Luận án Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu

m vào chuẩn 4 FQL 100 µg/mL, tương ứng với các thể tích chính xác. Cuối cùng thêm MeOH vừa đủ 1000 µL, tiêm vào hệ thống HPLC. Xây dựng đường thêm chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được vào nồng độ thêm hỗn hợp chuẩn. Phương trình y = ax + b, nồng độ thu hồi (tìm lại) Cx = b/a, hiệu suất thu hồi là tỷ số phần trăm giữa nồng độ thu hồi và nồng độ chuẩn thêm vào. Dựa vào kết quả hiệu suất thu hồi, lựa chọn quy trình xử lý mẫu tối ưu cho phương pháp định lượng FQL trong huyết tương. Hiệu suất thu hồi được chấp nhận theo hướng dẫn AOAC. Đối với mẫu nước tiểu Mẫu phân tích được tạo bằng cách đã trình bày trong Mục 2.3.1. Dựa trên đặc tính hóa lý và sự kế thừa một số công trình nghiên cứu đã công bố. Hai kỹ thuật chiết lỏng – lỏng và chiết lỏng – rắn (chiết pha rắn) được sử dụng để khảo sát phương pháp xử lý làm giàu và làm sạch mẫu trước khi định lượng các FQL bằng hệ thống HPLC. Quy trình được tiến hành như sau: Xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng: Một quy trình xử lý mẫu được dự kiến như sau: hút chính xác 500µl mẫu thử tự tạo có nồng độ các FQL bằng 10,0 µg/ml. Thêm vào 4,0 ml dung môi chiết mẫu, lắc xoáy 2000 vòng/phút, trong 5 phút, ly tâm 15 phút. Hút chính xác 3,0 ml dịch nổi, làm bay hơi dung môi ở 40oC bằng tủ sấy hút chân không, sau đó hòa tan bằng rung siêu âm cặn thu được với 2,0 ml dung môi MeOH/HCl 0,1M (1:1). Lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào cột HPLC. Dựa vào diện tích píc thu được trong từng yếu tố khảo sát, lựa chọn điều kiện tối ưu cho quy trình xử lý mẫu, khảo sát bằng phương pháp đơn biến. Khảo sát dung môi chiết mẫu: Các dung môi được sử dụng để khảo sát đó là cloroform, diclometan, etyl acetat và diclometan/MeOH với tỷ lệ trộn mẫu (9:1), (8:2), (7:3). Khảo sát thể tích dung môi chiết: Hút chính xác 500µl mẫu nước tiểu tự tạo chứa FQL có nồng độ bằng 10,0 µg/ml, các mẫu được chiết bằng 3,0; 4,0; 5,0 và 6,0 ml dung môi đã khảo sát, tiếp tục thực hiện các bước theo quy trình. Khảo sát thời gian lắc chiết: Mẫu tiến hành theo quy trình với các điều kiện đã khảo sát, trong đó thời gian lắc chiết 2000 vòng/phút của các mẫu được thay đổi tương ứng với 2, 3, 4 và 5 phút. Hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết: Đánh giá hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu sau khi đã được tối ưu hóa bằng phương pháp thêm chuẩn trên mẫu thử tự tạo với nồng độ có nồng độ là 10,0 µg/ml (Ct). Thể tích thêm chuẩn lần lượt là 0; 10,0; 20,0; 40,0 µl dung dịch 4 FQL có nồng độ 100,0 µg/ml lần lượt tạo ra các nồng độ trong mẫu thử tương ứng là Ct , C1 , C2, C3. Đo diện tích píc thu được thiết lập đường thêm chuẩn y = ax + b, Cx = b/a, hiệu suất thu hồi được tính bằng tỷ số phần trăm giữa nồng độ thu hồi (tìm lại) và nồng độ tính toán. Đánh giá hiệu suất thu hồi chấp nhận được dựa theo tiêu chuẩn của AOAC. Xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn: Tiến hành khảo sát để tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu dựa trên một quy trình được dự kiến với các bước như sau: hoạt hóa cột bằng 3,0 ml metanol, tiếp theo 3,0 ml nước và cân bằng pH của cột bằng 5,0 ml dung dịch đệm phosphat 20 mM, pH = 3 với tốc độ dòng 3 ml/phút. Sau đó đưa 1,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn FQL 5,0 µg/ml lên cột với tốc độ dòng 1ml/phút. Làm khô cột, rửa giải bằng 10,0 ml dung môi với tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Làm bay hơi dung môi toàn bộ dung dịch thu được bằng tủ sấy hút chân không đến cặn trong lọ thủy tinh 5 mL. Hòa tan cặn thu được trong hỗn hợp dung môi MeOH/HCl 0,1M (1:1), lọc qua màng 0,45µm, tiêm 10 µl vào hệ thống HPLC với điều kiện sắc ký đã xây dựng. Mỗi một điều kiện khảo sát được đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi, tính toán bằng phương pháp thêm 3 điểm chuẩn xác định nồng độ tìm lại, xác định hiệu suất thu hồi tương đối của điều kiện chiết. Khảo sát cột chiết: cách tiến hành bằng cách thêm 4 điểm chuẩn vào mẫu nước tiểu có nồng độ 5,0 µg/mL biết trước, sau khi xử lý mẫu theo quy trình đề xuất trên. Diện tích píc thu được tương ứng với nồng độ FQL thêm vào dựng đường thêm chuẩn (y = ax + b, x là nồng độ FQL trong mẫu nước tiểu, y là diện tích pic của FQL), tính nồng độ tìm lại sau xử lý mẫu (CX = b/a). Hiệu suất thu hồi là tỷ số giữa nồng độ tìm lại và nồng độ các FQ tính toán để thêm vào mẫu nước tiểu trắng được coi là hiệu suất thu hồi của cột chiết. Phụ thuộc vào điều kiện nghiên cứu chỉ khảo sát đối với 3 loại cột chiết như sau: - Cột Chromfilter C18, 500mg, 6ml: pha rắn được nhồi cột là octadecyl silica gel để giữ lại các hợp chất không phân cực thông qua tương tác kỵ nước mạnh. - Cột Water Oasis HLB, 500 mg, 6ml: chất hấp phụ pha đảo, đặc tính cân bằng thân nước – thân dầu (Hydrophilic-Lipophilic-Balanced – HLB). - Cột Agilent Bond Elut PLEXA, 500mg, 6ml: Lựa chọn cột chiết thông qua hiệu suất thu hồi của từng loại cột khi tiến hành chiết mẫu thử tự tạo với nồng độ 20 µg/mL. Khảo sát thành phần dung môi rửa tạp: Nền mẫu nước tiểu thường khá phức tạp, chứa nhiều chất khác nhau như ezym, vitamin, axit amin, các hợp chất hữu cơ và các ion như: Na+, NH4+, Mg2+, Cl-, để giảm sự ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích cần phải lựa chọn dung môi rửa tạp phù hợp, đảm bảo độ sạch và không làm mất đi một phần chất phân tích. Dựa vào các kết quả thu được đối với từng loại dung môi rửa tạp được dự kiến sau đây: 1. 5ml nước deion 2. 5ml nước deion được điều chỉnh pH = 3 bằng axit CH3COOH 3. 5ml dung dịch đệm phosphat 20mM pH = 3 4. 5ml dung dịch nước deion/MeOH (95:5) 5. 5ml hỗn hợp dung dịch nước deion/MeOH (95:5) và dung dịch đệm phosphat 20mM pH = 3 (1:1). Dung môi được lựa chọn làm dung dịch rửa tạp cho quy trình chiết pha rắn khi tương ứng cho diện tích píc của các FQL là lớn nhất, các píc chất cân đối được cách ra hoàn toàn. Khảo sát thành phần dung dịch rửa giải: Dung dịch rửa giải là yếu tố quan trọng quyết định khả năng rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, ảnh hưởng đến hiệu suất của quy trình chiết. Trong nghiên cứu này các dung dịch rửa giải được sử dụng để khảo sát lựa chọn dung dịch rửa giải tối ưu đó là ACN, MeOH, diclometan, etylacetat và hỗn hợp MeOH/diclometan (1:9), tất cả các dung dịch này đều được lấy với thể tích là 5ml cho quá trình rửa giải. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải: Về nguyên tắc thể tích rửa giải càng nhiều thì khả năng rửa giải càng triệt để, hiệu suất chiết tăng. Tuy nhiên nếu thể tích rửa giải lớn đồng nghĩa với thời gian cô đuổi dung môi sau rửa giải tăng lên không cần thiết. Do đó thể tích rửa giải được chọn để khảo sát là 3, 4, 5, 6, và 7 mL dung dịch rửa giải đã lựa chọn. 2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Độ tin cậy của phương pháp phân tích một số FQL trong huyết tương và nước tiểu được tiến hành trên mẫu thử tự tạo, đánh giá thông qua các điều kiện về: độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích [83]-[85]. 2.3.3.1. Đánh giá phương pháp phân tích FQL bằng phương pháp HPLC Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất, Trong phép phân tích định lượng, độ đặc hiệu là khả năng phát hiện chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác trong nền mẫu, nhằm hướng đến kết quả chính xác. Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích: Dung dịch mẫu nền: Mẫu nước tiểu và huyết tương không có chất cần phân tích FQL đã qua xử lý mẫu theo quy trình đã tối ưu. Dung dịch mẫu thử tự tạo: dịch sinh học (không có chất cần phân tích) đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích FQL và được xử lý mẫu theo qui trình. Dung dịch mẫu thêm chuẩn: mẫu thử tự tạo sau khi xử lý mẫu, tiến hành thêm chuẩn vào dịch nổi thu được. Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ, xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích. So sánh kết quả trên hai sắc ký đồ, mẫu trắng hoàn toàn không có tín hiệu tại thời gian lưu tương ứng của các chất phân tích FQL, nền mẫu phải tương đối sạch. Đối với mẫu thử tự tạo, tín hiệu chất phân tích cho pic sắc nhọn, nền mẫu tại vị trí của các chất phân tích cho tín hiệu thấp. Như vậy phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng yêu cầu. Khoảng tuyến tính Thực hiện quá trình xử lý mẫu trắng (mẫu nước tiểu, huyết tương không chứa FQL), theo quy trình đã khảo sát, thu được dung dịch sau chiết, sau đó thêm vào các FQL để tạo ra 6-10 dung dịch có nồng độ đã biết, tiêm vào hệ thống sắc ký. Dựa vào diện tích pic tương ứng với các nồng độ thêm chuẩn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính (Y = ax + b), hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Yêu cầu: Với phép thử định lượng hệ số tương quan (R) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.Thông thường, đối với các quá trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỷ số tín hiệu/nhiễu nền (S/N) bằng 3. Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích có thể định lượng được.Với các quá trình sắc ký, giá trị LOQ được xác định theo tỉ số giữa tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) là giá trị nồng độ thấp nhất của một chất phân tích theo một phương pháp tạo ra tín hiệu phân tích có xác suất 99% khác biệt so với mẫu trắng (nồng độ chất phân tích bằng 0). MDL được xác định thông qua việc thêm chuẩn vào nền mẫu trắng thực tế, tiến hành xử lý mẫu, phân tích trên hệ thống cho tín hiệu S/N bằng 3 và tín hiệu thu hồi 70-110%. MDL, MQL của phương pháp phân tích định lượng FQL trong mẫu huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC kết hợp phương pháp xử lý mẫu kết tủa protein, chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn được xác định trên nền mẫu trắng sau khi xử lý mẫu. Do đó MDL, MQL được tính bằng LOD, LOQ nhân với hệ số pha loãng của quy trình xử lý mẫu. Vì thế MDL, MQL sẽ có giá trị cao hơn LOD, LOQ. Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp Độ lặp lại đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi khi tiến hành trên các mẫu thử giống nhau, bằng cùng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (cùng người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong các khoảng thời gian ngắn. Tiến hành trên sáu mẫu thử tự tạo, xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng, thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic (mAU.s) và nồng độ của các FQL (µg/mL), thiết lập phương trình đường chuẩn (y = ax + b). Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) theo các công thức sau: SD = (2.1) RSD (%) = (2.2) Trong đó: Si là diện tích của pic thứ i. Stb là diện tích trung bình của n lần phân tích. n là số lần phân tích lặp lại. Với phép thử định lượng, giá trị RSD(%) ≤ 2,0%, các trường hợp giá trị RSD(%) trên 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp. Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường được đánh giá qua sai số tương đối hay bằng phương pháp xác định độ thu hồi. Xác định độ đúng của phương pháp trên các mẫu tự tạo bằng cách: thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu dịch sinh học không có chất cần phân tích. Chuẩn bị ba mẫu tự tạo với nồng độ ở 3 mức thấp, trung bình, cao. Bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các mẫu dịch sinh học (không chứa chất phân tích). Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất ba mẫu độc lập. Định lượng lại nồng độ dựa trên phương pháp đã nghiên cứu và phương trình hồi quy tuyến tính. Xác định độ thu hồi (80,0-110,0%) cho qui trình phân tích định lượng FQL và RSD tỷ lệ thu hồi (≤ 2,0%) ở mỗi mức nồng độ. Độ thu hồi (H): H = (2.3) Trong đó: H: Hiệu suất thu hồi (%) Ctt : Nồng độ thực tế tìm lại của mỗi chất sau khi phân tích (tính theo đường chuẩn) Clt: Nồng độ thêm chuẩn theo lý thuyết của chất phân tích được tính toán thêm vào 2.3.3.2. Đánh giá phương pháp phân tích MOXI trong huyết tương bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang Độ đặc hiệu Tiến hành với mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn MOXI với nồng độ đã biết bằng quy trình đã xây dựng. Sắc ký đồ thu được phải đảm bảo tính đặc hiệu theo hướng dẫn. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Tiến hành lặp lại (n= 10) mẫu thí nghiệm có nồng độ MOXI biết trước, tiến hành phản ứng tạo phức theo quy trình đã xây dựng, để ổn định phức và đem đo cường độ huỳnh quang I (a.u), thông qua phương trình đường chuẩn được xây dựng trên nền nước cất mục 2.3.2.2, tính giá trị SD. LOD = 3SD, LOQ = 10 SD. Tiêu chuẩn đánh giá LOD, LOQ thông qua giá trị R ( ), 4<R<10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và giá trị LOD là đáng tin cậy theo [85]. Khảo sát khoảng tuyến tính trên mẫu huyết tương Tiến hành trên mẫu thử tự tạo với nồng độ MOXI được thiết lập từ 0; (0,01; 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1,00; 1,20; 1,40; 1,60; 1,80; 2,00; 2,20; 2,40; 2,60; 2,80 ) ´10-5 M. Xây dựng mối quan hệ tương quan giữa cường độ huỳnh quang thu được và nồng độ của MOXI trong mẫu. Đánh giá thông qua phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2. Đường chuẩn trên mẫu huyết tương Tiến hành xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thử tự tạo với nồng độ MOXI chuẩn được thiết lập để thêm vào như sau: (0,10; 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1,00; 1,20; 1,40; 1,60)´10-5 M. Tương ứng với các thể tích chính xác của dung dịch MOXI 1,0×10-3 lần lượt: 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80 µL. Tiến hành trên điều kiện và quy trình phân tích đã khảo sát, đo cường độ huỳnh quang của phản ứng tạo thành. Thiết lập mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ MOXI trong mẫu huyết tương và cường độ huỳnh độ của phức Eu(III)-MOXI-SDBS. Phương trình đường chuẩn y = ax + b, trong đó x là nồng độ MOXI có trong mẫu, y là cường độ huỳnh quang của phức thu được. Độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp Độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp được tiến hành xác định như sau: Lấy một lượng xác định dung dịch chuẩn MOXI, bay hơi dung môi thu được cắn. Hòa tan cắn trong 1,0 ml huyết tương trắng (lắc xoáy 2500 vòng/phút trong 10 phút) thu được mẫu huyết tương thử. Sau đó, thêm 5 ml MeOH, lắc xoáy 2500 vòng/phút trong vòng 10 phút, ly tâm 15 phút ở 8000 vòng/phút. Lấy 4 ml dịch nổi, bốc hơi dung môi, hòa tan cắn thu được 1 ml nước cất 2 lần. Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm. Lấy 50 µl dung dịch mẫu đã xử lý này đem phản ứng tạo phức Eu(III)-MOX-SBDS với điều kiện phân tích đã khảo sát. Dựa trên đường chuẩn đã xây dựng, tính nồng độ thu hồi của MOXI. Độ thu hồi được tính theo công thức (2.3). 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả phân tích và định lượng được xử lý theo phần mềm của thiết bị phân tích: phần mềm Analyst của thiết bị LC-UV và LC-FLD. Xử lý số liệu bằng phần mềm Origin, Microsoft Excel®. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Quy trình phân tích hàm lượng moxifloxaxin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA 3.1.1. Điều kiện phân tích 3.1.1.1. Phổ hấp thụ MOXI có hai cực đại hấp thụ tại bước sóng 207 và 295 nm. Bước sóng thấp ở 207 nm không được sử dụng do tại bước sóng này nhiều tạp và dung môi cũng hấp thụ. Tại bước sóng 295 nm có cực đại hấp thụ lớn nhất, có tính chọn lọc cao hơn, loại bỏ được độ hấp thụ của dung môi và nhiều tạp chất khác (Hình 3.1). Do đó, bước sóng 295 nm được lựa chọn làm bước sóng phát hiện cho phương pháp. Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV của MOXI 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký Thành phần pha động Từ sắc ký đồ thu được cho thấy tại nồng độ chất chuẩn MOXI 10,0 µg/mL, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, hệ pha động gồm ACN:Đệm phosphat cho pic cân đối, sắc nhọn, đường nền thấp, ổn định và thời gian lưu thích hợp (Hình 3.2). Do đó, hệ này được lựa chọn làm dung môi pha động cho phương pháp phân tích. Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát thành phần dung môi pha động khi định lượng MOXI Tỷ lệ của hệ pha động Hệ dung môi pha động là ACN–đệm phosphat pH 3,5 với các tỷ lệ khác nhau gồm: (70:30); 60:40); (50:50); (30;70); (15:85) được sử dụng cho phân tích MOXI. Kết quả cho thấy, tại tỷ lệ ACN–đệm phosphat là 60:40 cho tín hiệu pic cân đối, đường nền thấp, diện tích pic lớn nhất (Hình 3.3). Do đó, tỷ lệ này được lựa chọn cho phương pháp phân tích. Hình 3.3. Kết quả khảo ảnh hưởng của tỷ lệ pha động đến diện tích pic của MOXI Độ pH của dung dịch đệm phosphat Kết quả cho tại pH 4,0 diện tích pic là lớn nhất thể hiện trên biểu đồ (Hình 3.4). Nên độ pH này được lựa chọn sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm phosphat đến diện tích pic MOXI Nồng độ đệm Kết quả cho diện tích pic MOXI lớn nhất và đường nền thấp trên sắc ký đồ tại dung dịch đệm phosphat có nồng độ bằng 20 mM (Hình 3.5). Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm đến diện tích pic MOXI Tốc độ dòng pha động Từ sắc ký đồ thu được cho thấy tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút cho tín hiệu pic cân đối, sắc nhọn, diện tích pic lớn nhất và đó là tốc độ dòng được lựa chọn cho phương pháp, Hình 3.6 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động Như vậy, sau khi khảo sát thu được các điều kiện sắc ký cho phương pháp định lượng MOXI trên hệ thống HPLC-PDA như sau (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Điều kiện sắc ký khi định lượng MOXI bằng phương pháp HPLC – PDA Cột C18 MRC-ODS (25cm×4,6mm, 5µm) Detector PDA Bước sóng (nm) 295 Pha động ACN– đệm phosphat; pH = 4,0, nồng độ đệm 20mM (60:40) Rửa giải Đẳng dòng Tốc độ dòng (ml/phút) 0,8 Thời gian lưu (phút) 7,40 ± 0,05 Thể tích mẫu (µl) 20 3.1.2. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương 3.1.2.1. Chuẩn bị mẫu thử tự tạo Lấy một thể tích dung dịch gốc MOXI có nồng độ 500 µg/mL, pha loãng bằng MeOH để được nồng độ 10,0 µg/mL. Lấy chính xác một thể tích dung dịch MOXI 10,0 µg/mL (trong khoảng từ 50 - 1000 µL, bay hơi dung môi thu cắn (khí N2, 40oC). Hòa tan cắn trong 1,0 mL mẫu huyết tương trắng, lắc xoáy trong 2 phút để được mẫu tự tạo có nồng độ MOXI cần sử dụng. 3.1.3.2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu Quy trình khảo sát sử dụng TCA để kết tủa protein gồm các thông số: tỷ lệ TCA/huyết tương, nồng độ TCA, thời gian lắc và thời gian ly tâm. Cụ thể như sau: Hút chính xác 1,0 mL mẫu thử tự tạo thêm 2 ml dung dịch TCA 10%, lắc xoáy trong 1 phút, sau đó ly tâm 15 phút, lấy chính xác một lượng dung dịch nổi, sau đó làm bay hơi dung môi (nhiệt độ 40 °C, bằng dòng khí N2) để thu cắn. Cuối cùng, hòa tan cắn bằng dung môi pha động và lọc bằng màng lọc 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống HPLC. Tỷ lệ thể tích giữa TCA và huyết tương: Sử dụng TCA làm tăng khả năng kết tủa protein. Tuy nhiên, lượng TCA quá cao có thể làm thay đổi các điều kiện phân tích với hệ thống HPLC, dẫn đến giảm độ thu hồi phân tích. Do đó, chúng tôi khảo sát sáu tỷ lệ thể tích của TCA trong huyết tương: 1:4; 1:2; 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 (v/v) với nồng độ MOXI trong huyết tương là 3,8 µg/ml. Kết quả cuối cùng MOXI đạt độ thu hồi cao (trên 80%) tại tỷ lệ TCA : huyết tương là 1:1 (v/v), còn tại các tỷ lệ khác cho thu hồi của MOXI thấp hơn (PL1.1). Điều này có thể do tại thể tích huyết tương cao hay tại thể tích TCA thấp thì đều chưa kết tủa hoàn toàn protein trong huyết tương. Nồng độ tác nhân kết tủa: Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ TCA đến việc loại bỏ protein, nồng độ TCA ban đầu được thay đổi từ 10%, 15%, 20% và 25% với tỷ lệ thể tích của TCA trong huyết tương người là 1:1 (v/v). Kết quả tối ưu nhất thu được tại nồng độ TCA 20% do có hiệu suất thu hồi cao hơn trùng với nồng độ tác nhân TCA dự kiến cho quy trình khảo sát (PL1.2). Thời gian lắc xoáy: Thời các thời gian lắc xoáy hỗn hợp khác nhau: 30 giây; 60 giây; 90 giây; 120 giây và 180 giây. Ảnh hưởng của thời gian lắc xoáy đến sự thu hồi MOXI trong huyết tương với TCA (20%): huyết tương người (1:1, v/v) là đáng kể (PL1.3). Kết quả độ thu hồi cao nhất trong thời gian trộn 120 giây. Và độ thu hồi bắt đầu thay đổi không đáng kể trong khi tăng thời gian trộn bằng lắc xoáy vì lúc đó phản ứng kết tủa đã hoàn toàn và toàn bộ lượng MOXI đã được phân tán tốt trong dung dịch. Cơ chế tách ly tâm: Cơ chế của ly tâm là tách các chất có khối lượng phân tử khác nhau. Tốc độ ly tâm càng cao thì khả năng tách protein trong dung dịch chứa MOXI càng cao. Để khảo sát sự phụ thuộc của độ thu hồi MOXI trong huyết tương vào tốc độ ly tâm, cố định các điều kiện đã khảo sát, thời gian ly tâm 15 phút thay đổi tốc độ ly tâm từ 1000 vòng/phút, 2000 vòng/phút, 3000 vòng/phút, 4000 vòng/phút và 5000 vòng/phút. Và kết quả làm lắng kết tủa protein phù hợp nhất tại tốc độ ly tâm 2000 vòng/phút (PL1.4). Thời gian ly tâm: Thời gian ly tâm có ảnh hưởng lớn đến sự phân tách giữa pha kết tủa protein và pha lỏng chứa MOXI. Việc tách tốt sẽ chỉ thu được khi có thời gian ly tâm đủ cao. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ly tâm từ 5 phút đến 25 phút cho thấy sự phụ thuộc của độ thu hồi của MOXI vào thời gian ly tâm được thể hiện rõ ràng khi thời gian ly tâm tăng dần, độ thu hồi tăng dần và đạt cực đại sau 15 phút. Ở thời gian ly tâm cao hơn 15 phút, độ thu hồi không thay đổi đáng kể (PL1.5). Do đó, thời gian cần thiết cho quá trình ly tâm được lựa chọn phù hợp nhất tại 15 phút. Kết luận: Sau khi khảo sát kết quả cho quy trình tối ưu để xác định MOXI trong huyết tương người như sau: 1,0 ml mẫu huyết tương chuyển vào ống ly tâm 10 ml. Thêm 1,0 ml TCA 20% và trộn bằng lắc xoáy trong 120 giây. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm trong 15 phút với tốc độ 2000 vòng/phút. Tiếp theo, thu lấy dịch nổi lọc bằng màng lọc 0,45 µm, tiêm vào hệ thống HPLC, sơ đồ quy trình Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu thử tự tạo với nồng độ MOXI 3,0 µg/ml tiến hành bằng quy trình đã xây dựng được thể hiện trên Hình 3.8. Kết quả này cho thấy pic MOXI đối xứng, sắc nét, tách biệt với các pic khác của nền huyết tương. Do đó, quy trình phân tích này hoàn toàn có thể sử dụng để phân tích xác định hàm lượng MOXI trong mẫu huyết tương người bệnh sau khi quy trình đã được thẩm định giá trị tin cậy của phương pháp. Hình 3.7. Quy trình xử lý mẫu huyết tương chứa MOXI sau khi đã tối ưu hóa xử lý mẫu Hình 3.8. Sắc ký đồ MOXI trong mẫu huyết tương người tại nồng độ 3,0 µg/mL 3.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Độ đặc hiệu Tiến hành song song 2 mẫu: mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương thử tự tạo (thêm chuẩn 3,0 µg/mL MOXI). Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy, mẫu thử tự tạo nồng độ MOXI 3,0 µg/mL (b), có pic xuất hiện tại thời gian lưu 7,4 phút, trùng với thời gian lưu của MOXI chuẩn trên nền pha động, đối với mẫu trắng nền mẫu không xuất hiện píc tạp tại thời gian lưu của MOXI trên sắc ký đồ, điều đó chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao đối với MOXI (Hình 3.9). Hình 3.9. Sắc ký đồ của MOXI (a) mẫu trắng, (b) mẫu huyết tương tự tạo với nồng độ MOXI 3,0 µg/mL Giá trị LOD và LOQ Tiến hành với điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu đã xây dựng trên mẫu thử tự tạo có nồng độ MOXI giảm dần cho tới khi bằng 0,15 µg/ml, ghi lại sắc ký đồ, chiều cao píc tín hiệu của chất phân tích MOXI (S), chiều cao nhiễu nền (N). Kết quả giá trị LOD và LOQ của MOXI là 0,15 và 0,50 µg/ml (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Giá trị LOD, LOQ của phương pháp định lượng MOXI trong huyết tương Nồng độ MOXI (µg/ml) 0,15 Chiều cao trung bình của pic MOXI (S) 307,12 Chiều cao trung bình nhiễu nền (N) 83 Tỷ số S/N 3,70 LOD (µg/ml) 0,15 LOQ (µg/ml) 0,50 Một số các nghiên cứu cũng báo cáo kết quả giá trị của LOD và LOQ của phương pháp đã công bố thấp hơn so với giá trị trên [85]-[85]. Tuy nhiên, đối với thực tế lâm sàng, ở nồng độ này xác định nồng độ thuốc là an toàn và hiệu quả bởi vì nồng độ trung bình được báo cáo là 0,59 µg/mL [86]. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Pha các mẫu tự tạo huyết tương có thể tích 500µL có chứa MOXI từ dung dịch chuẩn để có các nồng độ 0,3; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 10,0; 14,0; 18,0 và 25,0 µg/ml. Mỗi điểm nồng độ được phân tích 3 lần với hệ thống HPLC đã tối ưu điều kiện. Dựa vào mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic thu được (PL1.6), dựng đường chuẩn Hình 3.10. Hình 3.10. Đường chuẩn khi định lượng MOXI trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Hệ số tương quan (R²) của phương pháp là 0,9991. Do đó, khoảng nồng độ tuyến tính của mẫu huyết tương tự tạo chứa MOXI từ 0,3-25,0 µg/mL. Đường chuẩn thiết lập được như sau: y = (93241 ± 1834,2)x - (33414 ± 21155,6). Trong đó, y là diện tích pic và x là nồng độ MOXI trong huyết tương (µg/mL). Độ đúng và độ chính xác Sau khi tiến hành trên mẫu thử tự tạo có nồng độ ở mức thấp, trung bình, cao tương ứng nồng độ MOXI trong mẫu huyết tương là 1,0; 5,0 và 10,0 µg/mL. Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã khảo sát (sơ đồ Hình 3.7). Dựa vào phương trình đường chuẩn đã xây dựng y = 93241x – 33414, tính nồng độ tìm lại x = (y-b)/a. Mỗi nồng độ được thực hiện 5 lần, lấy diện tích pic trung bình tương ứng với các nồng độ MOXI trong mẫu (PL1.7), dựa vào diện tính toán nồng độ thu