợp với sự phân tích phổ khối lượng phân giải cao HR ESI-MS/MS. Phổ (+)-HR ESI-MS/MS của mảnh m/z 927 [M + Na]+ thu được các mảnh ion ở m/z: 781 [(M + Na) – C6H10O4]+ tương ứng với sự mất của một đơn vị 6-deoxyhexose (hoặc O-methylpentose); 649 [(M + Na) – C6H10O4 – C5H8O4]+ tương ứng với sự mất của hai đơn vị monosaccharide trong đó có một đơn vị pentose; và 5

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_phan_lap_chuyen_hoa_va_danh_gia_tac_dung.pdf
Tài liệu liên quan