Luận án Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn streptomyces G246, G261, G248 thu thập tại vùng biển miền trung - Việt Nam

ng số vật lí và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp. G246 3.6.3.1. Hợp chất G246-1: 6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone Chất rắn trắng. Độ quay cực [α]D 25 = -28,29 (MeOH, 0,8). Phổ IR (KBr) max: 3299, 2992, 1670, 1670, 1596, 1502, 1423, 1352, 1269, 1206, 1002, 920, 849 cm -1 . HR-ESI-MS (positive-ion mode) m/z 439,2115 [M+H] + (số khối 439,2121 được tính cho công thức C26H31O6). Công thức phân tử C26H30O6, M=438. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD), Xem bảng 4.1. 3.6.3.2. Hợp chất G246-2: 5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone Chất rắn vô định hình, màu vàng. Độ quay cực [α]D 25 = -8,6 (CH2Cl2, 0,25) IR (KBr) max: 3695, 2925, 1605, 1546, 1449, 1233, 1141, 1104, 511 cm -1 . 53 HR-ESI-MS (positive-ion mode) m/z 439,2115 [M+H] + (số khối 439,2121 được tính cho công thức C26H31O6). Công thức phân tử C26H30O6, M=438. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), Xem bảng 4.2. 3.6.3.3. Hợp chất G246-3: cyclo-(Pro-Gly) Chất rắn màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 210-211oC Độ quay cực [α]D 25 -142,5 (c 0,40; MeOH) ESI-MS: m/z 155 [M+H] + Công thức phân tử C7H10N2O2, M = 154 IR (KBr) νmax (cm -1 ) 3406; 2929; 1744; 1650; 1431; 1382; 707; 543 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Xem bảng 4.3. 3.6.3.4. Hợp chất G246-4: cyclo-(L-Pro-L-Tyr) Chất rắn màu trắng. Độ quay cực [α]D 25 -120,5 (c 0,30; MeOH) HR-ESIMS: m/z 261,1224 [M+H] + Công thức phân tử C14H16N2O3, M=260 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.4. 3.6.3.5. Hợp chất G246-5: cyclo-(D-Pro-L-Tyr) Chất rắn màu trắng. Độ quay cực [α]D 25 + 100,5 (c 0,20; MeOH) HR-ESI-MS: m/z 261,1224 [M+H] + Công thức phân tử C14H16N2O3, M= 260 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.5. 3.6.3.6. Hợp chất G246-6: cyclo-(Pro-Ala) Chất rắn màu trắng. Độ quay cực [α]D 25 – 78,2 (c 0,32; MeOH) Nhiệt độ nóng chảy 140-141oC ESI-MS: m/z 207 [M+K] + Công thức phân tử C8H12N2O2, M = 168 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Xem bảng 4.6. 3.6.3.7. Hợp chất G246-7: norharman Chất rắn màu trắng. 54 ESI-MS: m/z 169 [M+H] + Công thức phân tử C11H8N2, M = 168 1 H NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.7. 3.6.3.8. Hợp chất G246-8: tryptophan Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 205 [M+H] + Công thức phân tử C11H12N2, M = 204 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 3,18 (1H, dd, J = 9,5; 15,0 Hz, H-3a); 3,53 (1H, 3,5; 10,0 Hz, H-3b), 3,88 (1H, dd, J = 3,5; 9,0 Hz, H-2), 7,05-7,70 (5H, m, H- indol). 3.6.3.9. Hợp chất G246-9: indol-3-carboxylic acid Chất rắn màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 231-232oC ESI-MS: m/z 162 [M+H] + Công thức phân tử C9H7NO2, M = 161 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.8. 3.6.3.10. Hợp chất G246-10: phenyl alanin Chất rắn màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 145-146oC ESI-MS: m/z 166 [M+H] + Công thức phân tử C9H11NO2, M = 165 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.9. 3.7. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 3.7.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết Dịch nuôi cấy (50 lít) của chủng Streptomyces sp. G261 sau 10 ngày nuôi cấy được ly tâm 12000 vòng trong 10 phút, thu dịch bỏ cặn tế bào. Sau đó chiết với dung môi ethyl acetat (5 lít x 5 lần), loại dung môi thu được cặn chiết ethyl acetat, kí hiệu EG261 (12,15 gam). Phần dịch nước được chiết tiếp với dung môi n-butanol (5 lít x 5 lần), loại dung môi thu được cặn chiết n-butanol kí hiệu BG261 (32,42 gam), phần còn lại là dịch nước. 55 Hình 3. 8. Sơ đồ tạo cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G261 3.7.2. Phân lập các chất từ cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G261 Khảo sát cặn chiết EtOAc EG261 (12,15 g) và BG261 (32,42 gam) bằng sắc ký bản mỏng TLC với các hệ dung môi khác nhau ta thấy chúng khá tương đồng nên chúng tôi đã gộp chung 2 cặn chiết này lại với nhau, kí hiệu G261 (44,57 gam). Tiến hành sắc ký cột silica gel cặn G261 (44,52 gam) với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient thu được 17 phân đoạn, F1- F17. Tinh chế phân đoạn F3.3 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH 10 % thu được 6 phân đoạn nhỏ, F3.3.1 đến F3.3.6. Phân đoạn F3.3.4 tinh chế trên sắc ký bản mỏng điều chế TLC với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (8/2) thu được 10 mg chất G261-8. Phân đoạn F4 được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/EtOAc 10 % thu được 4 phân đoạn nhỏ, F4.1- F4.4. Tinh chế phân đoạn F4.2 bằng sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexan/aceton (95/5) thu được 5 mg chất G261-1. Phân đoạn F5 sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (9/1) thu được 6 phân đoạn nhỏ, F5.1- F5.6. Tinh chế phân đoạn F5.3 trên cột silica gel với hệ dung môi n- hexane/acetone (5% acetone) thu được 5 mg chất G261-2. Tinh chế phân đoạn F5.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradient, sau đó kết tinh phân đoạn trong hệ dung môi n-hexan/aceton (1/9) thu được chất G261-3 (3 mg). Phân đoạn F5.6 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi rửa giải là methanol thu được 3 phân đoạn nhỏ, F5.6.1 – F5.6.3. Kết tinh lại phân đoạn F5.6.2 bằng hệ n-hexane/acetone (1/9) thu được chất G261-4 (4 mg). Phân đoạn F6 sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với 56 hệ dung môi n-hexane/acetone (95/5) thu được 5 phân đoạn nhỏ, F6.1- F6.5. Tinh chế phân đoạn F6.3 bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/ EtOAc (3/1) thu được chất G261-5 (5 mg). Phân đoạn F11 sau khi tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải MeOH thu được 7 phân đoạn nhỏ, F11.1- F11.7. Phân đoạn F11.2 được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/acetone (8/2) thu được 8 mg chất G261-6 và 6 mg chất G261-7. Phân đoạn F13 được tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải MeOH thu được 6 phân đoạn, F13.1- F13.6. Tinh chế phân đoạn F13.3 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dichlomethan/methanol (98/2) thu được chất G261-9 (83 mg). Phân đoạn F17 được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient thu được 9 phân đoạn, F17.1- F17.9. Tinh chế phân đoạn F17.2 bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/acetone gradient thu được 5 mg chất G261-11. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F17.3 bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/aceton với tỉ lệ 2/1 thu được 18 mg chất G261-12 và 2,3 mg chất G261-13. Phân đoạn F17.5 được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH (97/3) thu được chất sạch G261-10 (10 mg). Hình 3. 9. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G261 57 3.7.3 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 3.7.3.1. Hợp chất G261-1: norharman Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 169 [M+H] + Công thức phân tử C11H8N2, M = 168 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7,29 (1H, dt, J= 1,0; 7,0 Hz, H-7); 7,53 (1H, dt, J= 1,0; 8,0 Hz, H-6); 7,56 (1H, dt, J= 1,0; 8,0 Hz, H-5); 7,96 (1H, d, J= 5,0 Hz, H-11); 8,14 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-8); 8,47 (1H, d, J= 5,0 Hz, H-1); 8,92 (1H, s, H-2) 3.7.3.2. Hợp chất G261-2: butane-2,3-diol Chất lỏng dạng dầu màu trắng. ESI-MS: m/z 91 [M+H] + Công thức phân tử C4H10O2, M = 90 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,18 (6H, d, J = 6,0 Hz, 2CH3), 3,53 (2H, q, J = 6,5 Hz, H-2 + H-3). 3.7.3.3. Hợp chất G261-3: pyrrole-2-carboxylic acid Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 112 [M+H] + Công thức phân tử C5H6NO2, M = 111 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD + CDCl3): δH (ppm) 6,25 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-4); 6,95 (2H, d, J = 4,5 Hz, H-3; H-5). 3.7.3.4. Hợp chất G261-4: 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid Chất rắn màu trắng. HR-ESI-MS: m/z 178,0152 [M-H]- tính toán lý thuyết cho công thức C8H4NO4 (m/z 178,0152 ). Công thức phân tử C8H5NO4, M = 111. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 7,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6); 7,23 (1H, dd, J = 8,0; 8,0 Hz, H-7); 7,49 (1H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz, H-5). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC (ppm) 116,7 (C-4); 118,1 (C-5); 123,6 (C-7); 126,4 (C-6); 144,2 (C-3a); 146,5 (C-7a); 149,2 (C=O); 163,4 (COOH). 3.7.3.5. Hợp chất G261-5: 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid Chất rắn màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 250-251oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 3,83 (3H, s, OCH3); 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 7,55 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-6); 7,58 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2). 58 3.7.3.6. Hợp chất G261-6: 2-acetamidobenzamide Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 179 [M+H]+. Công thức phân tử C9H10N2O2, M = 178. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 2,20 (3H, s, H-1); 7,09 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-7); 7,43 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-6); 8,07 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-5); 8,50 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8). 3.7.3.7. Hợp chất G261-7: phenyl alanine Chất rắn màu trắng. Điểm nóng chảy 145-146oC. ESI-MS: m/z 166 [M+H] + . Công thức phân tử C9H11NO2, M = 165. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.10. 3.7.3.8. Hợp chất G261-8: cyclo-(pro-gly) Chất rắn màu trắng Nhiệt độ nóng chảy 210-211oC Độ quay cực [α]D 25 -142,5 (c 0,40; MeOH) ESI-MS: m/z 155 [M+H] + Công thức phân tử C7H10N2O2, M = 154 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.11 3.7.3.9. Hợp chất G261-9: cyclo-(Pro-Ala) Chất rắn màu trắng. Điểm nóng chảy 140-141oC Độ quay cực [α]D 25 -78,2 (c 0,32; MeOH) 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.12. 3.7.3.10. Hợp chất G261-10: cyclo-(Leu-Pro) Chất rắn màu trắng. Điểm nóng chảy 147-148oC Độ quay cực [α]D 25 -85 (c 0,20; MeOH) ESI-MS: m/z 249 [M+K] + Công thức phân tử C11H18N2O2, M = 210 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.13. 3.7.3.11. Hợp chất G261-11: cyclo-(Pro-Tyr) Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 261 [M+H] + 59 Công thức phân tử C14H16N2O3, M = 260 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,90 (2H, m, Ha-4, Ha-5); 2,00 (1H, m, Hb-4); 2,31 (1H, m, Hb-5); 2,80 (1H, dd, J= 5,0; 14,5 Hz, Ha-10); 3,44 (1H, dd, J= 3,5; 14,5 Hz, Hb-10); 3,55 (1H, m, Ha-3); 3,64 (1H, m, Hb-3); 4,08 (1H, m, H-6); 4,22 (1H, m, H-9); 6,77 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-2′, H-6′); 7,04 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3′, H-5′). 3.7.3.12. Hợp chất G261-12: cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) Chất rắn màu trắng. HR-ESI-MS: m/z 261,1231 [M+H] + tính toán lý thuyết cho công thức C14H17N2O3 Công thức phân tử C14H16N2O3, M = 260 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): Xem bảng 4.14. 3.7.3.13. Hợp chất G261-13: cyclo-(Leu-Tyr) Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 277 [M+H] + Công thức phân tử C15H21N2O3, M = 276 1 H-NMR (500 MHz, DMSO) và 13 C-NMR (100 MHz, DMSO): Xem bảng 4.15. 3.8. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 3.8.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết Hình 3. 10. Sơ đồ tạo cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G248 Chủng vi sinh vật biển Streptomyces sp. G248 được nuôi cấy với lượng lớn 50 lít, sau 13 ngày nuôi cấy được ly tâm 12000 vòng trong 10 phút, thu dịch bỏ cặn tế bào. Sau đó chiết lần lượt với EtOAc và BuOH (5L x 5 lần), rồi tiến hành cô quay hút 60 chân không thu được hai cặn của EtOAc và BuOH có khối lượng lần lượt là 8,8 và 5,0 gam. 3.8.2. Phân lập các chất từ các cặn chiết Khảo sát cặn chiết ethyl acetate và butanol bằng sắc ký bản mỏng với nhiều hệ dung môi, so sánh thấy sự giống nhau giữa hai cặn chiết nên gộp hai cặn chiết lại được 13,8 gam cặn tổng. Từ 13,8 g cặn chiết G248 được tiến hành chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOH với độ phân cực tăng dần thu được 11 phân đoạn, F1 – F11. Sơ đồ phân lập các phân đoạn như hình 2.11 trên. Chúng tôi tiến hành phân tách phân đoạn F4 (1,23 gam) trên cột sắc ký sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là methanol thu được 4 phân đoạn, F4.1 – F4.4. Phân đoạn F4.3 (75 mg) được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOH gradient thu được 4 phân đoạn, F4.3.1 – F4.3.4. Phân đoạn F4.3.4 (12 mg) được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng TLC điều chế với hệ dung môi CH2Cl2/EtOH (8/2) thu được chất G248-1 (5 mg). Phân đoạn F5 (1,71 gam) được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, F5.1 – F5.5. Phân đoạn F5.3 (305 mg) được tinh chế bằng cột sắc ký sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol thu được chất sạch G248-2 (18 mg). Phân đoạn F6 (550 mg), chúng tôi thực hiện sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, F6.1 – F6.5. Tinh chế phân đoạn F6.4 (75 mg) bằng sắc ký sephadex LH-20 với dung môi rửa giải MeOH thu được 5 phân đoạn, F6.4.1 – F6.4.5. Phân đoạn F6.4.1 (15 mg) được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế thu được chất sạch G248-3 (9 mg) với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (85/15). Tương tự đối với phân đoạn F6.4.4 (12 mg) cũng dùng sắc ký bản mỏng đều chế được chất G248-4 (8 mg) với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH (8/2). Phân đoạn F7 (170 mg) được phân tách trên cột sắc ký cột sephadex LH- 20 với hệ dung môi rửa giải MeOH/CH2Cl2 (9/1) thu được 6 phân đoạn, F7.1 – F7.6. Phân đoạn F7.5 (27 mg) được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient thu được 5 phân đoạn, F7.5.1 – F7.7.5. Phân đoạn F7.5.3 (12 mg) được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế TLC thu được 5 mg chất G248-5 với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (8/2). Phân đoạn F9 (260 mg) được phân tách trên cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient thì thu được 9 phân đoạn, F9.1 – F9.9. Phân đoạn F9.5 (25 mg) được tách trên cột sắc ký silica gel thu 61 được 8 phân đoạn, F9.5.1 – F9.5.8. Tinh chế phân đoạn F9.5.7 (9 mg) bằng cột sephadex LH-20 với dung môi methanol thu được 9 mg chất G248-6. Hình 3. 11. Sơ đồ phân lập các chất từ chủng Streptomyces sp. G248 Phân đoạn F9.6 (48 mg) được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/CH3COCH3 gradient thì thu được 11 phân đoạn, F9.6.1 – F9.6.1. Đối với phân đoạn F9.6.9 (12 mg), chúng tôi tiến hành phân tách trên cột sắc ký sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol thu được 3 phân đoạn nhỏ, F9.6.9.1 –F9.6.9.3. Tinh chế phân đoạn F9.6.9.2 (8 mg) bằng sắc ký bản mỏng điều chế TLC với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (8/2) được 4 mg chất sạch G248-7. Phân đoạn F9.7 ( 18 mg) được đưa 62 lên cột sắc ký sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol, chúng tôi thu được 8 mg chất sạch G248-8. Phân đoạn F10 (1,62 gam) được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient ta thu được 5 phân đoạn, F10.1 – F10.5. Phân đoạn F10.2 (55 mg) được phân tách trên cột sắc ký sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH/CH2Cl2 (9/1) thu được 4 phân đoạn, F10.2.1 – F10.2.4. Tinh chế phân đoạn F10.2.1 (10 mg) bằng sắc ký bản mỏng điều chế TLC với hệ dung môi CH3COCH3/CH2Cl2 (25/75) thu được chất G248-9 (5 mg). Tương tự ở phân đoạn F10.2.2 (11 mg), chúng tôi sử dụng sắc ký bản mỏng điều chế TLC với hệ dung môi CH3COCH3/ CH2Cl2 (3/7) thu được chất sạch G248-10 (6 mg). Ở phân đoạn F10.4.2 (40 mg), chúng tôi tiến hành sắc ký cột sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH/CH2Cl2 (9/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ, F10.4.1 – F10.4.4. Tiến hành tinh chế phân đoạn F10.4.1 (12 mg) bằng sắc ký bản mỏng với hệ dung môi CH3COCH3/ CH2Cl2 (3/7) thu được chất G248-11(7 mg). Tương tự, chúng tôi cũng tiến hành tinh chế phân đoạn F10.4.2 (14 mg) bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi CH3COCH3/CH2Cl2 (3/7) thu được chất G248-12 (9 mg). Tiếp tục tinh chế phân đoạn F10.5 (70 mg) trên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là MeOH/CH2Cl2 (9/1) thu được 5 phân đoạn, F10.5.1 – F10.5.5. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F10.5.1 (14 mg) bằng sắc ký bản mỏng điều chế TLC bằng hệ dung môi CH3COCH3/CH2Cl2 (3/7) thu được chất G248-13 (7 mg). 3.8.3. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 3.8.3.1. Hợp chất G248-1: cyclo-(Pro – Leu) Chất rắn màu trắng. Điểm nóng chảy 147-148oC Độ quay cực [α]D 25 -85 (c 0,20; MeOH) ESI-MS: m/z 249 [M+K] + Công thức phân tử C11H18N2O2, M = 210 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 0,95 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-13); 1,00 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-12); 1,53 (1H, m; Ha-10); 1,77 (1H, m, H-11); 1,90 (1H, m, Ha-4); 2,05 (2H, m, Hb-4, Hb-10); 2,13 (1H, m, Ha-5); 2,34 (1H, m, Ha-5); 3,55 (1H, m, Ha- 3); ); 3,60 (1H, m, Hb-3); 4,02 (1H, m, H-9); 4,12 (1H, t, J= 8,0 Hz; H-6). 13 C-NMR 63 (125 MHz, CD3OD): δC (ppm) 21,2 (C-13); 22,7 (C-4); 23,3 (C-12); 24,7 (C-11); 28,1 (C-5); 38,7 (C-10); 45,5 (C-3); 53,4 (C-9); 59,0 (C-6); 166,2 (C-1); 170,2 (C-7). 3.8.3.2. Hợp chất G248-2: cyclo-(Pro-Phe) Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 245,13 [M+H] + Công thức phân tử C14H16N2O2, M = 244 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (100 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.16. 3.8.3.3. Hợp chất G248-3: norharman Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 169 [M+H] + Công thức phân tử C11H8N2, M = 168 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 7,29 (1H, dt, J=2,5; 8,0 Hz, H-6); 7,58 (1H, dt, J= 0,5; 8,0 Hz, H-7); 7,59 (1H, dt, J= 8,0 Hz, H-8); 8,11 (1H, d, J=5,0 Hz, H-4); 8,21 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-5); 8,31 (1H, d, J= 5,5 Hz, H-3); 8,81 (1H, s, H-1). 3.8.3.4. Hợp chất G248-4: cyclo (Pro-Tyr) Chất rắn màu trắng. ESI-MS: m/z 261 [M+H] + Công thức phân tử C14H16N2O3, M = 260 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 1,80 (2H, m, Ha-4, Ha-5); 2,16 (1H, m, Hb-4); 2,71 (1H, t, J=5,5 Hz, Hb-5); 3,80 (2H, d, J= 5,0 Hz, Ha-10, Hb-10); 3,55 (1H, m, Ha- 3); 3,63 (1H, t,J= 6,0 Hz, Hb-3); 4,05 (1H, m, H-6); 4,36 (1H, m, H-9); 4,87 (OH – phenol) , 6,73 (2H, d, J= 6,5 Hz, H-2′, H-6′); 7,06 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3′, H-5′). 3.8.3.5. Hợp chất G248-5: cyclo-(Pro-Gly) Chất rắn màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 210-2110C Độ quay cực [α]D 25 -142,5 (c 0,40; MeOH) ESI-MS: m/z 155 [M+H] + Công thức phân tử C7H10N2O2, M = 154 IR (KBr) νmax (cm -1 ) 3406; 2929; 1744; 1650; 1431; 1382; 707; 543 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 1,93 (1H, m); 2,05 (2H, m); 2,35 (1H, m); 3,53 (1H, m); 3,60 (1H, m); 4,13 (1H, dd, J= 1,5; 17,0 Hz); 4,25 (2H, br.dd, J= 2,0; 8,0 Hz). 64 3.8.3.6. Hợp chất G248-6: cyclo-(Pro-Trp) Chất rắn màu trắng. HR-ESI-MS: m/z 284,1409 [M+H] + tính toán lý thuyết cho công thức C16H18N3O2. Công thức phân tử C16H17N3O2, M = 283 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.17. 3.8.3.7. Hợp chất G248-7: adenine Chất rắn màu trắng. ESI-MS (m/z): 136 [M+H] + Công thức phân tử C5H5N5, M = 135 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 8,21 (1H, s, H-8), 8,13 (1H, s, H-3). 3.8.3.8. Hợp chất G248-8: 2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid Chất rắn màu trắng. Điểm nóng chảy 148-150oC. ESI-MS (m/z): 153 [M+H]+ Công thức phân tử C8H8O3, M = 152 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 3,33 (2H, s, CH2); 6,71 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2 và H-6); 7,14 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3 và H-5). 3.8.3.9. Hợp chất G248-9: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone Chất rắn vô định hình màu vàng nhạt. Độ quay cực [α]D 25 = -5 (c 0,176; MeOH) HR-ESI MS: m/z 453,2270 [M+H] + tính toán lý thuyết cho công thức C27H33O6 (m/z 453,2277). Công thức C27H32O6. IR có các píc tại 3433 cm-1, 1648 cm-1. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem bảng 4.18. 3.8.3.10. Hợp chất G248-10: (2S)-6-prenyl-4′-methoxy-5,7-dihydroxylflavanone Chất rắn vô định hình màu trắng. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem bảng 4.19. 3.8.3.11. Hợp chất G248-11: (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone Chất rắn vô định hình màu vàng. Độ quay cực [α]D 25 = +3 (c 0,2, MeOH) HR-ESI MS: m/z 425,1960 [M+H] + tính toán lý thuyết cho công thức C25H29O6 (m/z 425,1964). Công thức C25H28O6. M=424. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem bảng 4.20. 65 3.8.3.12. Hợp chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′- tetrahydroxylchalcone Chất rắn vô định hình màu vàng nhạt Độ quay cực [α]D 25 = -1,8 (c 0,54, CH2Cl2). HR-ESI MS: m/z 439,2117 [M+H] + tính toán lý thuyết cho công thức C26H31O6 (m/z 439,2121). Công thức C26H30O6 . 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem bảng 4.21. 3.8.3.13. Hợp chất G248-13: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone Chất rắn vô định hình màu trắng. Độ quay cực [α]25D = - 28 (c 0,8, MeOH). 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz): Xem bảng 4.22. 3.9. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc 3.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSVKĐ của một số hợp chất phân lập đƣợc Trong số 26 chất được phân lập, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng VSVKĐ. Kết quả có 13 chất có hoạt tính kháng VSV kiểm định, trong đó có nhiều chất có hoạt tính rất mạnh như G246-2, G248-11, G248-12, G248-9 và nhiều chất có hoạt tính kháng nấm tốt như G246-6, G261-11, G248-11 (xem chi tiết bảng 3.5). 3.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của một số hợp chất phân lập đƣợc Kết quả thử hoạt tính kháng lao được thực hiện tại trường Đại học UIC. Một số chất được thử nghiệm hoạt tính kháng lao với Mycobacterium tuberculosis H37Rv, trong đó G246-1 thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị MIC = 6,00 µg/ml, G248-10 thể hiện hoạt tính tốt với giá trị MIC = 11,17 µg/ml, còn G248-9 thể hiện hoạt tính yếu với giá trị MIC = 48,02 µg/ml Các chất còn lại không thể hiện hoạt tính tại nồng độ nghiên cứu (50 µg/ml) (xem chi tiết bảng 3.6). 3.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập đƣợc 14 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao từ 03 chủng nghiên cứu (G246, G261 và G248) được thử hoạt tính gây độc tế bào với bốn dòng tế bào ung thư ở người: KB - ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung thư vú (HTB – 22TM) và LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM) . Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.5. Kết quả có 5 hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, trong đó có 4 chất có hoạt tính với dòng tế bào KB, 5 hợp chất có hoạt tính với 66 dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, 4 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào Lu-1, 4 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào MCF7 (xem chi tiết bảng 3.7). Bảng 3. 5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập được đối với VSVKĐ TT Ký hiệu Gram dương Gram âm Nấm E.faecalis ATCC29212 S.aureus ATCC25923 B.cereus ATCC13245 E.coli ATCC25922 P.aeruginosa ATCC27853 S.enterica ATCC13076 C.albicans ATCC10231 Đơn vị MIC (µg/ml) Các hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G246 1 G246-1 32 32 16 128 32 32 32 2 G246-2 8 1 4 - 16 32 8 3 G246-3 - - - - - - - 4 G246-4 - 8 64 8 64 64 8 5 G246-6 256 - - - - - 2 6 G246-7 - - - 128 - - - 7 G246-8 - - - - - - - 8 G246-9 - - - - - - - 9 G246-10 - - - - - - - Các hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 10 G261-1 - - 32 - - - - 11 G261-2 - - - - - - - 12 G261-3 - - - - - - - 13 G261-4 128 256 - - - - - 14 G261-5 - - - 64 - - - 15 G261-6 - - - - - - - 16 G261-12 - 256 - - - - - 17 G261-13 - - - 32 - - - Các hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 18 G248-1 - - - - - - - 19 G248-2 - 32 64 32 16 64 64 20 G248-6 - - - - - - - 21 G248-7 32 - - 128 - - 64 22 G248-8 - - - - - - - 23 G248-9 8 8 8 - 8 8 16 24 G248-10 - - - - - - - 25 G248-11 1 1 1 - 1 8 1 26 G248-12 8 8 8 4 8 8 16 KS Strep 256 256 128 32 256 128 - Cyc - - - - - - 32 Strep: Streptomycin Cyc: Cycloheximide 67 Bảng 3. 6. Kết quả thử hoạt tính kháng lao một số chất phân lập được TT Chất MIC(µg/ml) TT Chất MIC(µg/ml) 1 G246-1 6,00 7 G248-8 >50 2 G246-7 > 50 8 G248-9 48,02 3 G248-3 >50 9 G248-10 11,17 4 G248-1 >50 10 G248-11 >50 5 G248-6 >50 11 G248-12 >50 6 G248-7 >50 Rifampicin 2 Bảng 3. 7. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 14 hợp chất tách chiết từ các chủng nghiên cứu G246, G261 và G248 đối với 4 dòng tế bào thử nghiệm TT Tên mẫu Giá trị IC50 (µM) KB Hep-G2 Lu-1 MCF7 1 G246-1 11,05 5,18 9,13 33,31 2 G246-2 15,21 6,51 13,70 25,57 3 G261-4 71,81 73,85 52,08 82,04 4 G261-9 > 100 > 100 > 100 > 100 5 G248-1 > 100 > 100 > 100 > 100 6 G248-2 > 100 > 100 > 100 > 100 7 G248-3 > 100 > 100 > 100 > 100 8 G248-4 > 100 > 100 > 100 > 100 9 G248-5 > 100 > 100 > 100 > 100 10 G248-6 > 100 > 100 > 100 > 100 11 G248-9 > 100 70,80 > 100 > 100 12 G248-10 5,65 5,65 13,73 33,53 13 G248-11 > 100 > 100 > 100 > 100 14 G248-12 > 100 > 100 > 100 > 100 Ellipticine 1,20 1,60 1,20 2,40 68 CHƢƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Kết quả thu mẫu Tổng số 25 mẫu bao gồm có: 12 mẫu ở vùng biển Thanh Hóa, Quảng Bình và Quảng Trị; 13 mẫu ở vùng biển Đ