Luận án Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối (Termitomyces sp.)

ờng MT3 và 25 ngày nuôi cấy. Khi phân tích tác động của từng nhân tố cho thấy, cả hai yếu tố môi trường và thời gian nuôi cấy đều có sự khác biêt rất có ý nghia, trong đó MT3 cho sinh khối cao nhất và thời gian ở 20, 25 ngày cho kết quả tốt nhất. Bên cạnh tác động riêng lẻ của từng nhân tố còn có sự tác động tương tác giữa môi trường nuôi cấy và thời gian nuôi cấy đến khối lượng khô của hê sợi nấm mối (Bảng 4.1). Bảng 4.1: Tác động của môi trường và thời gian nuôi cấy lên sinh khối của nấm mối Termitomyces clypeatus (g/l) Môi trường nuôi cấy Thời gian nuôi cấy (ngày) TB môi trường10 15 20 25 MT1 2,120 2,047 3,561 3,566 2,823c MT2 2,767 3,432 3,683 3,687 3,392b MT3 2,849 3,186 4,435 4,455 3,731a MT4 2,431 3,574 4,067 4,026 3,524b TB thời gian 2,541c 3,060 b 3,937a 3,934a Nhân tố F P CV Môi trường (MT) 54,80 0,000 5,34 Thời gian (TG) 171,75 0,000 MT x TG 9,20 0,000 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%. Nhân tố thời gian nuôi cấy tác động lớn đến khối lượng khô hê sợi của nấm. Trong các khoảng thời gian được chọn thực nghiêm thì thời gian 20 ngày nuôi cấy là thích hợp nhất cho sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối (Bảng 4.1). Hình 4.18 cho thấy, nấm mối có khả năng sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy khác nhau. Khối lượng khô của hê sợi nấm sau 10 đến 25 ngày nuôi cấy tính từ ngày chủng giống dao động từ 2,05 g ở nghiêm thức sử dụng môi trường MT1 và 20 ngày nuôi cấy đến 4,45 g ở nghiêm thức sử dụng môi trường MT3 và 25 ngày nuôi cấy. Trong khoảng thời gian nuôi cấy 10 đến 15 ngày thì hê sợi của nấm mối phát triển chậm, đây là giai đoạn cho viêc thu sinh khối nấm. Mặt khác, khi thời gian nuôi cấy tăng lên 25 ngày thì sinh khối hê sợi nấm cũng tăng trưởng nhưng bắt đầu chậm lại, sự gia tăng sinh khối này không có ý nghia về mặt thống kê. Do vậy, giai đoạn này viêc duy trì thời gian nuôi cấy làm tốn nhiều công sức, năng lượng, thời gian cũng như giảm chất lượng sản phẩm. So với nghiên cứu của 71 Chen và Yin (2002) trong nuôi cấy chìm tạo sinh khối nấm mối T. eurrhizus thì hê sợi nấm mối T. clypeatus tăng trưởng chậm trong thời gian dài hơn. Môi trường MT3 thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm hơn so với các môi trường MT1, MT2 và MT4. Khối lượng khô hê sợi nấm trong các nghiêm thức sử dụng môi trường MT1, MT2, MT4 phần lớn thấp hơn các nghiêm thức còn lại. Môi trường cho khối lượng khô hê sợi cao nhất là MT3 kết hợp với 20 và 25 nuôi cấy (khối lượng đạt 4,43 g và 4,46 g), MT4 kết hợp với 20 và 25 ngày nuôi cấy (khối lượng đạt 4,07 g và 4,03 g). Kết quả này cho thấy các môi trường nghiên cứu thích hợp cho sản xuất sinh khối hê sợi nấm mối. Tuy nhiên, với mục đích kinh tế thì môi trường MT3 kết hợp với 20 ngày nuôi cấy là thích hợp để sản xuất sinh khối hê sợi nấm mối T. clypeatus. Hình 4.18: Tác động của các môi trường nuôi cấy và thời gian nuôi cấy lên khối lượng khô hê sợi nấm mối T. clypeatus Ghi chú: Số liêu trên mỗi cột là trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%; thanh error bar thể hiên sự biến động bằng giá trị SD. 4.2.2 Tối ưu hóa hàm lượng các chất chủ yếu ảnh hưởng đến sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 4.2.2.1 Tác động của nồng độ glucose lên sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối Từ kết quả thí nghiêm cho thấy nấm mối có khả năng sinh trưởng trên môi trường MT3. Khối lượng khô hê sợi nấm mối trong thí nghiêm đạt từ 2,37g – 4,75 g. Giữa các nông độ glucose bố trí trong thí nghiêm, khối lượng khô hê sợi thu được trong môi trường bổ sung 6% glucose là cao nhất (4,75 g/L) và khác biêt thống kê ở mức ý nghia 5% so với các nông độ glucose còn lại. Môi trường bổ sung thêm 2% glucose cho khối lượng khô sinh khối hê sợi thấp nhất (2,37 g/L) (Hình 4.19). 72 Hình 4.19: Tác động của các nông độ glucose đến khối lượng khô hê sợi nấm mối T. clypeatus Ghi chú: Số liêu trên mỗi cột là trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%(Cv = 5,91%); thanh error bar thể hiên sự biến động bằng giá trị SD. 4.2.2.2 Tác động của nồng độ pepton lên sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối Môi trường nuôi cấy có bổ sung nguôn pepton ảnh hưởng lên sự sinh trưởng hê sợi nấm mối. Môi trường nuôi cấy có bổ sung nguôn pepton ở nông độ 0,4% thích hợp cho viêc sinh trưởng của hê sợi nấm và sinh khối khô đạt cao nhất (4,22 g/L) nhưng không khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5% so với sinh khối hê sợi nấm được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nguôn pepton có nông độ 6% (4,03 g/L). Hê sợi nấm mối sinh trưởng chậm nhất trong môi trường có bổ sung pepton có nông độ 0,2% (2,36 g/L) thấp hơn khoảng 0,6 lần so với môi trường có bổ sung pepton cho sinh khối hê sợi cao nhất (Hình 4.20). 73 Hình 4.20: Tác động của các nông độ pepton đến khối lượng khô hê sợi nấm T. clypeatus Ghi chú: Số liêu trên mỗi cột là trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%(Cv = 7,68%); thanh error bar thể hiên sự biến động bằng giá trị SD. 4.2.2.3 Tác động của nồng độ KH2PO4 lên sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối Sản lượng sinh khối hê sợi nấm mối chịu tác động khác nhau trong môi trường nuôi cấy có bổ sung khoáng ở các nông độ khác nhau. Khoáng KH2PO4 cung cấp nguôn P cho nấm ở dạng PO43-, là một nguyên tố đa lượng rất cần thiết cho sự phát triển của nấm và cần được cung cấp một lượng vừa đủ vào môi trường nuôi cấy. Hê sợi nấm sinh trưởng đa dạng ở các nông độ khoáng khác nhau. Sinh khối hê sợi đạt cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung khoáng KH2PO4 có nông độ 0,15% (4,47 g/L) và có khác biêt về mặt thống kê ở mức có ý nghia 5% so với các nghiêm thức còn lại. Hê sợi sinh trưởng và phát triển chậm khi được nuôi trong môi trường có bổ sung khoáng 0,05% (2,28 g/L) (Hình 4.21). 74 Hình 4.21: Tác động của các nông độ KH2PO4 đến khối lượng khô hê sợi nấm T. clypeatus Ghi chú: Số liêu trên mỗi cột là trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%(Cv = 8,01%); thanh error bar thể hiên sự biến động bằng giá trị SD. 4.2.2.4 Tác động tổng hợp của các nhân tố nồng độ glucose, nồng độ pepton và nồng độ KH2PO4 lên sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối Nhằm đánh giá được tác động tổng hợp của cả 3 nhân tố: nông độ glucose (X1), nông độ pepton (X2) và nông độ khoáng KH2PO4 (X3) lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối, mỗi nhân tố được lựa chọn ba mức độ để bố trí thí nghiêm. Các giá trị này được lựa chọn dựa trên kết quả của 3 thí nghiêm sơ bộ và được trình bày trong Bảng 4.2. Bảng 4.2: Các nông độ glucose, nông độ pepton và nông độ khoáng KH2PO4 có tác động lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối được lựa chọn Nhân tố Ký hiêu Giá trị chưa mã hóa Giá trị mã hóa Nông độ glucose (g/L) X1 40 60 80 -1 0 1 Nông độ pepton (g/L) X2 2 4 6 -1 0 1 Nông độ khoáng KH2PO4 (g/L) X3 1 1,5 2 -1 0 1 Từ các giá trị được lựa chọn này, phương pháp bề mặt đáp ứng được áp dụng với kiểu bố trí thí nghiêm Box-Behnken. Kết quả thí nghiêm được trình bày trong Bảng 4.3. Sản lượng sinh khối hê sợi thấp nhất là 4,22 g/L và cao nhất là 5,85 g/L. 75 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nông độ glucose, nông độ pepton và nông độ khoáng KH2PO4 lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối Ghi chú: Giá trị khối lượng khô sinh khối trình bày trong bảng là trung bình của 3 lần lặp. Bảng 4.4 cho thấy, về tác động riêng lẻ của mỗi nhân tố, 3 nhân tố nông độ glucose, pepton và nông độ khoáng KH2PO4 đều có ảnh hưởng đến sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối (giá trị PX1, PX2 và PX3 nhỏ hơn 0,05). Trong 2 nhân tố có sự tác động, nhân tố nông độ glucose có ảnh hưởng lớn hơn hai nhân tố còn lại với giá trị hê số của phương trình hôi quy cao hơn (CoefX1 = 0,40 > CoefX3 = 0,19> CoefX2 = 0,14). Như vậy, sự thay đổi nông độ glucose sẽ có ảnh hưởng nhiều hơn lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối so với sự thay đổi về nông độ pepton và sự thay đổi nông độ khoáng KH2PO4. Chưa mã hóa Mã hóa Sinh khối (g/l)TT Nông độ glucose Nông độ Pepton Nông độ KH2PO4 X1 X2 X3 1 40 2 1,5 -1 -1 0 4,46 2 80 2 1,5 1 -1 0 4,86 3 40 6 1,5 -1 1 0 4,22 4 80 6 1,5 1 1 0 5,29 5 40 4 1,0 -1 0 -1 4,45 6 80 4 1,0 1 0 -1 4,69 7 40 4 2,0 -1 0 1 4,37 8 80 4 2,0 1 0 1 5,35 9 60 2 1,0 0 -1 -1 5,38 10 60 6 1,0 0 1 -1 5,65 11 60 2 2,0 0 -1 1 5,27 12 60 6 2,0 0 1 1 5,23 13 60 4 1,5 0 0 0 5,85 14 60 4 1,5 0 0 0 5,79 15 60 4 1,5 0 0 0 5,72 76 Bảng 4.4: Kết quả phân tích hôi quy và ANOVA của sản lượng sinh khối khô của hê sợi nấm Termitomyces clypeatus Nguôn Hê số hôi quy (Coef) P (Phân tích ANOVA) X1 0,40250 0,000 X2 0,14958 0,000 X3 0,19292 0,000 X1 x X1 -0,85167 0,000 X2 x X2 -0,09750 0,043 X3 x X3 -0,09083 0,058 X1 x X2 0,19583 0,000 X2 x X3 0,23250 0,000 X1 x X3 -0,05500 0,125 Về tác động tổng hợp giữa các cặp nhân tố, có hai cặp nông độ glucose với pepton và nông độ pepton với nông độ khoáng có sự tương tác qua lại và sự tương tác này có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng như phát triển của hê sợi nấm mối. Điều này được chứng minh qua giá trị PX1*X2 và PX2*X3 nhỏ hơn 0,05 và giá trị trị tuyêt đối của hê số hôi quy lần lượt là 0,19 và 0,23 lớn hơn giá trị tuyêt đối của hê số hôi quy cặp nhân tố còn lại (Bảng 4.4). Từ biểu đô mặt đáp ứng của 2 nhân tố: nông độ glucose và nông độ pepton cho thấy vùng cho sản lượng sinh khối cao nhất (trên 5,75 g/L) tương ứng với khoảng nông độ glucose từ 56,3 g/L đến 77,5 g/L và nông độ pepton trong khoảng 3 g/L đến 6 g/L (Hình 4.22). 4,5 5,0 5,5 4 6 6,0 0,6 0,4 0,2 8 Sản lượng sinh khối Nồng độ pepton Nồng độ glucose Nồng độ khoáng KH2PO4 0,15 Hold Values Surface Plot of Sản lượng sinh khối vs Nồng độ pepton. Nồng độ glucose Nồng độ glucose Nồ ng đ ộ pe pt on 87654 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Nồng độ khoáng KH2PO4 0,15 Hold Values > – – – – – < 4,50 4,50 4,75 4,75 5,00 5,00 5,25 5,25 5,50 5,50 5,75 5,75 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh khối vs Nồng độ pepton. Nồng độ glucose Nồng độ glucose Nồ ng đ ộ pe pt on 87654 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Nồng độ khoáng KH2PO4 0,15 Hold Values > – – – – – < 4,50 4,50 4,75 4,75 5,00 5,00 5,25 5,25 5,50 5,50 5,75 5,75 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh khối vs Nồng độ pepton. Nồng độ glucose Nồng độ glucose Nồ ng đ ộ pe pt on 87654 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Nồng độ khoáng KH2PO4 0,15 Hold Values > – – – – – < 4,50 4,50 4,75 4,75 5,00 5,00 5,25 5,25 5,50 5,50 5,75 5,75 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh khối vs Nồng độ pepton. Nồng độ glucose Hình 4.22: Tác động của nhân tố nông độ glucose và nông độ pepton lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nông độ khoáng là 1,5 g/L (A. Biểu đô bề mặt đáp ứng; B. Biểu đô chu tuyến) Từ biểu đô mặt đáp ứng của 2 nhân tố: nông độ glucose và nông độ khoáng cho thấy vùng có sự tích lũy sinh khối hê sợi trên 6 g/L tương ứng với khoảng A B (g/L) (g/L) 77 nông độ glucose 62,6 g/L đến 72,3 g/L và nông độ khoáng khoảng 1,8 g/L đến 2 g/L (Hình 4.23). 4,5 5,0 5,5 6 4 6,0 0,20 0,15 0,10 8 Sản lượng sinh khối Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ glucose Nồng độ pepton 0,4 Hold Values Surface Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ glucose Nồng độ glucose Nồ ng đ ộ kh oá ng K H 2P O 4 87654 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 Nồng độ pepton 0,4 Hold Values > – – – – – – < 4,50 4,50 4,75 4,75 5,00 5,00 5,25 5,25 5,50 5,50 5,75 5,75 6,00 6,00 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ glucose Nồng độ glucose Nồ ng đ ộ kh oá ng K H 2P O 4 87654 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 Nồng độ pepton 0,4 Hold Values > – – – – – – < 4,50 4,50 4,75 4,75 5,00 5,00 5,25 5,25 5,50 5,50 5,75 5,75 6,00 6,00 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ glucose Nồng độ glucose Nồ ng đ ộ kh oá ng K H 2P O 4 87654 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 Nồng độ pepton 0,4 Hold Values > – – – – – – < 4,50 4,50 4,75 4,75 5,00 5,00 5,25 5,25 5,50 5,50 5,75 5,75 6,00 6,00 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ glucose Hình 4.23: Tác động của nhân tố nông độ glucose và nông độ khoáng lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nông độ pepton là 0,4% (A. Biểu đô bề mặt đáp ứng; B. Biểu đô chu tuyến) Từ biểu đô bề mặt đáp ứng của 2 nhân tố: nông độ pepton và khoáng cho thấy vùng có sản lượng sinh khối cao nhất (trên 5,9 g/L) tương ứng với khoảng nông độ khoáng là 1,6 g/L đến 2 g/L và nông độ pepton trong khoảng 3,5 g/L đến 6 g/L (Hình 4.24). 5,2 5,4 5,6 0,2 0,4 5,8 0,20 0,15 0,10 0,6 Sản lượng sinh khối Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ pepton Nồng độ glucose 6 Hold Values Surface Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ pepton Nồng độ pepton Nồ ng đ ộ kh oá ng K H 2P O 4 0,60,50,40,30,2 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 Nồng độ glucose 6 Hold Values > – – – – – – < 5,3 5,3 5,4 5,4 5,5 5,5 5,6 5,6 5,7 5,7 5,8 5,8 5,9 5,9 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ pepton Nồng độ pepton Nồ ng đ ộ kh oá ng K H 2P O 4 0,60,50,40,30,2 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 Nồng độ glucose 6 Hold Values > – – – – – – < 5,3 5,3 5,4 5,4 5,5 5,5 5,6 5,6 5,7 5,7 5,8 5,8 5,9 5,9 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ pepton Nồng độ pepton Nồ ng đ ộ kh oá ng K H 2P O 4 0,60,50,40,30,2 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 Nồng độ glucose 6 Hold Values > – – – – – – < 5,3 5,3 5,4 5,4 5,5 5,5 5,6 5,6 5,7 5,7 5,8 5,8 5,9 5,9 sinh khối Sản lượng Contour Plot of Sản lượng sinh k vs Nồng độ khoáng K. Nồng độ pepton Hình 4.24: Tác động của nhân tố nông độ khoáng và nông độ pepton lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nông độ glucose là 6% (A. Biểu đô bề mặt đáp ứng; B. Biểu đô chu tuyến) Từ các hê số hôi quy (Bảng 4.4), phương trình hôi quy được viết như sau: Sản lượng sinh khối: Y (g/L) = 5,82 + 0,4*X1+0,15*X2+0,19*X3 - 0,85*X12 - 0,098*X22 + 0,19X1*X2 + 0,23X2*X3 Hê số R-Sq của phương trình hôi quy là 96,7% chứng tỏ phương trình có tính phù hợp cao với số liêu thực tế. Từ phương trình hôi quy có thể dự đoán được A B B A (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) 78 khối lượng khô sinh khối nấm mối tương ứng với giá trị của các nhân tố thí nghiêm với độ tin cậy trên 95%. Chức năng Response optimizer của Minitab lựa chọn được 3 giá trị tối ưu của các nhân tố về nông độ glucose, nông độ pepton và nông độ khoáng lần lượt là 69,9 g/L; 5,96 g/L và 2,0 g/L với khối lượng sinh khối khô của hê sợi nấm mối dự đoán là 6,128 g/L. Các giá trị này cùng với sinh khối khô hê sợi nấm mối dự đoán nằm trong khoảng tối ưu của các mặt đáp ứng trình bày ở trên. Giá trị sinh khối khô thực tế sau khi bố trí thí nghiêm với các giá trị tối ưu như trên là 5,923±0,124 g/L, thấp hơn so với dự đoán. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu như nuôi cấy chìm nấm Linh chi (Ganoderma lucidum CAU5501) của Yuan et al. (2012) khi tối ưu môi trường cho năng suất EPS là 70 g/L glucose, ty lê 5 C/N, 2,5 g/L KH2PO4, 0,75 g/L MgSO4.7H2O và môi trường cho sinh khối hê sợi nấm là 50 g/L glucose, ty lê 5 C/N, 1,5 g/L KH2PO4, 0,5 g/L MgSO4.7H2O thu được 7,235 g/L hay trong nghiên cứu nuôi cấy chìm Nấm Trà (Agrocybe cylindracea), thành phần môi trường cho sự phát triển của hê sợi nấm là maltose 80 g/L, Martone A-1 6 g/L; sản xuất EPS: maltose 60 g/L, Martone A-1 6 g/L, MgSO4.7H2O 0,9 g/L (Kim et al., 2005). 4.2.3 Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy chủ yếu ảnh hưởng tới sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 4.2.3.1 Tác động của pH ban đầu tới sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối Từ kết quả thí nghiêm cho thấy nấm mối có khả năng sinh trưởng trên môi trường có khoảng pH dao động khác nhau. Khối lượng khô của quả thể nấm sau nuôi cấy dao động từ 3,892 g ở nghiêm thức sử dụng môi trường pH 3,5 đến 5,652 g ở nghiêm thức sử dụng môi trường pH là 4,5 thấp hơn so với nghiêm thức cho sản lượng sinh khối cao nhất và có khác biêt về mặt thống kê ở mức có ý nghia 5%, hê sợi nấm được nuôi ở nghiêm thức có pH 3,5 và 5,5 cho sinh khối không khác biêt có ý nghia về mặt thống kê. Khi hê sợi nấm nuôi ở môi trường quá kiềm hoặc acid thì hê sợi nấm sinh trưởng chậm (Hình 4.25). 79 Hình 4.25: Tác động của pH ban đầu tới sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối Ghi chú: Số liêu trên mỗi cột là trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%, thanh error bar thể hiên sự biến động bằng giá trị SD. 4.2.3.2 Tác động của tốc độ lắc lên sự phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Tốc độ lắc ảnh hưởng đến độ thoáng của không khí cũng như khả năng cung cấp oxy cho sự sinh trưởng của nấm. Qua kết quả thí nghiêm cho thấy khi tốc độ lắc tăng thì sinh khối hê sợi nấm tăng theo, tuy nhiên khi tốc độ lắc quá cao thì khối lượng nấm lại giảm. Nguyên nhân có thể khi lắc mạnh sinh ra lượng bọt quá nhiều ảnh hưởng đến sự phát triển hê sợi và khi ở tốc độ lắc thích hợp thì hê sợi nấm được phát triển tối đa. Khi lắc ở tốc độ thích hợp 140 vòng/phút thì sinh khối là 5,823 g còn ở 180 vòng là 4,65 g. Ở tốc độ lắc 140 vòng/phút và 160 vòng/phút thì khác biêt không có ý nghia về mặt thống kê ở mức có nghia 5% (Hình 4.26). 80 Hình 4.26: Tác động của tốc độ lắc tới sự phát triển sinh khối hê sợi nấm mối Ghi chú: Số liêu trên mỗi cột là trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%; thanh error bar thể hiên sự biến động bằng giá trị SD). 4.2.3.3 Tác động của nhiệt độ lên sự phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Nấm mối có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nhiêt độ khác nhau, dao động từ 24 đến 32ºC. Sinh khối nấm có xu hướng sinh trưởng mạnh khi được nuôi cấy ở nhiêt độ từ 26 đến 30ºC, ở nhiêt độ 26 và 28ºC không khác biêt có ý nghia về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%. Sinh khối nấm thấp nhất khi nuôi ở nhiêt độ 24ºC là 4,63 g và cao nhất là 6,05 g khi nuôi ở nhiêt độ 28ºC cao hơn 23,5% so với hê sợi nấm được nuôi ở nhiêt độ cho sinh khối thấp nhất (Hình 4.27). Hình 4.27: Tác động của nhiêt độ tới sự phát triển sinh khối hê sợi nấm mối Ghi chú: Số liêu trên mỗi cột là trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị không cùng mẫu tự thì có sự khác biêt về mặt thống kê ở mức ý nghia 5%; thanh error bar thể hiên sự biến động bằng giá trị SD. 81 4.2.3.4 Tác động đồng thời của pH, tốc độ lắc và nhiệt độ tới sự phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Nhằm đánh giá được tác động tổng hợp của cả 3 nhân tố: pH (X1), tốc độ lắc (X2) và nhiêt độ (X3) lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối, mỗi nhân tố được lựa chọn ba mức độ để bố trí thí nghiêm. Các giá trị này được lựa chọn dựa trên kết quả của 3 thí nghiêm sơ bộ 3a, 3b, 3c và được trình bày trong Bảng 4.5. Bảng 4.5: Các pH, tốc độ lắc và nhiêt độ có tác động lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối được lựa chọn Nhân tố Ký hiêu Giá trị chưa mã hóa Giá trị mã hóa pH X1 4 4,5 5,5 -1 0 1 Tốc độ lắc X2 120 140 160 -1 0 1 Nhiêt độ X3 26 28 30 -1 0 1 Từ các giá trị được lựa chọn này, phương pháp bề mặt đáp ứng được áp dụng với kiểu bố trí thí nghiêm Box-Behnken. Kết quả thí nghiêm được trình bày trong Bảng 4.6. Sản lượng sinh khối hê sợi thấp nhất là 4,64 g/L và cao nhất là 6,37 g/L. Bảng 4.6: Ảnh hưởng của pH, tốc độ lắc và nhiêt độ lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối Ghi chú: Giá trị khối lượng khô sinh khối trình bày trong bảng là trung bình của 3 lần lặp. Chưa mã hóa Mã hóa Sinh khối (g/L) TT pH Tốc độ lắc Nhiêt độ X1 X2 X3 1 4,0 120 28 -1 -1 0 5,52 2 5,5 120 28 1 -1 0 5,29 3 4,0 160 28 -1 1 1 4,73 4 5,5 160 28 1 1 0 5,6 5 4,0 140 26 -1 0 -1 4,85 6 5,5 140 26 1 0 -1 4,64 7 4,0 140 30 -1 0 1 4,74 8 5,5 140 30 1 0 1 5,13 9 4,5 120 26 0 -1 -1 5,9 10 4,5 160 26 0 1 -1 5,22 11 4,5 120 30 0 -1 1 5,78 12 4,5 160 30 0 1 1 5,81 13 4,5 140 28 0 0 0 6,37 14 4,5 140 28 0 0 0 6,31 15 4,5 140 28 0 0 0 6,29 82 Qua Bảng 4.7 cho thấy, về tác động riêng lẻ của mỗi nhân tố, 3 nhân tố pH, tốc độ lắc và nhiêt độ đều có ảnh hưởng đến sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối (giá trị PX1, PX2 và PX3 nhỏ hơn 0,05). Trong 3 nhân tố có sự tác động, nhân tố nhiêt độ có ảnh hưởng lớn hơn hai nhân tố còn lại với giá trị hê số của phương trình hôi quy cao hơn (CoefX3 = 0,12 > CoefX1 = 0,1> CoefX2 = -0,09). Như vậy, sự thay đổi nhiêt độ sẽ có ảnh hưởng nhiều hơn lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối so với sự thay đổi về pH và sự thay đổi tốc độ lắc. Bảng 4.7: Kết quả phân tích hôi quy và ANOVA của sản lượng sinh khối khô của hê sợi nấm Termitomyces clypeatus Nguôn Hê số hôi quy (Coef) P (Phân tích ANOVA) X1 0,10250 0,000 X2 -0,09671 0,037 X3 0,12934 0,013 X1 x X1 -1,09359 0,000 X2 x X2 -0,10042 0,096 X3 x X3 -0,54542 0,000 X1 x X2 0,26724 0,029 X2 x X3 0,13855 0,029 X1 x X3 0,17750 0,013 Về tác động tổng hợp giữa các cặp nhân tố, có hai cặp pH với tốc độ lắc và pH với nhiêt độ có sự tương tác qua lại và sự tương tác này có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng như phát triển của hê sợi nấm mối. Điều này được chứng minh qua giá trị PX1*X2 và PX2*X3 nhỏ hơn 0,05 và giá trị trị tuyêt đối của hê số hôi quy lần lượt là 0,26 và 0,14 lớn hơn giá trị tuyêt đối của hê số hôi quy cặp nhân tố còn lại (Bảng 4.7). Từ biểu đô mặt đáp ứng của 2 nhân tố: nhiêt độ và tốc độ lắc cho thấy vùng cho sản lượng sinh khối cao nhất (trên 6,25 g/L) tương ứng với khoảng nhiêt độ từ 26,7ºC đến 29,1ºC và tốc độ lắc trong khoảng 120 đến 160 (Hình 4.28). 83 5,0 5,5 6,0 4,0 4,5 5,0 6,5 30 28 26 5,5 Sinh khối (g/l) Nhiệt độ pH Tốc độ lắc 140 Hold Values Surface Plot of Sinh khối (g/l) vs Nhiệt độ. pH Tốc độ lắc N h iệ t đ ộ 160150140130120 30 29 28 27 26 pH 4,75 Hold Values > – – – – < 5,50 5,50 5,75 5,75 6,00 6,00 6,25 6,25 6,50 6,50 (g/l) Sinh khối Contour Plot of Sinh khối (g/l) vs Nhiệt độ. Tốc độ lắc Hình 4.28: Tác động của nhân tố nhiêt độ và tốc độ lắc lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với pH 5,5 (A. Biểu đô bề mặt đáp ứng; B. Biểu đô chu tuyến) Từ biểu đô mặt đáp ứng của 2 nhân tố: nhiêt độ và pH cho thấy vùng có sự tích lũy sinh khối hê sợi trên 6,4 g/L tương ứng với khoảng pH 4,47 đến 5 và nhiêt độ 27,3ºC đến 29ºC (Hình 4.29). pH N h iệ t đ ộ 5,45,25,04,84,64,44,24,0 30 29 28 27 26 Tốc độ lắc 140 Hold Values > – – – – < 4,8 4,8 5,2 5,2 5,6 5,6 6,0 6,0 6,4 6,4 (g/l) Sinh khối Contour Plot of Sinh khối (g/l) vs Nhiệt độ. pH Hình 4.29: Tác động của nhân tố nhiêt độ và pH lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với tốc độ lắc 140 vòng/phút (A. Biểu đô bề mặt đáp ứng; B. Biểu đô chu tuyến) Từ biểu đô bề mặt đáp ứng của 2 nhân tố: tốc độ lắc và pH cho thấy vùng có sản lượng sinh khối cao nhất (trên 6,25 g/L) tương ứng với khoảng tốc độ lắc là 120 vòng/phút đến 160 vòng/phút và pH trong khoảng 4,35 đến 5,02 (Hình 4.30). A B (ºC) (ºC) 84 5,0 5,5 6,0 4,0 4,5 5,0 6,5 165 150 135 120 5,5 Sinh khối (g/l) T ốc độ lắc pH Nhiệt độ 28 Hold Values Surface Plot of Sinh khối (g/l) vs Tốc độ lắc. pH pH Tố c đ ộ lắ c 5,45,25,04,84,64,44,24,0 160 150 140 130 120 Nhiệt độ 28 Hold Values > – – – – – – < 5,00 5,00 5,25 5,25 5,50 5,50 5,75 5,75 6,00 6,00 6,25 6,25 6,50 6,50 (g/l) Sinh khối Contour Plot of Sinh khối (g/l) vs Tốc độ lắc. pH Hình 4.30: Tác động của nhân tố tốc độ lắc và pH lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nhiêt độ 28ºC (A. Biểu đô bề mặt đáp ứng; B. Biểu đô chu tuyến) Từ các hê số hôi quy (Bảng 4.7), phương trình hôi quy được viết như sau: Sản lượng sinh khối: Y (g/L) = 5,97 + 0,1*X1 – 0,1*X2+0,12*X3 – 1,09*X12 – 0,55*X32 + 0,27X1*X2 + 0,14X2*X3 + 0,18X1*X3 Hê số R-Sq của phương trình hôi quy là 97,49% chứng tỏ phương trình có tính phù hợp cao với số liêu thực tế. Từ phương trình hôi quy có thể dự đoán được khối lượng khô sinh khối nấm mối tương ứng với giá trị của các nhân tố thí nghiêm với độ tin cậy trên 95%. Chức năng Response optimizer của Minitab lựa chọn được 3 giá trị tối ưu của các nhân tố về nhiêt độ, pH và tốc độ lắc lần lượt là 28,1ºC; 4,75 và 131,3 với khối lượng sinh khối khô của hê sợi nấm mối dự đoán là 6,503 g/L. Các giá trị này cùng với sinh khối khô hê sợi nấm mối dự đoán nằm trong khoảng tối ưu của các mặt đáp ứng trình bày ở trên. Giá trị sinh khối khô thực tế sau khi bố trí thí nghiêm với các giá trị tối ưu như trên là 6,231±0,213 g/L, thấp hơn so với dự đoán. 4.2.4 Tác động của tỷ lệ cấp giống và chế độ sục khí tới sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối Kết q