Luận án Nghiên cứu phân lập và thử nghệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

ịnh danh bằng nghiên cứu hình thái bào tử nấm và PCR giải trình tự vùng ITS là Fusarium solani, Fusarium sp., Trichoderma atroviride và Fusarium oxysporum (được ký hiệu lần lươt là Ng1, Ng2, C2 và B1). Kết quả phân loại và định danh chủng nấm nội sinh được phối hợp thực hiện cùng nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Dương Văn Hợp tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (IMBT), Đại học Quốc gia Hà Nội. 3.1.1.1. Chủng nấm Fusarium solani Nguồn gốc phân lập: củ nghệ Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm khí sinh phát triển và có màu trắng. Có sinh bào tử. Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thước đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên môi trường PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt trái không màu. Hình 3.1. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 2 loại bào tử trần: Bào tử lớn hình quả chuối, hình chiếc thuyền, kích thước 20-25 x 4,5-7 µm. Bào tử nhỏ hình hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thước 3-5 x 7-10 µm. Ngoài ra còn có bào tử nghỉ dạng chlamydospore. 46 3.1.1.2. Chủng nấm Fusarium sp. Nguồn gốc phân lập: củ nghệ Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm kị khí phát triển mạnh màu trắng sữa. Sinh bào tử màu vàng Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thước đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên môi trường PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt trái không màu. Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 1 loại bào tử trần: Bào tử nhỏ ít, hình hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thước 3,5-4,5 x 8-15 µm. Có bào tử nghỉ dạng chlamydospore. Hình 3.2. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium sp. 3.1.1.3. Chủng nấm Trichoderma atroviride Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ. Đặng điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, có màu trắng. Bào tử có màu vàng, khi già chuyển sang màu xanh. Khuẩn lạc: Trên môi trường MEA khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 7 ngày nuôi cấy đạt kích thước 3-4 cm. Khi còn non khuẩn lạc có dạng sợi bông màu trắng, sau khoảng 4 ngày bề mặt khuẩn lạc xuất hiện các đám bao tử màu xanh lục, dạng bột trên bề mặt. Cơ quan sinh sản: Sợi nấm dinh dưỡng có vách ngăn, nhẵn, phân nhánh. Cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều lần, không màu, nhẵn. Nhánh mọc càng dài khi càng xa đỉnh, nhánh mọc thẳng đứng với nhánh chính. Thể 47 bình (tế bào sinh bào tử) dạng phialo, mọc thành vòng quanh cuống chính, 2-4 thể bình, thể bình ở đỉnh dài hơn ở vị trí khác, kích thước (5-7,2) × (2-3,8) µm. Bào tử hình trứng ngắn, vách nhẵn, kích thước (3-4,7) × (2,5-3,6) µm. Hình 3.3. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Trichoderma atroviride Kết quả PCR trình tự vùng ITS của chủng Trichoderma atroviride như sau: Bảng 3.1. Trình tự vùng ITS của chủng Trichoderma atroviride CCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCAC GCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGG ACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTT ACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAAC GGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA TAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGC GTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGAC CTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGC GGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCAC CGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAA ATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT ATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCCAGTA ACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCCT 48 AGGGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTTGGTGAGGTGCCG CCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCGCAGAGGGTGAGAGCCCCGT CTGGCTGGCCACCGAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGT AGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGG Kết quả blast trình tự vùng ITS thu được với ngân hàng dữ liệu cho thấy trình tự vùng ITS của chủng nghiên cứu tương đồng 100% với trình tự vùng ITS của Trichoderma atroviride AF055212. Vị trí phân loại của chủng Trichoderma atroviride được thể hiện tại hình 3.4. Hình 3.4. Cây phân loại của chủng Trichoderma atroviride (C2: chủng nấm nội sinh củ Nghệ vàng được nghiên cứu) Nectria cinnabarina HM534894 C2 T.atroviride AF055212 T.asperellum AJ230669 100 T. brevicompactum DQ000635 H. citrina AF400254 H. schweinitzii X93957 T. citrinoviride Z82905100 T. atrobrunneum AF275330 T. guizhouense DQ018116 T. harzianum AF057600 99 T. cinnamomeum AY737759 68 T. ceramicum AY737764 T. chlorosporum AY73776283 Trichoderma sp. DQ023302 T. chromospermum AY737774 H. avellanea DQ020000 50 H. aureoviridis Z48819 T. pseudocandidum AY737757 72 68 100 82 0.05 49 3.1.1.4. Chủng nấm Fusarium oxysporum Nguồn gốc phân lập: củ cây nghệ. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ tâm ra xung quanh. Sợi khí sinh phát triển tốt. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu tím đỏ. Khuẩn lạc: Trên môi trường MEA khuẩn lạc có màu trắng hơi ngả hồng, dạng sợi bông xốp. Mặt sau khuẩn lạc có màu hồng nhạt. Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, bào tử trần hình bầu dục, hình quả chuối..., kích thước 2,5 – 4,5 × 6 – 9 (15– 20) µm. Hình 3.5. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Fusarium oxysporum Kết quả PCR trình tự vùng ITS của chủng Fusarium oxysporum như tại bảng 3.2. Bảng 3.2. Trình tự vùng ITS của chủng Fusarium oxysporum CCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGC CCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAA ACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAA TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA AGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT 50 CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGT ATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAA GCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAA ATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAA ACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCC AACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGG GATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAAT TTGAAATCTGGCTCTCGGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAT ACTTTTGATGCGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCC ATAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTTGGATGCCAAATCTCTGT AAAGTTCCTTCAACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTA AATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGA CCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACT TTGAAAAGAGAGTTAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGA AGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTT CTCCCCAGTGCACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCC CGGGGGATAAAGGCGGCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGT GTTATAGCCCACCGTGTAATACCCTGGGGGGG Kết quả blast trình tự vùng ITS thu được với ngân hàng dữ liệu cho thấy trình tự vùng ITS của chủng nghiên cứu tương đồng 100% so với trình tự rRNA vùng ITS của Fusarium oxysporum KR094464. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum được thể hiện tại hình 3.6. 51 Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum (B1: chủng nấm nội sinh củ Nghệ vàng được nghiên cứu) Chủng nấm Fusarium oxysporum được sử dụng để nuôi cấy lượng lớn và tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau. 3.1.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana) Ba (03) chủng nấm nội sinh, được phân lập từ lá ngâu ta (Aglaia duppereana), đã được xác định tên là Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum crassipes vàMicrodiplodia hawaiiensis. Một chủng nấm nội sinh, được phân lập từ cành ngâu ta (Aglaia duppereana), cũng đã được xác định tên là Colletotrichum gloeosporioides, trùng với một chủng nấm được phân lập từ lá ngâu. Kết quả định danh các chủng nấm nội sinh được xác định bằng phương pháp nghiên cứu hình thái bào tử nấm và chạy PCR giải trình tự gene vùng ITS, sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4. Thí nghiệm được phối hợp thực hiện cùng nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Dương Văn Hợp tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (IMBT), Đại học Quốc gia Hà Nội Nectria cinnabarina HM534894 B1 Fusarium oxysporum KR094464 Fusarium verticillioides FJ867932 Gibberella circinata FJ744110 Gibberella moniliformis GQ168842 Gibberella moniliformis GQ16884 Fusarium verticillioides AB587012 100 Fusarium sacchari EF453121 90 Fusarium subglutinans JX960431 63 99 90 100 66 0.02 52 3.1.2.1. Chủng nấm Colletotrichum gloeosporioides Nguồn gốc phân lập: lá cây ngâu Trên môi trường nuôi cấy, sợi nấm phát triển mỏng mảnh, trên bề mặt khuẩc lạc xuất hiện những đĩa bào tử bọc, có nhiều sợi cứng, lúc còn non có màu hồng, già chuyển sang màu đen, bào tử phát tán ra khỏi đĩa, hình trụ, 1 tế bào, kích thước 2,3- 3,5 x 4-5 µm. Hình 3.7. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. gloeosporioides 3.1.2.2. Chủng nấm Colletotrichum crassipes Nguồn gốc phân lập: lá cây ngâu Trên môi trường nuôi cấy, sợi nấm phát triển mỏng mảnh. Khuẩn lạc màu trắng, khi về già (sau 3-4 tuần nuôi cấy) trên bề mặt khuẩc lạc xuất hiện những đĩa bào tử bọc, màu đen, bào tử phát tán ra khỏi đĩa, hình trụ, 1-2 tế bào, kích thước 4-5 x 5-8 µm. Hình 3.8. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. crassipes 3.1.2.3. Chủng nấm Microdiplodia hawaiiensis Nguồn gốc phân lập: lá cây ngâu 53 Hình 3.9. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng M. hawaiiensis Kết quả PCR trình tự vùng ITS của chủng Microdiplodia hawaiiensis như tại bảng 3.3. Bảng 3.3. Trình tự vùng ITS của chủng M. hawaiiensis TTCGGACTGGCTCGAGGAGGTTGGCAACGACCACCTCAA GCCGGAAAGTTGTACAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAA GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT ATCTATTTTAACGGTGTTGGTTGCGGCCTCCGGGGGTAACTCC CCCGGGTGGTAGAGGTAACACTCGCACGCTCCACATGCCTTAA TCCTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGTGGGGCAAC CTGCCGTTGGAACCCATCAAAAACCCTTTTTTGCATCTAGCATT ACCTGTTCCGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGA TCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT AAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG AACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTT CGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGT CTGTCCCGCCTCTGCGCGCGGACTCGCCCCAAATTCATTGGCA GCGGTCCTTGCCCCTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCTCGAGG GGCGCGGCCCGCGTCCACGAAGCAAACATTACCGTCTTTGACC TCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGC GAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTCTTT 54 GGGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGCATTGGC GGCGGTCTAAGTTCCTTGGAACAGGACATCGCAGAGGGTGAG AATCCCGTACGTGGGCGCCTGCCTTTGCCGTGTAAAGCTCCTT CGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGAGGT AAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGC Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis được thể hiện tại hình 3.10. Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis (Ngâu: chủng nấm nội sinh lá Ngâu được nghiên cứu) Chủng nấmMicrodiplodia hawaiiensis được sử dụng để nuôi cấy lượng lớn và tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau. Ngâu 55 3.1.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L) Hai (02) chủng nấm nội sinh đã được phân lập từ lá cây trầu không. Kết quả phân loại bằng nghiên cứu hình thái bào tử nấm đã xác định hai chủng nấm nội sinh là Colletotrichum sp. và Fusarium solani. Công việc định danh chủng nấm nội sinh được phối hợp thực hiện cùng nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Dương Văn Hợp tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (IMBT), Đại học Quốc gia Hà Nội. 3.1.3.1. Chủng nấm Colletotrichum sp. Nguồn gốc phân lập: lá cây trầu không Trên môi trường nuôi cấy, sợi nấm phát triển mỏng mảnh, thưa thớt, trên bề mặt khuẩc lạc xuất hiện những đĩa bào tử trần, ở giữa màu đen, không mang bào tử. Đĩa phần mép ngoài khuẩn lạc có màu hồng, có mang bào tử hình trụ, hình thuốc con nhộng, 1- 2 tế bào, kích thước 4-5 x 12-15µm. Không có bào tử nghỉ dạng chlamydospore. Hình 3.11. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Colletotrichum sp. 3.1.3.2. Chủng nấm Fusarium solani Nguồn gốc phân lập: lá cây trầu không Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm khí sinh phát triển và có màu trắng. Có sinh bào tử. Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thước đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên môi trường PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt trái không màu. 56 Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 2 loại bào tử trần: Bào tử lớn hình quả chuối, hình chiếc thuyền, kích thước 20-25 x 4,5-7 µm. Bào tử nhỏ hình hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thước 3-5 x 7-10 µm. Ngoài ra còn có bào tử nghỉ dạng chlamydospore. Hình 3.12. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani Chủng nấm Fusarium solani được sử dụng để sinh khối lượng lớn và tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau. 3.2. Thực nghiệm phân lập các thành phần hóa học từ thực vật và nấm nội sinh thực vật 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana) 3.2.1.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu vỏ cây Ngâu ta khô (3kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 115g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan (25g), etyl axetat (20g) và metanol (65g) tương ứng. 3.2.1.2. Phân lập các hợp chất từ cặn etyl axetat vỏ cây Ngâu ta Cặn etyl axetat (AD.E, 20g) được phân tách bằng sắc ký cột VLC với hệ dung môi rửa giải gradien n-hexan:EtOAc:MeOH (hệ dung môi 4:2:1 đến 0:1:1) thu được 8 phân đoạn ký hiệu từ ADE1 đến ADE8. 57 Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta Tiến hành chạy cột sắc ký cột phân đoạn ADE3 (5,4 g) trên silica gel (40-63µm) với hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH (từ 100:0 đến 0:100) thu được 9 phân đoạn, ký hiệu là ADE3.1-ADE3.9. Phân đoạn từ ADE3.1 (1,29 g) tiến hành chạy cột CC với dung môi CH2Cl2:isopropanol thu được 9 phân đoạn (ADE3.1.1 đến ADE3.1.9). Gom các phân đoạn ADE3.1.4-ADE3.1.7 (412mg) tiến hành chạy cột sephadex với dung môi methanol, thu được 36 phân đoạn nhỏ. Sử dụng TLC và HPLC gom các ống 1-36 thu được 6 chất sạch thu được dưới dạng bột màu trắng vô định hình. Quy trình phân tách các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana Pierre) được miêu tả trên sơ đồ 3.2.1.  Hợp chất 1: Hợp chất 1 (3,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-90.5 (c, 0.25, CHCl3). ADE1-2 LC, Silicagel, gradient CH2Cl2-MeOH (100:0 đến 0:100) AD.E (20g) ADE3 3,99g ADE4-8 ADE3.1 1,29g (1) 3.9mg (2) 3.8mg (3) 2.1mg (4) 7.2mg (5) 1.9mg (6) 10mg ADE3.1.4 - 3.1.7 412mg n-hexan-EtOAc-MeOH (4:2:1 đến 0:1:1) HPLC, MeOH-H2O 3:7 58 UV (MeOH) λmax 219.7 và 273.0 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 561,1 (M+H)+, 528,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 4,95 (d, J = 6.9 Hz, H-1), 4,11 (dd, J = 6.9 Hz, 13,8 Hz , H-2), 4,36 (d, J =13,8 Hz, H-3), 6,30 (d, J =1,9Hz, H-5), 6,17 (d, J =1,9 Hz, H-7), 7,12 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,64 (d, J=8,8 Hz, H-3’), 6,64 (d, J =8,8 Hz, H-5’), 7,12 (d, J = 8,8 Hz, H-6’), 6,86 (m, H-2”), 6,98 (m, H- 3”), 6,98 (m, H-4”), 6,98 (m, H-5”), 6,86 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,84 (s, OMe-8), 3,66 (s, OMe-4’), 3,34 (s) & 2,86 (s) NMe. Cấu trúc hợp chất 1  Hợp chất 2: Hợp chất 2 (3,8 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-80 (c, 0.45, CHCl3). Dữ kiện phổ hợp chất 2. UV (MeOH) λmax 209 và 279 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 564,1 (M+H)+, 586,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 6,03 (d, J = 5,0 Hz, H1), 4,29 (dd, J = 5,0 Hz, 14,5 Hz , H2), 4,29 (d, J =14,5 Hz, H3), 6,26 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,11(d, J =1,9 Hz, H7), 6,78 (d, J=1,9 Hz, H-2’), 6,62 (d, J =8,2 Hz, H-5’), 6,70 (d, J = 6,9 Hz, H-6’), 7,02 (m, H-2”), 6,98 (m, H-3”), 6,98 (m, H-4”), 6,98 (m, H- 5”), 7,02 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,73 (s, OMe-8), 3,71 (s, OMe-4’), 3,37 (s) & 2,79 (s) NMe, 1,81 (s, OCOCH3) O OH CON(CH3)2 OCH3 H3CO OCH3 OH 1 2 35 7 2´ 6´ 4´ 2´´ 5´´ A B C 59 Cấu trúc hóa học của hợp chất 2  Hợp chất 3: Hợp chất 3 (2,1 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-55,0 (c, 0.45, CHCl3). Dữ kiện phổ hợp chất 3. UV (MeOH) λmax 210 và 272,5 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 534,1 (M+H)+, 556,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,99 (d, J = 6,3 Hz, H1), 3,94 (dd, J = 5,9 Hz, 14,5 Hz , H2), 4,19 (d, J =14,5 Hz, H3), 6,26 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,12 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,17 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,61 (d, J =8,8 Hz, H-3’), 6,61 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 7,17 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,91 (m, H-2’), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H-5”), 6,91 (m, H-6”), 3,74 (s, OMe-6), 3,81 (s, OMe-8), 3,65 (s, OMe-4’), 2,57 (s, NMe), 1,84 (s, OCOCH3) . Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 O OCOCH3 CON(CH3)2 OCH3 H3CO OCH3 OH HO 6 8 1 2 3 2´ 4´ 6´ 2´´ 5´´ 5 7 60  Hợp chất 4 Hợp chất 4 (7,2 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (A. dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-110,0 (c, 0.45, CHCl3). Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 Phổ UV (MeOH) λmax 210,4 và 272,6 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 548,2 (M+H)+, 570,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,95 (m, H1), 4,21 (m, H2), 4,21 (m, H3), 6,18 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,03 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,08 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,54 (d, J =8,8 Hz, H-3’), 6,54 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 7,08 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,80 (m, H-2”), 6,92 (m, H-3”), 6,92 (m, H-4”), 6,92 (m, H-5”), 6,80 (m, H- 6”), 3,64 (s, OMe-6), 3,72 (s, OMe-8), 3,56 (s, OMe-4’), 3,27 (s) & 2,69 (s) NMe, 1,71 (s, OCOCH3) .  Hợp chất 5: Hợp chất 5 (1,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-41,1 (c, 0.22, CHCl3). Phổ UV (MeOH) λmax 211,3 và 278,7 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 509,0 (M+H)+, 531,2 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,00 (d, J =5,7 Hz, H1), 3,96 (dd, J =5,7 Hz & 13,9 Hz, H2), 4,21 (d, J = 13,9, H3), 6,27 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,15 (d, J =1,9 Hz, H7), 6,70 (d, J=1,9 Hz, H-2’), 6,64 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 6,64 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,91 (m, H-2”), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H- 61 5”), 6,91 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,82 (s, OMe-8), 3,67 (s, OMe-4’), 3,61 (s, OCOCH3) . Cấu trúc hóa hoc của hợp chất 5  Hợp chất 6 Hợp chất 6 (10 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-125 (c, 0.48, CHCl3). UV (MeOH) λmax 212,8 và 272,3 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 457,10 (M+H)+, 890,9 (2M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 4,69 (d, J =5,5 Hz, H1), 2,80 (ddd, J =6,3 Hz & 13,5 Hz, 14, 0 Hz, H-2α), 2,06 (ddd, J =1,1 Hz & 6,2 Hz, 11,8 Hz, H-2β) 3,89 (dd, J = 13,5 & 14,0 Hz, H3), 6,28 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,17 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,10 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,61 (d, J = 8,8 Hz, H-3’), 6,61 (d, J=8,8 Hz, H-5’), 7,10 (d, J = 8,8 Hz, H-6’), 7,00 (m, H-2”), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H-5”), 7,00 (m, H-6”), 3,87 (s, OMe-6), 3,85 (s, OMe-8), 3,81 (s, OMe-4’). Cấu trúc hóa hoc của hợp chất 6 62 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) 3.2.2.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu lá cây Aglaia oligophylla (3kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 100g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n- hexan, diclometan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n- hexan (20g), diclometan (3.6g), etyl axetat (18g) và metanol (55g) tương ứng. 3.2.2.2. Phân lập các hợp chất từ cặn diclometan lá cây Gội ổi Cặn chiết diclomethan của lá gội ổi (AO.D, 3.6 g) được tiến hành tách với cột VLC silicagel 60 thu được 7 phân đoạn (AOD1 đến AOD7). Phân đoạn OAD3 được tiếp tục chạy CC sử dụng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được 3 phân đoạn (OAD3.1 đến OAD3.3). Hợp chất 7 thu được bằng chạy HPLC điều chế phân đoạn OAD3.2, detector λ=210 nm với hệ dung môi MeOH:H2O (3:7). Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi LC, Silicagel, gradient CH2Cl2-MeOH (100:0 đến 0:100) AO.D (3.6g) AOD3 0.6g AOD3.2 15mg CH2Cl2-MeOH (20:1 đến 2:1) HPLC, MeOH-H2O (3:7) (7) 3.3mg 63  Hợp chất 7 (chất mới) Hợp chất 7 (3,3 mg) được phân lập từ lá cây gội ổi (Aglaia oligophylla Muq.) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-50,5 (c, 0.45, CHCl3). UV (MeOH) λmax 210,4 và 271,1 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 528,1650 (M+Na)+ tương ứng với C28H27NO8Na. Dữ liệu phổ của hợp chất 7 xem bảng 4.3.1.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất 7 3.2.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa) 3.2.3.1. Xử lý mẫu thực vật Củ nghệ vàng sau khi sấy khô được nghiền mịn, chiết với dung môi ethyl acetate, loại dung môi sau đó cất lôi cuốn hơi nước thu được tinh dầu. 3.2.3.2. Phân lập các hợp chất Tinh dầu nghệ (TDN, 30.8g) được phân tách trên sắc ký cột silica gel với hệ dung môi gradient n-hexan-ethyl acetate thu được 12 phân đoạn. Phân đoạn 3 được tinh chế lại bằng sephadex LH20 với dung môi rửa giải MeOH thu được hợp chất 8 (2.8mg). 64 Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng Phần cặn nghệ sau khi chưng cất lôi cuốn hơi nước lấy tinh dầu được tiến hành chiết 3 lần với dung môi ethyl acetat hoặc cồn thực phẩm 960. Dịch chiết được cô chân không cho đến khi chỉ còn là dịch đặc thì được để ở nhiệt độ phòng để kết tủa curcuminoid. Sau 24 giờ tiến hành lọc được curcuminoit bán tinh. Curcuminoid thô được loại sáp bằng cồn lạnh sau đó tiến hành tinh chế trong cồn (hòa tan curcumin bán tinh có khuấy trong cồn thực phẩm 960 ở nhiệt độ sôi), để nguội tới nhiệt độ phòng qua đêm để kết tinh curcuminoid. Hỗn hợp Curcuminoid kết tinh được lọc chân không thu được sản phẩm curcuminoit tinh. Curcumin tinh (chất 9, 12.3mg) được tinh chế bằng phương pháp sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan:metanol (98 : 2).  Hợp chất 8: Hợp chất 8 thu đươc dưới dang dầu, không màu, UV 234-235nm. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), δH ppm 1,23 (d, 3H, J = 7 Hz, 15-CH3); 1,84 (brs, 3H, 12-CH3); 2,1 (s, 3H, 13-CH3); 2,3 (s, 3H, 4-CH3); 2,61 (m, 1H, H-); 2,69 (m, 1H, H-8); 3,28 (m, 1H, H-7); 6,02 (s, 1H, =CH-C=0, H-10); 7,1 (m, 4H, H-2,3,5,6). TDN 30.8g Chiết bằng EtOH Bột Nghệ vàng Bã Cất lôi quấn hơi nước Cặn EtOH (9) 12.3mg(8)2.8mg TDN1.3 1,79g PTLC 65 13C-NMR: (CDCl3, 125MHz) δC ppm 20,6 (C-12); 20,9 (C-15); 21,9 (C-14); 27,6 (C-13); 35,2 (C-7); 52,68 (C-8); 124,0 (C-10); 126,6 (C-2,C-6); 129,09 (C-3, C-5); 135,5 (C-4); 143,6 (C-1); 155,0 (C-11); 199,8 (C-9). Cấu trúc hóa học của ợp chất 8  Hợp chất 9: Curcumin tinh chất (hợp chất 9) được tinh chế bằng phương pháp sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan : metanol (98 : 2). Dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy đây là hỗn hợp 50:50 của hai cấu dạng enol và xeton của curcumin. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 (hai cấu dạng của curcumin) 3.2.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.) 3.2.4.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu lá Trầu không khô (5kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 240g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan (55g), etyl axetat (50g) và metanol (130g) tương ứng. H O O O OH O H O E n o l H O O O O O H O K et o 66 3.2.4.2. Phân lập các hợp chất từ cặn n-hexan lá Trầu không Cặn chiết n-hexan (TKH, 50g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel (63-100µm) với hệ dung môi rửa giải gradien n-hexan-etyl axetat (từ 100:0 đến 1:1) thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ TKH1 đến TKH10. Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không Tiến hành chạy cột sắc ký cột phân đoạn TKH4 (1.2g) trên silica gel (40-63µm) với hệ dung môi gradien n-hexan-etyl axetat (từ 100:0 đến 80:20) thu được 4 phân đoạn, ký hiệu là TKH4.1-TKH4.4. Phân đoạn TKH4.4 (15 mg) được tinh chế bằng bản mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 95:5 thu được chất sạch 10 (10mg). Phân đoạn TKH6 (3.99g) được tinh chế tiếp trên cột silica gel với hệ dung môi gradien n-hexan-etyl axetat (từ 95:5 đến 75:25) thu được 4 nhóm phân đoạn, ký hiệu là TKH6.1-TKH6.4. Phân đoạn TKH6.4 (0,797 g) được phân tách lặp lại trên cột CC thu được chất sạch 11 (150 mg). 15mg của phân đoạn TKH7 được tinh chế bằng phương pháp điều chế bản mỏng với hệ dung môi là n-hexan-etyl axetat (4:1) thu được chất sạch 12 (11,2 mg). Quy trình tách chiết các hợp chất từ cây Trầu không được mô tải tại sơ đồ 3.2.4. LC, Silicagel, gradient n-hexan-etyl axetat (0 đến 50% etyl axetat) TKH (50g) TKH6 3,99g TKH7 15mg (12) 11.2mg (11) 150mg (10) 10mg TKH4.4 15mg TKH4 1.2 g TKH4.2 TKH4.3TKH4.1 TKH6.4 0.797g TKH6.2 TKH6.3TKH6.1 67  Hợp chất 10: Hợp chất 10 thu được dưới dạng lỏng, màu vàng nhạt. 1H-NMR (CDCl3) δH ppm 3,28 (d, J= 6,5 Hz; 2H, H-7), 3,83 (s, 3H, H-2-OCH3), 5,03 (m, 2H, H-9), 5,93 (m, 1H, H-8), 6,65 (dd, J= 2; 8,5 Hz, 1H, H-3), 6,75 (brs, 1H, H-5), 6,77 (d, J= 2 Hz, 1H, H-6). Cấu trúc hợp chất 10  Hợp chất 11: H