Luận án Nghiên cứu phát triển kỹ thuật Multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis - Đinh Thị Thu Hằng

41 0.002636 PBC14 B42 0.002373 15. PBA15 B43 0.001465 PBB15 B44 0.001318 PBC15 B45 0.001187 16. PBA16 B46 0.000732 PBB16 B47 0.000659 PBC16 B48 0.000593 17. PBA17 B49 0.000366 PBB17 B50 0.000330 PBC17 B51 0.000296 18. PBA18 B52 0.000183 PBB18 B53 0.000165 PBC18 B54 0.000148 19. PBA19 B55 0.000092 PBB19 B56 0.000083 PBB19 B57 0.000074 20. PBA20 B58 0.000046 PBB20 B59 0.000042 PBB20 B60 0.000038 Hình 3. 23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis M. Marker 50 bp; B50-B59. Các mức nồng độ DNA; ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion Mẫu có nồng độ DNA thấp nhất còn cho khả năng phát hiện được là B55 (mã số gốc PBA19) (Hình 3.23). Tiếp tục kiểm tra 10 lần với mẫu B54, B55 và B56 B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 M ĐC(-) 71 được kết quả các mẫu B54, B55 đều cho các gen đặc trưng của B. anthracis, còn mẫu B56 không xuất hiện đủ 3 băng đích (thiếu băng 222 bp, hoặc băng 222 bp và 610 bp). Như vậy, ngưỡng phát hiện của bộ mẫu chuẩn bằng mPCR phát hiện B. anthracis là nồng độ của mẫu B55 (PBA16) 0,000092 ng/µl tương đương 16,3 copy/µl hay 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng 5 µl DNA mẫu. Thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. anthracis Với kết quả xác định ngưỡng của mPCR phát hiện B. anthracis như trên, mẫu B55 được xác định là ngưỡng phát hiện của kit mPCR cho B. anthracis (nồng độ là 0,000092 ng/µl). Từ kết quả này, tiến hành thiết lập bộ mẫu chuẩn 100 ống (50 µl/ ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột, 10 mức nồng độ được sử dụng ở bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát hiện B. anthracis từ PBA10 (0,046875 ng/µl) - PBA19 (0,000092 ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 - EB10. Hàng ký hiệu EB10 có nồng độ thấp nhất chính là ngưỡng phát hiện. Bảng 3. 8. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. anthracis Stt Ng/µl- Mã số gốc 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 1. 0.046875 PBA10 EB1 EB1 EB1 EB1 EB1 EB1 EB1 EB1 EB1 EB1 2. 0.023438 PBA11 EB2 EB2 EB2 EB2 EB2 EB2 EB2 EB2 EB2 EB2 3. 0.011719 PBA12 EB3 EB3 EB3 EB3 EB3 EB3 EB3 EB3 EB3 EB3 4. 0.005859 PBA13 EB4 EB4 EB4 EB4 EB4 EB4 EB4 EB4 EB4 EB4 5. 0.002930 PBA14 EB5 EB5 EB5 EB5 EB5 EB5 EB5 EB5 EB5 EB5 6. 0.001465 PBA15 EB6 EB6 EB6 EB6 EB6 EB6 EB6 EB6 EB6 EB6 7. 0.000732 PBA16 EB7 EB7 EB7 EB7 EB7 EB7 EB7 EB7 EB7 EB7 8. 0.000366 PBA17 EB8 EB8 EB8 EB8 EB8 EB8 EB8 EB8 EB8 EB8 72 Stt Ng/µl- Mã số gốc 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 9. 0.000183 PBA18 EB9 EB9 EB9 EB9 EB9 EB9 EB9 EB9 EB9 EB9 10. 0.000092 PBA19 EB10 EB10 EB10 EB10 EB10 EB10 EB10 EB10 EB10 EB10 Thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát hiện Y. pestis Tương tự như thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát hiện B. anthracis, từ mẫu gốc DNA nồng độ 170 ng/µl với thể tích ban đầu 200 µl, tiến hành pha loãng 8 lần để tạo nồng độ ban đầu đạt 21,25 ng/µl, ký hiệu YA1 (từ 50 µl dung dịch gốc, bổ sung 350 µl nước khử ion). Từ YA1 pha loãng bằng nước khử ion thành YB1 = 270 µl YA1 + 30 µl H2O. Tiếp tục pha loãng tạo YC1 = 180 µl PBB1 + 20 µl H2O. Như vậy, 3 mẫu YA1, YB1 và YC1 có nồng độ lần lượt là 21,25; 19,125 và 17,213 ng/µl. Từ 3 nồng độ này, tiến hành pha loãng theo hệ số 2 trong nước khử ion để tạo nồng độ giảm dần (tỷ lệ pha loãng từ 2-1 đến 2-19) (Bảng 3.9). Bảng 3. 9. Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis Stt Mã số gốc Mã số bộ panel Nồng độ ng/µl Mã số gốc Mã số bộ panel Nồng độ ng/µl Mã số gốc Mã số bộ panel Nồng độ ng/µl 1. YA1 Y1 21.25 YB1 Y2 19.125 YC1 Y3 17.2125 2. YA2 Y4 10.625 YB2 Y5 9.5625 YC2 Y6 8.60625 3. YA3 Y7 5.3125 YB3 Y8 4.78125 YC3 Y9 4.303125 4. YA4 Y10 2.65625 YB4 Y11 2.390625 YC4 Y12 2.151563 5. YA5 Y13 1.328125 YB5 Y14 1.195313 YC5 Y15 1.075781 6. YA6 Y16 0.664063 YB6 Y17 0.597656 YC6 Y18 0.537891 7. YA7 Y19 0.332032 YB7 Y20 0.298828 YC7 Y21 0.268945 8. YA8 Y22 0.166016 YB8 Y23 0.149414 YC8 Y24 0.134473 9. YA9 Y25 0.083078 YB9 Y26 0.074707 YC9 Y27 0.067236 10. YA10 Y28 0.041504 YB10 Y29 0.037354 YC10 Y30 0.033618 11. YA11 Y31 0.020752 YB11 Y32 0.018677 YC11 Y33 0.016809 12. YA12 Y34 0.010376 YB12 Y35 0.009338 YC12 Y36 0.008405 13. YA13 Y37 0.005188 YB13 Y38 0.004669 YC13 Y39 0.004202 14. YA14 Y40 0.002594 YB14 Y41 0.002335 YC14 Y42 0.002101 15. YA15 Y43 0.001297 YB15 Y44 0.001167 YC15 Y45 0.001051 73 Stt Mã số gốc Mã số bộ panel Nồng độ ng/µl Mã số gốc Mã số bộ panel Nồng độ ng/µl Mã số gốc Mã số bộ panel Nồng độ ng/µl 16. YA16 Y46 0.000648 YB16 Y47 0.000584 YC16 Y48 0.000525 17. YA17 Y49 0.000324 YB17 Y50 0.000292 YC17 Y51 0.000262 18. YA18 Y52 0.000162 YB18 Y53 0.000146 YC18 Y54 0.000131 19. YA19 Y55 0.000081 YB19 Y56 0.000073 YC19 Y57 0.000066 20. YA20 Y58 0.000042 YB20 Y59 0.000037 YC20 Y60 0.000033 Hình 3. 24. Xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis M. Marker 100 bp; Y50-Y59. Các mức nồng độ DNA; ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion Kết quả cho thấy, mẫu Y54 (mã số gốc YC18) (Hình 3.24) được xác định là ngưỡng phát hiện của mPCR cho Y. pestis. Tương tự, tiến hành kiểm tra 10 lần với mẫu Y53, Y54 và Y55 được kết quả các mẫu Y53, Y54 đều cho các gen đặc trưng của Y. pestis, còn mẫu Y55 không xuất hiện đủ ba băng đích (thiếu băng 103 bp, hoặc băng 103 và 271 bp). Như vậy, ngưỡng phát hiện của bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát hiện Y. pestis là nồng độ mẫu Y54 (YC18) 0,000131 ng/µl tương đương 26,1 copy/µl hay 130,5 copy/ phản ứng mPCR với 5 µl DNA mẫu. Thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y. pestis Tương tự như thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. anthracis, bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y. pestis cũng được thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột, mỗi hàng gồm 10 ống cùng nồng độ. Sử dụng 10 mức nồng độ ở bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng Y50 Y51 Y52 Y53 Y54 Y55 Y56 Y57 Y58 Y59 M ĐC(-) 74 mPCR phát hiện Y. pestis từ YC9 (0,067236 ng/µl) - YC18 (0,000131 ng/µl) tương ứng ký hiệu EY1 - EY10. Hàng ký hiệu EY10 có nồng độ thấp nhất chính là ngưỡng phát hiện (Phụ lục 5). 3.2.1.2. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu chẩn đoán của kit mPCR Thiết lập bộ mẫu chuẩn đánh giá độ đặc hiệu đối với B. anthracis Các bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR được thiết lập tương tự với các bộ mẫu chuẩn độ nhạy. Bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR đối với B. anthracis được thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu C1 đến C10) x 10 cột, mỗi hàng gồm 10 ống cùng nồng độ (Bảng 3.10). Chủng B. cereus Bc1 được chuẩn bị, tách chiết và tinh sạch DNA đạt nồng độ 150 ng/µl (nồng độ gốc), pha loãng trong nước khử ion đạt nồng độ 20 ng/µl, ký hiệu C1. Từ mẫu C1, tiến hành pha loãng theo hệ số 2 từ 2-1 - 2-9, ký hiệu từ C2 - C10. Bảng 3. 10. Bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu kiểm định kit B. anthracis Stt ng/µl 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 1. 20 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 2. 10 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 3. 5 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 4. 2,5 C4 C4 C4 C4 C4 C4 C4 C4 C4 C4 5. 1,25 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 6. 0,625 C6 C6 C6 C6 C6 C6 C6 C6 C6 C6 7. 0,3125 C7 C7 C7 C7 C7 C7 C7 C7 C7 C7 8. 0,1563 C8 C8 C8 C8 C8 C8 C8 C8 C8 C8 9. 0,0781 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 10. 0,0391 C10 C10 C10 C10 C10 C10 C10 C10 C10 C10 Thiết lập bộ mẫu chuẩn đánh giá độ đặc hiệu đối với Y. pestis Bộ mẫu chuẩn đánh giá độ đặc hiệu đối với Y. pestis cũng được thiết lập tương tự như Mục 3.3.2.1, sử dụng chủng vi khuẩn E. coli ATCC 25922, tách và tinh sạch DNA đạt nồng độ 100,3 ng/µl, pha loãng trong nước khử ion đạt nồng độ 12 ng/µl, ký hiệu E1. Từ mẫu E1, tiến hành pha loãng theo hệ số 2 từ 2-1 - 2-9 tạo các dung dịch có nồng độ giảm dần (ký hiệu từ E2 - E10). Tương tự như E. coli, vi khuẩn Y. enterocolitica được tách, tinh sạch DNA và thiết lập bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu cho Y. pestis (Phụ lục 6). 75 3.2.1.3. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis Để thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau khi thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy và đặc hiệu xác định từng tác nhân, chúng tôi tiến hành phối trộn các bộ mẫu chuẩn riêng rẽ tương ứng để tạo các bộ mẫu chuẩn hỗn hợp cho đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Cụ thể, bộ mẫu chuẩn hỗn hợp xác định độ nhạy của mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis (ký hiệu EBY1- EBY10) được thiết lập từ 2 bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy của mPCR là cho B. anthracis (EB1-EB10) và Y. pestis (EY1-EY10). Bộ mẫu chuẩn hỗn hợp xác định độ nhạy gồm 100 ống (50 µl/ ống), bao gồm: 10 hàng x 10 cột, nồng độ giảm dần từ EBY1-EBY10. Nồng độ của EBY1 được phối trộn từ ống EB1 và ống EY1. Thực hiện tương tự cho các hàng còn lại, đến hàng thứ 10 (EBY10) được phối trộn từ ống EB10 và ống EY10 có nồng độ thấp nhất chính là ngưỡng phát hiện. Đồng thời, chúng tôi cũng đã thiết lập các bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu cho B. anthracis và Y. pestis (Phụ lục 7). 3.2.1.4. Đánh giá kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với B. anthracis Khả năng phát hiện B. anthracis của bộ kit mPCR được kiểm tra trên 100 mẫu (từ mẫu EB1 đến EB10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis cho kết quả là 100% các mẫu đều phát hiện đầy đủ các gen đặc trưng của B. anthracis (Hình 3.25). Bảng 3. 11. Đánh giá độ nhạy của mPCR với B. anthracis trên bộ mẫu chuẩn Kit mPCR Bộ mẫu chuẩn DNA độ nhạy xác định B. anthracis Gene vrrA Gene capA Gene pagA (+) (-) (+) (-) (+) (-) Kết quả 100 0 100 0 100 0 Tỷ lệ 100% 0% 100% 0% 100% 0% 76 Hình 3. 25. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. mẫu DNA ký hiệu EB2 lặp lại 10 lần; ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với Y. pestis Khả năng phát hiện Y. pestis của bộ kit mPCR được kiểm tra trên 100 mẫu (từ EY1 đến EY10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ nhạy với Y. pestis cho kết quả là 100% các mẫu đều xác định đầy đủ các gen đặc trưng và độc lực của Y. pestis (Bảng 3.12, Hình 3.26). Bảng 3. 12. Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn Kit mPCR Bộ mẫu chuẩn DNA độ nhạy xác định Y. pestis Gene ypo Gene pla Gene caf1 (+) (-) (+) (-) (+) (-) Kết quả 100 0 100 0 100 0 Tỷ lệ 100% 0% 100% 0% 100% 0% Hình 3. 26. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với Y. pestis M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. mẫu DNA ký hiệu EY3 lặp lại 10 lần; ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion 77 Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với B. anthracis và Y. pestis Khả năng phát hiện đồng thời B. anthracis và Y. pestis của kit mPCR được kiểm tra trên 100 mẫu (từ EBY1 đến EBY10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis và Y. pestis cho kết quả 100% các mẫu đều xác định đầy đủ các gen đặc trưng và độc lực của B. anthracis và Y. pestis (Hình 3.27). Hình 3. 27. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis và Y. pestis M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. mẫu DNA ký hiệu EBY2 lặp lại 10 lần. Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR đối với B. anthracis Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của kit BaYp - mPCR trên 100 mẫu (từ C1 đến C10 mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu đã thiết lập từ B. cereus có cấu trúc gần loài với B. anthracis. Kết quả 100% các mẫu không xuất hiện các gen đặc trưng capA, pagA của B. anthracis nhưng 100% các mẫu dương tính với gen vrrA. Điều này chứng tỏ mối di truyền rất gần loài giữa B. anthracis và B. cereus (Bảng 3.13, Hình 3.28). Bảng 3. 13. Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR với B. anthracis Kit mPCR Bộ mẫu chuẩn DNA độ đặc hiệu xác định B. anthracis Gene vrrA Gene capA Gene pagA (+) (-) (+) (-) (+) (-) Kết quả 100 0 0 100 0 100 Tỷ lệ 100% 0% 0% 100% 0% 100% 78 Hình 3. 28. Đánh giá độ đặc hiệu với B. anthracis của bộ kit BaYp-mPCR M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. mẫu DNA ký hiệu C6 lặp lại 10 lần. Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR đối với Y. pestis Độ đặc hiệu của kit BaYp - mPCR được đánh giá trên 100 mẫu (từ E1 đến E10 mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu với Y. pestis đã thiết lập từ vi khuẩn E. coli ATCC 25922 và Y. enterocolitica. Kết quả là 100% các mẫu đều không xuất hiện các gen đặc trưng của Y. pestis (Bảng 3.14, Hình 3.29). Bảng 3. 14. Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn Kit mPCR Bộ mẫu chuẩn DNA độ đặc hiệu chẩn đoán Y. pestis (với DNA tách từ E. coli) Gene ypo2088 Gene pla Gene caf1 (+) (-) (+) (-) (+) (-) Kết quả 0 100 0 100 0 100 Tỷ lệ 0% 100% 0% 100% 0% 100% Hình 3. 29. Kiểm định độ đặc hiệu với Y. pestis của bộ kit BaYp-mPCR M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. mẫu DNA ký hiệu E6 lặp lại 10 lần. 79 3.2.1.5. Đánh giá độ ổn định của kit mPCR Chúng tôi khảo sát độ ổn định của kit trong thời gian 12 tháng bảo quản kit ở điều kiện -20oC trên 12 ống DNA giống hệt nhau về nồng độ (sử dụng nồng độ ký hiệu EBY2). Sau 12 tháng bảo quản, kit mPCR vẫn cho kết quả dương tính rõ với 6 băng đích và không có sự khác biệt lớn giữa các tháng (Hình 3.30-32 và Phụ lục 8). Như vậy, có thể khẳng định các thành phần của kit BaYp-mPCR vẫn còn giữ nguyên hoạt tính như ban đầu, hay kit chế tạo có sự ổn định tối thiểu 12 tháng bảo quản ở điều kiện -20oC. Hình 3. 30. Kiểm tra mPCR ngay sau khi tạo master mix M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. Các mẫu DNA trong cùng 1 ống EBY2 Hình 3. 31. Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản một tháng M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. Các mẫu DNA trong cùng 1 ống EBY2 80 Hình 3. 32. Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản 12 tháng M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1-10. Các mẫu DNA trong cùng 1 ống EBY2 3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi xác định đồng thời gen đặc trưng, gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis đã được thiết kế và tối ưu thành công trên chủng chuẩn. Việc đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn là trong điều kiện lý tưởng, là điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit nào trước khi đưa ra thử nghiệm lâm sàng. Với các chủng lâm sàng B. anthracis cũng như Y. pestis, đặc biệt là các mẫu phân lập ngoài môi trường hay lưu trữ thời gian dài trong phòng thí nghiệm, một số tính chất về kiểu hình, kiểu gen có thể bị biến đổi. Do đó, để khẳng định việc thiết kế thành công kỹ thuật mPCR, các chủng phân lập B. anthracis và Y. pestis sau khi được được tiến hành kiểm tra, xác định bằng nuôi cấy, xác định bằng kỹ thuật mPCR, đã được khẳng định bằng phân tích trình tự toàn bộ chiều dài một số gen tiêu biểu trên nhiễm sắc thể và các plasmid độc lực. 3.2.2.1. Xác định chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh B. anthracis Các chủng nghi ngờ B. anthracis và chủng chuẩn B. anthracis Ba (đối chứng dương) được nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu ở 37oC/ CO2 5%/ 24 giờ. Kết quả, tất cả các chủng cho khuẩn lạc dạng R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vuông hai đầu, xếp đôi, chuỗi, bào tử ở giữa và không làm biến đổi hình dạng 81 vi khuẩn, trong đó 11 chủng không tan máu β trên môi trường thạch máu cừu. Trong số 11 chủng này, có 4 chủng hình thành vỏ (B. anthracis Ba, Ba1, Ba3, Ba4), 13 chủng còn lại gây tan máu β trên môi trường thạch máu cừu (Hình 3.33). a) b) Hình 3. 33. Khuẩn lạc các chủng nghi ngờ B. anthracis trên thạch máu cừu a) Chủng Ba3 không gây tan máu; b) chủng Ba10 tan máu Các chủng vi khuẩn tiếp tục được pha thành huyền dịch, định danh bằng kit API 50CH. Kết quả định danh có 11 chủng là B. anthracis với ID > 90% (Hình 3.34), các chủng còn lại là B. cereus (ID > 90%) (Bảng 3.15). Hình 3. 34. Định danh chủng B. anthracis Ba3 bằng kit API 50 CH 82 Bảng 3. 15. Tổng hợp kết quả định danh các chủng B. anthracis bằng kit API 50 CH TT Mã chủng Kết quả định danh (ID) TT Mã chủng Kết quả định danh (ID) 1 Ba B. anthracis (99,9%) 13 Ba12 B. cereus (95,2%) 2 Ba1 B. anthracis (99,7%) 14 Ba13 B. cereus (97,8%) 3 Ba2 B. anthracis (96,2%) 15 Ba14 B. cereus (97,8%) 4 Ba3 B. anthracis (99,9%) 16 Ba15 B. cereus (98,8%) 5 Ba4 B. anthracis (99,6%) 17 Ba16 B. cereus (98,2%) 6 Ba5 B. anthracis (94,2%) 18 Ba17 B. cereus (95,2%) 7 Ba6 B. anthracis (96,8%) 19 Ba18 B. cereus (93,6%) 8 Ba7 B. anthracis (99,1%) 20 Ba19 B. cereus (96,8%) 9 Ba8 B. anthracis (91,2%) 21 Ba20 B. cereus (95,8%) 10 Ba9 B. anthracis (93,6%) 22 Ba21 B. cereus (92,4%) 11 Ba10 B. cereus (93,6%) 23 Ba22 B. cereus (94,2%) 12 Ba11 B. anthracis (99,8%) 24 Ba23 B. cereus (93 - 98%) Y. pestis Chủng vi khuẩn đông khô Y. pestis Yp2 và chủng chuẩn Y. pestis Yp (đối chứng dương) được tăng sinh trên canh thang BHI, ủ ấm 28 ±1oC/ 48 h, sau đó cấy chuyển sang môi trường thạch máu cừu, ủ ấm 28 ±1oC/ 48 h. Kết quả trên môi trường thạch máu cừu, chúng tôi thu được các khuẩn lạc kích thước 1 - 2 mm dạng S (Smooth - dạng trơn nhẵn), màu xám đục, bờ đều, bề mặt nhẵn, trung tâm lồi giống hình trứng oplet và không gây tan máu. Nhuộm Gram thấy trực khuẩn Gram âm nhỏ, đứng đơn, xếp đôi, oxydase (-) (Hình 3.35). Hình 3. 35. Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu cừu Khuẩn lạc các chủng Y. pestis Yp1, Yp2 được pha thành huyền dịch và định danh cho kết quả là Y. pestis với ID 98,6 và 96,4%, do vậy kết quả này là tin cậy. 83 3.2.2.2. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR được thử nghiệm trên các mẫu nghiên cứu B. anthracis, Y. pestis và các mẫu đối chứng âm là B. cereus, E. coli, E. enterocolitica. Ở tất cả các mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm đều xuất hiện băng chứng nội tại IC, điều này chứng tỏ quá trình tách chiết DNA và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác định sau đây là đáng tin cậy (minh họa ở Hình 3.36). Mẫu đối chứng âm chỉ xuất hiện băng có kích thước khoảng 220 bp - tương ứng với gen vrrA, ngoài ra không xuất hiện thêm băng nào khác. Điều này là phù hợp, vì đối chứng âm sử dụng chủng B. cereus, gen vrrA có mặt trong các loài nhóm “B. cereus”. Còn mẫu đối chứng dương xuất hiện cả 6 gen đích đối với cả 2 tác nhân (Hình 3.36a), hoặc xuất hiện cả 3 gen đích đối với từng tác nhân (Hình 3.36b). Hình 3. 36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC Kết quả thử nghiệm kỹ thuật mPCR cho thấy, khi chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (Mẫu Ba5 Hình 3.36a) hay không xuất hiện M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) a) (+). Đối chứng dương là hỗn hợp mẫu chủng chuẩn B. anthracis Ba và Y. pestis Yp; (-). Đối chứng âm là hỗn hợp mẫu B. cereus và E. coli; BY2. Mẫu thử nghiệm hỗn hợp B. anthracis Ba4 và Y. pestis Yp2; Yp1. Mẫu Y. pestis Yp1; Yp2. Mẫu Y. pestis Yp2; Ba4. Mẫu B. anthracis Ba4; Ba5. Mẫu B. anthracis Ba5; Ba6. Mẫu B. anthracis Ba6. b) (+). Đối chứng dương là mẫu B. anthracis Ba; (-). Đối chứng âm là mẫu B. cereus; Ba3. Mẫu B. anthracis Ba3; Ec. Mẫu E. coli 5.; 6. Mẫu B. anthracis Ba5; 7. Mẫu B. anthracis Ba6; 9. Mẫu B. cereus Bc1; 10. Mẫu E. coli Ec1 a) b) (+) (-) M BY2 Yp1 Yp2 Ba4 M Ba5 Ba6 (+) (-) M Ba3 Ec a) b) 84 băng đích nào (Mẫu Ec Hình 3.36b), được xác định là mẫu âm tính với B. anthracis và Y. pestis gây bệnh (tương ứng là mẫu B. anthracis Ba5 và E. coli). Cụ thể, kết quả Hình 3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất hiện đầy đủ 6 băng đích có kích thước đúng với mẫu đối chứng dương, được xác định là mẫu dương tính đồng thời với B. anthracis và Y. pestis có đầy đủ độc lực. Mẫu ở đường chạy ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 ở Hình 3.36a và mẫu ở đường chạy ký hiệu Ba3 ở Hình 3.36b xuất hiện đầy đủ 3 băng của các gen đích cho từng đối tượng, được xác định lần lượt là chủng Y. pestis và B. anthracis gây bệnh. Trong khi đó, đáng chú ý trên Hình 3.36a, mẫu Ba6 chỉ xuất hiện 2 băng có kích thước tương ứng với 2 gen đích là pagA và vrrA, không xuất hiện băng chỉ thị gen capA. Đây là mẫu B. anthracis bị thiếu plasmid pXO2, không đầy đủ độc lực (chủng B. anthracis Ba6). Như vậy, trong 10 chủng phân lập B. anthracis, bằng kỹ thuật mPCR đã xác định được 3 chủng B. anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng giảm độc do thiếu gen capA thuộc plasmid pXO2 (chủng B. anthracis Ba6), 6 chủng còn lại là B. anthracis không độc. Đồng thời với Y. pestis, kỹ thuật mPCR đã xác định được 2/2 chủng Y. pestis có đầy đủ gen độc lực. Để khẳng định kết quả thử nghiệm của kỹ thuật mPCR, các băng điện di đặc hiệu cho các gen đích của B. anthracis và Y. pestis được cắt, tinh sạch và giải trình tự. Kết quả cho thấy, tất cả các trình tự đều thuộc các gen đặc trưng tương ứng của B. anthracis (pagA, capA, vrrA) và Y. pestis (pla, caf1, ypo2088) (Phụ lục 9). Như vậy, kỹ thuật mPCR đã được thử nghiệm thành công trên chủng chuẩn và chủng phân lập, cho phép xác định chính xác, đồng thời B. anthracis và Y. pestis. 3.2.2.3. Phân tích trình tự gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis Kỹ thuật mPCR được phát triển ở trên chứa 6 cặp mồi xác định các đoạn ngắn trình tự bảo thủ của gen đích tương ứng. Tuy nhiên, mỗi gen đích có chiều dài khác nhau và phân bố ở các vị trí khác nhau. Cụ thể, với B. anthracis, gen đặc trưng vrrA thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pagA, capA thuộc plasmid pXO1, pXO2. Với 85 Y. pestis, gen đặc trưng ypo2088 thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pla, caf1 thuộc plasmid pPCP1, pMT1. Để đánh giá kỹ thuật mPCR được phát triển, đồng thời nghiên cứu trình tự các gen đặc trưng và gen độc ở các chủng phân lập được ở Việt Nam có sự giống và khác nhau như thế nào với các chủng quốc tế, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự toàn bộ chiều dài gen độc lực và gen đặc trưng của B. anthracis và Y. pestis. Phân lập toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực Đối với B. anthracis, 7 gen gồm gen vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA, cya, lef (thuộc plasmid pXO1), capA, capB, capC (thuộc plasmid pXO2) của các chủng B. anthracis đã được nhân dòng cho xác định toàn bộ trình tự nucleotide. Gen vrrA được khuếch đại toàn bộ chiều dài của 10 chủng phân lập B. anthracis, sử dụng cặp mồi vrrAF/vrrAR (kích thước sản phẩm là 551 bp). Sáu gen trên plasmid độc lực gồm: pagA, cya, lef, capA, capB và capC được khuếch đại từ 3 chủng có đầy đủ độc lực là B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4. Các cặp mồi tạo dòng đã được trình bày chi tiết trong Bảng 2.2. Theo tính toán, nếu khuếch đại thành công toàn bộ chiều dài của 6 gen này, sản phẩm PCR có kích thước lần lượt là 2323, 2544, 2580, 1325, 1439 và 561 bp. Hình 3. 37. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của chủng B. anthracis Ba3 a) M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); vrrA. Sản phẩm tổng hợp gen vrrA; b) M. Marker 1 kb (Thermo Scientific); lef, cya, capC. Sản phẩm tổng hợp gen lef, cya, capC; c) M. Marker 1 kb (Thermo Scientific); pagA. Sản phẩm tổng hợp gen pagA. Kết quả khuếch đại gen đích cho thấy, sản phẩm PCR các gen tương ứng cho băng rõ ràng, không có băng phụ và kích thước đúng với tính toán lý thuyết (minh 86 họa trên Hình 3.37). Như vậy, các gen là vrrA, pagA, cya, lef, cap A, capB, capC đã được khuếch đại thành công với các cặp mồi thiết kế. Bước đầu có thể nhận định, 3 chủng vi khuẩn B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 là các chủng chứa đầy đủ các gen độc lực tiêu biểu pagA, cya, lef (plasmid pXO1), cap A, capB, capC (plasmid pXO2). Đối với Y. pestis, gen đích đặc trưng trên nhiễm sắc thể là ypo2088 và 2 gen trên plasmid pPCP1 và pMT1 tương ứng là pla và caf1 được phân tích trình tự. Kết quả phân lập cho thấy, các cặp mồi ypo2088F/R, plaF/R và cafF/R đã khuếch đại các gen tương ứng thành công, cho sản phẩm đặc hiệu có kích thước lần lượt là 645, 1019 và 654 bp đúng theo thiết kế (Hình 3.38). Hình 3. 38. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của Y. pestis M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); a) Yp1, Yp2. Sản phẩm tổng hợp gen ypo2088 chủng Y. pestis Yp1, Yp2; b) pla, caf1. Sản phẩm tổng hợp gen pla, caf1 chủng Y. pestis Yp1. Như vậy, từ kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại các gen đích đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis như trên chứng tỏ đã phân lập thành công 7 gen là vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB, capC của B. anthracis và 3 gen ypo2088, pla và caf1 của Y. pestis phân lập ở Việt Nam. Nghiên cứu tạo dòng toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực Quá trình tạo dòng ngoài ưu điểm cho phép phân tích trình tự gen đầy đủ mà còn giúp cho quá trình lưu giữ các gen quý hiếm tiện lợi hơn, phục vụ cho những nghiên cứu về sau. Sản phẩm PCR các gen đích vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB, capC của B. anthracis và ypo2088, pla và caf1 của Y. pestis có kí