Luận án Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh họ

rên diện hẹp 3.1.1.1. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn Các đặc điểm sinh trưởng, phát triển của giống gốc có mối liên quan chặt chẽ đến đặc tính di truyền của giống. Việc nghiên cứu đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể nấm nhằm đánh giá được ưu thế tính trạng bên ngoài của giống, làm cơ sở để đánh giá tính thích nghi của giống với điều kiện khí hậu của khu vực nghiên cứu. Trong đó các chỉ tiêu về mầu sắc, hình thái quả thể, đường kính quả thể... là những chỉ tiêu có ý nghĩa quan trọng trong công tác tuyển chọn giống, là cơ sở cho việc phân loại cũng như tuyển chọn được nguồn giống cho năng suất, chất lượng cao phù hợp với điều kiện canh tác của từng vùng sinh thái khác nhau. Tiến hành nhân giống và nuôi trồng khảo nghiệm bốn chủng nấm Đầu khỉ được ký hiệu He1, He2, He3, He4 được lưu giữ tại Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp: Giống cấp 1 được nhân chuyển từ ống giống đang bảo quản lạnh sang môi trường PGA, sau khi hệ sợi mọc kín ống thạch chọn những ống giống có hệ sợi phát triển khỏe, không nhiễm bệnh để cấy chuyển sang môi trường thóc hạt (giống cấp 2). Giống cấp 2 được dùng để cấy chuyển sang cơ chất nuôi trồng nấm; Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm được tiến hành trên công thức môi trường CTNT 1 trình bày trong bảng 2.5; Nuôi sợi trong điều kiện nhiệt độ thích hợp 22 – 25oC và cho ra quả thể điều kiện nhiệt độ 16 – 20oC theo như điều kiện nuôi trồng nấm Đầu khỉ của các tác giả Nguyễn Lân Dũng (2001), Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh (2000), Lê Xuân Thám (2004); Theo dõi đánh giá một số đặc trưng hình thái hệ sợi nấm trên môi trường thạch PGA; đặc trưng hình thái quả thể nấm khi trưởng thành. Kết quả được ghi nhận chi tiết trong bảng 3.1 dưới đây; Bảng 3.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể của các giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus khảo nghiệm trên môi trường PGA và CTNT 1 STT Giống Đặc điểm hệ sợi nấm Đặc điểm quả thể 1 He1 Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng muốt đồng nhất, mật độ sợi dày. Khi trưởng thành hệ sợi bện kết lại tạo các mụn gai trên bề mặt môi trường nuôi cấy, khi già chuyển màu vàng rồi vàng nâu. Quả thể nấm có màu trắng muốt, cân đối, gồm các múi thịt nấm ghép lại với nhau đường kính quả thể 5-10 x 5-7cm, hình dạng giống như bộ óc Khỉ. Trọng lượng trung bình đạt 150-170 g/ quả. Phần thịt nấm chắc, đặc. 2 He2 Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng muốt đồng nhất, mật độ sợi thưa, loang lổ. Khi trưởng thành hệ sợi chuyển màu trắng ngà, sợi nấm to, thô, phân nhánh dày, khi già chuyển màu vàng nâu, sớm xuất hiện quả thể trên môi trường nuôi cấy thuần khiết. Quả thể nấm có màu trắng ngà, đường kính quả thể 5 - 7 x 4-7cm. Tua gai dài; quả thể rất xốp, nhẹ, trọng lượng trung bình đạt 90-100 g/quả. 3 He3 Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng, mật độ sợi phân bố không đều. Khi trưởng thành hệ sợi chuyển màu trắng đậm, xuất hiện mụn gai, hệ sợi sần sùi, xuất hiện quả thể ngay khi sợi chưa ăn kín ống thạch. Quả thể nấm có màu vàng nhạt, đường kính quả thể 5-10 x 5-7cm. Quả thể rất xốp, nhẹ, tua nấm dài, năng suất thấp. Trọng lượng trung bình đạt 60-80g/ quả. 4 He4 Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng muốt đồng nhất, mật độ sợi dày. Khi trưởng thành hệ sợi bện kết lại tạo các mụn gai trên bề mặt môi trường nuôi cấy, khi già chuyển màu vàng rồi vàng nâu. Quả thể nấm có màu vàng lông gà non, gồm các múi thịt nấm ghép lại với nhau đường kính quả thể 7-10 x 4-7cm. Mỗi quả nấm tươi nặng trung bình 100-140g. Phần thịt nấm mềm, xốp, tua nấm ngắn. CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 56 Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm và đánh giá đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể nấm cho thấy: bốn giống Đầu khỉ nghiên cứu đều có đặc điểm hình thái hệ sợi nấm trên môi trường PGA tương tự nhau xong có sự khác biệt về mầu sắc hệ sợi, đặc biệt là có sự chênh lệch về thời gian hình thành mầm quả thể trên môi trường thạch PGA; trong đó hai giống He2 và He3 thấy có sự xuất hiện mầm quả thể trên môi trường thuần khiết sớm hơn so với hai giống còn lại; đây là đặc điểm không có lợi của giống do trong quá trình nhân giống các cấp nhà chọn giống không mong muốn sử dụng giống tạo quả thể trên môi trường nhân giống các cấp. Quá trình tạo mầm quả thể sẽ làm suy yếu giống, giảm khả năng nhân giống các cấp, giảm khả năng lưu giữ giống. Trong nghiên cứu của tác giả Burkhard Kirchhoff (1996) khi nghiên cứu nuôi trồng 15 giống nấm nấm Đầu khỉ có nguồn gốc khác nhau cũng ghi nhận sự hình thành mầm quả thể trên môi trường thạch thuần khiết của một số giống nghiên cứu và điều này cũng gây bất lợi trong quá trình nhân giống các cấp. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm hình thái quả thể nấm giữa 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu, trong đó sự khác biệt lớn nhất là mầu sắc quả thể, độ phân thùy của quả thể, độ dài của tua nấm, độ chắc của quả thể nấm và trọng lượng trung bình của quả thể nấm. Đường kính trung bình của quả thể cũng có thể hiện sự khác biệt giữa bốn giống nghiên cứu nhưng không nhiều. Như vậy kết quả ở bảng 3.1 cho thấy trong 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu thì giống Đầu khỉ ký hiệu He1 có ưu điểm vượt trội hơn so với 3 giống còn lại do có khả năng hình thành quả thể đồng loạt, mầu sắc, hình thái quả thể đẹp, trọng lượng trung bình cao, đạt 150-170g/ quả; chất lượng đồng đều. 3.1.1.2. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm. Để tuyển chọn được giống nấm chất lượng tốt, phù hợp với điều kiện sản xuất thì tiêu chí về thời gian sinh trưởng và phát triển của hệ sợi, thời gian hình thành và phát triển quả thể cũng là tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng giống vì tổng thời của một chu kỳ sinh trưởng của nấm chính là tiêu chí chi phối kế hoạch sản xuất, số thời vụ nuôi trồng trong 1 năm, khấu hao nhà xưởng, năng lượng... qua đó cũng ảnh hưởng ít nhiều tới chi phí sản xuất. Thời gian sinh trưởng của nấm có mối liên quan chặt chẽ với điều kiện nuôi trồng và chế độ dinh dưỡng; Qua quá trình nuôi trồng khảo nghiệm, song song với việc đánh giá các đặc trừng về hình thái của 4 chủng giống nghiên cứu, NCS cũng ghi nhận được các số liệu về thời gian sinh trưởng, phát triển của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu; kết quả được trình bầy ở bảng 3.2; CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 57 Bảng 3.2: Thời gian sinh trưởng, phát triển của các giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm (đơn vị tính: ngày) Thời điểm Giống 1 2 3 4 5 6 He1 14 - 16 29 - 32 5-7 13-15 14-15 56-62 He2 13 - 17 25 - 30 5 -7 11-15 10-15 46-60 He3 19 - 21 32 - 37 7 -10 13-18 15-20 63-75 He4 18 - 22 32- 37 8 -10 13-18 14-17 59-72 * Ghi chú Thời điểm 1 Thời gian sợi mọc kín 50% bịch (ngày) Thời điểm 2 Thời gian sợi mọc kín 100% bịch (ngày) Thời điểm 3 Thời gian từ khi nới nút bông đến xuất hiện mầm quả thể (ngày) Thời điểm 4 Thời gian từ khi nới nút bông đến thu hái đợt 1(ngày) Thời điểm 5 Từ thu hái đợt 1 đến thu hái đợt 2 (ngày) Thời điểm 6 Tổng thời gian từ khi cấy giống đến khi kết thúc thu hái quả thể (ngày) Từ kết quả trong bảng 3.2 trên cho thấy thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu trong cùng một điều kiện nuôi trồng có sự khác biệt, trong đó He2 có tổng thời gian sinh trưởng ngắn nhất là 46 – 60 ngày, tiếp theo là He1 là 56 – 62 ngày, He4 là 59 - 72 ngày, He3 là 63 – 65 ngày. Trong nghiên cứu của tác giả Burkhard Kirchhoff (1996) cũng ghi nhận sự khác biệt về thời gian sinh trưởng của 15 giống Đầu khỉ nghiên cứu, trong đó sự chênh lên lớn nhất là 8 ngày cho tổng chu kỳ nuôi trồng. 3.1.1.3. Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu. Từ thực tế sản xuất cho thấy nhiều giống nấm có các đặc điểm sinh trưởng tốt; năng suất, chất lượng cao nhưng khả năng chống chịu sâu bệnh kém thì cũng rất khó được chấp nhận để đưa vào sản xuất trên qui mô lớn; Việc điều tra đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại chính của từng giống nấm Đầu khỉ là rất cần thiết và được tiến hành song song với các chỉ tiêu đánh giá chất lượng, thời gian nuôi trồng trong suốt quá trình khảo nghiệm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3: Thành phần và mức độ sâu bệnh hại trên bốn giống nấm Đầu khỉ Bệnh Giống Nhiễm mốc xanh Bệnh teo quả Bệnh thối nhũn quả Bệnh do côn trùng He1 + * + + He2 +++ ** +++ + He3 +++ ** ++ + He4 ++ * + + Ghi chú: - Không bị bệnh + Mức độ nhẹ: dưới 5% * Mức độ nhẹ: dưới 5% ++ Mức độ trung bình: 6 – 12% ** Mức độ trung bình: 10% +++ Mức độ nặng: trên 20% CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 58 Một số biểu hiện nhiễm bệnh phổ biến trong quá trình nuôi sợi và ra quả thể nấm Đầu khỉ được thể hiện trong hình 3.1 dưới đây; a. Nhiễm mốc xanh b. Nhiễm mốc vàng hoa cau c. Nhiễm sợi dại d. Bệnh mốc xanh, teo quả e. Bệnh thối nhũn quả thể f. Bệnh do côn trùng Hình 3.1: Một số sâu bệnh hại trên nấm Đầu khỉ trong giai đoạn ươm sợi và ra quả thể Qua kết quả nghiên cứu, đánh giá một số thành phần sâu bệnh hại chính trên các giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu thấy có 4 loại sâu bệnh hại phổ biến: bệnh nhiễm mốc, phát sinh chủ yếu khi nuôi sợi ở nhiệt độ cao kéo dài; Bệnh thối nhũn quả, xuất hiện khi độ ẩm không khí cao và nhiệt độ tăng đột ngột; Bệnh teo quả, xuất hiện khi trong thời gian chăm sóc ra quả thể có sự thay đổi nhiệt độ đột ngột kết hợp với độ ẩm không khí khô hanh kéo dài; Bệnh do côn trùng (ruồi, nhện), xuất hiện khi điều kiện phòng nuôi quá tối, độ thông thoáng trong phòng nuôi kém. Kết quả khảo nghiệm cho thấy trong cùng một một điều kiện nuôi trồng thì giống He1 có khả năng chống chịu với sâu bệnh hại tốt hơn so với các giống còn lại, xong trong quá trình nuôi trồng vẫn cần đảm bảo các khâu khử trùng nguyên liệu cũng như vệ sinh khu vực chăm sóc quả thể theo đúng kỹ thuật để hạn chế tối đa sự phát sinh bệnh. Thông qua kết quả khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ nhận thấy giống He1 so với 3 giống còn lại có các ưu điểm vượt trội hơn và rất phù hợp điều kiện nuôi trồng ở Việt Nam thể hiện ở các đặc điểm sau: + Khả năng quả thể đồng loạt, thời điểm thu hoạch tập trung; + Hình thái quả thể cân đối, đồng đều, năng suất cao; CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 59 + Khả năng thích nghi với điều kiện nuôi trồng tự nhiên tốt; + Khả năng chống chịu bệnh cao; Để khẳng định chất lượng nấm Đầu khỉ thương phẩm nuôi trồng từ giống He1, tiếp tục tiến hành phân tích một số thành phần dinh dưỡng và axit amin trong quả thể nấm thu được; Kết quả được trình bầy ở phần tiếp theo. 3.1.1.4. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ He1 Chủng nấm Đầu khỉ He1 được nuôi trồng trên nguồn cơ chất tổng hợp với thành phần chính là mùn cưa, bông hạt, lõi ngô nghiền, có bổ sung thêm các phụ gia bao gồm cám ngô, cám gạo, bột nhẹ; nuôi sợi và chăm sóc ra quả thể trong điều kiện thích hợp; thu hái quả thể đúng độ tuổi; quả thể được sấy khô ở nhiệt độ 45-60oC đến trọng lượng không đổi; Mẫu nấm Đầu khỉ tươi vừa hái và mẫu nấm đã sấy khô được đem đi phân tích một số thành phần dinh dưỡng chính, vitamin, axit amin tại Viện công nghệ thực phẩm; Kết quả thu được ghi ở bảng 3.4 sau; Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin cuả nấm Đầu khỉ He1 STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Nấm tƣơi Nấm khô tuyệt đối 1 Hàm lượng nước tổng số % 56,40 - 2 Hàm lượng vật chất khô % 43,60 - 3 Hàm lượng Nito tổng số % 0,86 1,97 4 Hàm lượng Chất béo tổng số % 2,19 5,02 5 Hàm lượng Hydratcacbon % 11,37 26,08 6 Hàm lượng Canxi (Ca) % 0,035 0,08 7 Hàm lượng Phospho (P) % 0,28 0,64 8 Hàm lượng Sắt (Fe) mg/kg 15,99 36,67 9 Hàm lượng Vitamin C mg/100g 8,05 18,46 10 Hàm lượng Vitamin A mg/100g 0,01 0,02 11 Hàm lượng Vitamin B1 mg/100g 0,30 0,69 Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 cho thấy nấm có thành phần dinh dưỡng cân đối, với hàm lượng protein thô cao, chiếm 1,97% tổng trọng lượng khô, hàm lượng chất béo thực vật chiếm 5,02%. Trong phân tích của tác giả Mizuno, (1998) khi so sánh sản phẩm nấm Đầu khỉ ở Cát Lâm (Trung Quốc) và Nagano (Nhật Bản) cho thấy hàm lượng protein thô của hai mẫu này lần lượt là 29,3 mg/100g nấm khô và 27,67 mg/100g nấm khô; hàm lượng chất béo thô của hai mẫu lần lượt là 4,68 và 4,56 mg/100g nấm khô. Tác giả Khuất Hữu Trung, (2003) cũng đưa ra kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong quả thể nấm Đầu khỉ, trong đó hàm lượng protein thô là 19,94 mg/100g nấm khô, hàm lượng chất béo tổng số đạt 2,89 mg/100g nấm khô. Như vậy, CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 60 hàm lượng protein và hàm lượng chất béo tổng số của quả thể nấm Đầu khỉ He1 tương đương so với kết quả của các tác giả Khuất Hữu Trung và thấp hơn so với tác giả Mizuno đã công bố trước đó. Bên cạnh đó, trong kết quả phân tích mẫu nấm Đầu khỉ He1 cũng thể hiện rõ thành phần một số vitamin và khoáng chất với hàm lượng cao, cân đối. Song song với việc phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin cuả nấm Đầu khỉ He1, NCS đã phân tích cả hàm lượng các axit amim trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 để khẳng định chất lượng nấm Đầu khỉ được tuyển chọn, kết quả được trình bày trong bảng 3.5; Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần axit amin cuả nấm Đầu khỉ He1 STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả 1 Hàm lượng Aspartic acid mg/g 2,17 2 Hàm lượng Threonine mg/g 1,19 3 Hàm lượng Serine mg/g 0,72 4 Hàm lượng Glutamic acid mg/g 3,66 5 Hàm lượng Proline mg/g 1,02 6 Hàm lượng Glycine mg/g 0,98 7 Hàm lượng Alanine mg/g 1,54 8 Hàm lượng Valine mg/g 1,39 9 Hàm lượng Lysine mg/g 1,35 10 Hàm lượng Methionine mg/g 0,2 11 Hàm lượng Isoleucine mg/g 1,03 12 Hàm lượng Leucine mg/g 1,66 13 Hàm lượng Tyrosine mg/g 0,44 14 Hàm lượng Phenylalanine mg/g 0,78 15 Hàm lượng Histidine mg/g 0,98 16 Hàm lượng Agrinine mg/g 0,92 17 Hàm lượng Cystine mg/g 0,07 Kết quả phân tích cho thấy thành phần dinh dưỡng của nấm Đầu khỉ He1 có đầy đủ các axit amim với hàm lượng khá cao, trong đó đặc biệt là hàm lượng Lysine, Leucine, Isoleucine, Valine cao; Đây là những axit amin rất tốt đối với trẻ em, người cao tuổi mà cơ thể không tự tổng hợp được; Thành phần và hàm lượng các axit amim trong nấm Đầu khỉ He1 so với kết quả đã được một số tác giả công bố là tương đương nhau. Như vậy, qua quá trình khảo nghiệm, phân tích đánh giá chất lượng 4 giống nấm Đầu khỉ He1, He2, He3, He4, kết quả cho thấy giống He1 có hình thái quả thể đẹp, trọng CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 61 lượng quả thể cao, khả năng chống chịu sâu bệnh hại tốt, thành phần dinh dưỡng cân đối; NCS lựa chọn giống He1 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ. Phân lập giống là khâu quan trọng trong quá trình sản xuất giống nấm vì chất lượng giống gốc là một trong những yếu tố quyết định chất lượng các cấp giống tiếp theo, qua đó góp phần quyết định năng suất nấm thương phẩm, vì thế việc tiến hành phân lập, thuần hóa, sàng lọc và giám định giống trước khi đưa vào sản xuất là rất cần thiết để tạo nguồn giống có chất lượng ổn định, chủ động trong việc sản suất giống phục vụ sản xuất. 3.1.2.1. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ Trước khi tiến hành phân lập, thuần khiết lại chủng giống nấm Đầu khỉ, tiến hành nuôi trồng khảo nghiệm các chủng giống, quan sát đặc điểm chủng nấm, đặc điểm bào tử nấm dưới kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 15000 lần). Để thu được bào tử của nấm Đầu khỉ, tiến hành thu hái khi quả thể nấm đã chuyển sang giai đoạn trưởng thành 1-2 ngày; lúc này quả thể bắt đầu xốp hơn, nhẹ hơn, tua gai dài và mảnh hơn. Hái quả thể, đưa vào đĩa petri đã khử trùng, để trong box cấy vô trùng; sau khoảng 16 – 24 giờ sẽ thấy các vệt bào tử rơi xuống đĩa, để nguyên bào tử trong đĩa đậy nắp lại đem đi chụp ảnh bào tử; Kết quả được thể hiện trong hình 3.2 và 3.3 dưới đấy; Hình 3.2: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ He1 với mật độ dày đặc (độ phóng đại 15000 lần) Hình 3.3: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ He1dày đặc, đảm hình chuỳ mang 4 bào tử với các mụn gai trên bề mặt (độ phóng đại 15000 lần) CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 62 Chọn quả thể to, chắc, cân đối, không bị sâu bệnh; cắt bỏ gốc, sát trùng; tiến hành bằng 2 phương pháp phân lâp như đã mô tả; Phân lập xong nuôi chúng trong cùng một điều kiện thích hợp; Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6: Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết Chỉ tiêu Nuôi cấy từ bào tử Nuôi cấy mô nấm Thời gian nảy mầm 72 giờ 48 giờ Tỷ lệ nhiễm (%) 48/100 17/100 Đặc điểm hệ sợi trên môi trƣờng thạch thuần khiết - Hệ sợi mọc không đều, thô sợi, sợi có xu hướng bông xù lên rồi chùn lại. - Sức sống yếu. - Hệ sợi mọc đều, mảnh sợi, không thấy xuất hiện mô sẹo. - Hệ sợi phân nhánh đều. - Sợi nấm mọc sát mặt thạch - Sức sống khỏe, giống không bị lẫn tạp sợi lạ. a. Hệ sợi khi phân lập từ bào tử b. Hệ sợi khi phân lập từ mô nấm Hình 3.4: Hệ sợi nấm Đầu khỉ được phân lập từ bào tử và mô nấm Kết quả ở bảng 3.6 kết hợp với quan sát thực nghiệm cho thấy trong 2 phương pháp phân lập thì nấm Đầu khỉ phù hợp với phương pháp nuôi cấy mô quả thể vì bằng phương pháp nuôi cấy mô quả thể, hệ sợi nấm bung sợi nhanh hơn, sức sống khoẻ, tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy từ bào tử; Xong phương pháp phân lập từ mô nấm lại có nhược điểm là không bảo toàn được các đặc tính di truyền của giống gốc qua nhiều thế hệ nhân chuyển vì vậy để đảm bảo giống không bị thoái hóa, suy biến lựa chọn sử dụng kết hợp cả hai phương pháp để phân lập lại giống: + Trong sản xuất, để đáp ứng nhu cầu gấp rút và số lượng lớn, chất lượng giống đồng đều thì nên sử dụng phương pháp phân lập từ mô quả thể; + Song song với quá trình sản xuất, để đảm bảo lưu giữ được nguồn giống trong thời gian dài mà không bị suy biến cần tiến hành phân lập giống từ bào tử để bảo quản ở điều kiện lạnh sâu trong thời gian dài. CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 63 Trong khuân khổ luận án, phương pháp phân lập từ mô quả thể nấm được lựa chọn để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm xây dựng qui trình phân lập lại giống gốc. 3.1.2.2. Xác định thời điểm phân lập Lựa chọn đúng giai đoạn sinh trưởng của quả thể nấm để phân lập ảnh hưởng nhiều đến chất lượng giống gốc, thể hiện qua các tiêu chí như khả năng bung sợi, tốc độ mọc sợi, đặc điểm hệ sợi. Trong thí nghiệm này, sử dụng quả thể nấm ở 4 giai đoạn phát triển khác nhau nhằm tìm được chính xác thời điểm tốt nhất để phân lập giống gốc từ mô quả thể, các giai đoạn đó bao gồm: + Giai đoạn 1: Quả thể vừa nhú mầm trên bịch nguyên liệu nuôi trồng (sau 5 - 7 ngày kể từ khi rạch hoặc nới nút bông cho ra quả thê) + Giai đoạn 2: Quả thể nấm còn non (3 - 5 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể). + Giai đoạn 3: Quả thể nấm trưởng thành nhưng chưa phát sinh bào tử (7 - 9 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng). + Giai đoạn 4: Quả thể nấm chuyển sang giai đoạn già, phát sinh bào tử (11 - 13 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng) Quả thể nấm Đầu khỉ ở các giai đoạn phát triển khác nhau được thể hiện rõ hơn qua hình 3.5 dưới đây; a. Hình thành mầm quả thể b. Quả thể sau 2 ngày c. Quả thể sau 3 ngày d. Quả thể sau 5 ngày e. Quả thể sau 7 ngày f. Quả thể sau 9 ngày (giai đoạn trưởng thành đến tuổi thu hái) Hình 3.5: Các giai đoạn phát triển của quả thể nấm Đầu khỉ tính từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng. CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 64 Sau khi lựa chọn quả thể ở các giai đoạn phát triển khác nhau, tiến hành xử lý sơ bộ quả thể nấm, lấy phần mô nấm ở các mẫu nấm cấy vào môi trường PGA, nuôi sợi ở diều kiện thích hợp; theo dõi, đánh giá sự sinh trưởng của hệ sợi. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm đến chất lượng giống gốc trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm sử dụng để phân lập đến chất lượng giống gốc. Chỉ tiêu Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Giai đoạn 4 Tốc độ mọc sợi (mm/ngày) 0 0 5,10 3,70 Đặc điểm sợi Mô nấm teo dần, không thấy sợi nấm phát triển. Mô nấm có bung tạo hệ sợi sau 3 ngày cấy nhưng sợi nấm phát triển kém, mờ nhạt không nhìn rõ hệ sợi. - Hệ sợi dày, mượt. - Xuất hiện bào tử phấn. - Chậm xuất hiện quả thể trên bề mặt thạch. - Hệ sợi mờ, mảnh, khô sợi; - Không có bào tử phấn; - Xuất hiện quả thể sớm trên bề mặt thạch, quả thể sinh trưởng nhanh hơn hệ sợi. a. Hệ sợi phân lập từ quả thể đang ở giai đoạn 1,2 b. Hệ sợi phân lập từ quả thể đang ở giai đoạn 3 c. Hệ sợi phân lập từ quả thể đang ở giai đoạn 4 Hình 3.6: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết khi sử dụng quả thể phân lập ở các giai đoạn phát triển khác nhau, thời gian nuôi sợi 10 ngày Kết quả thí nghiệm cho thấy việc lựa chọn đúng thời điểm để phân lập hệ sợi từ quả thể bằng phương pháp nuôi cấy mô có ảnh hưởng lớn đến chất lượng giống nấm; Tốc độ sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ phân lập ở 4 giai đoạn quả thể phát triển khác nhau có sự khác biệt rõ rệt, trong đó hệ sợi được phân lập từ quả thể trong giai đoạn 7- 9 ngày tuổi có tốc độ sinh trưởng cao nhất. Khả năng bung sợi của mô quả thể nấm và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm phân lập từ quả thể ở các giai đoạn khác nhau rõ rệt; Ỏ giai đoạn 1, 2 hệ sợi nấm không phát triển, mô nấm bị teo dần sau 3-4 ngày cấy; Ở giai đoạn 4 chất lượng giống kém, sớm xuất hiện quả thể ngay trên môi trường nuôi cấy thuần khiết; Ở giai đoạn CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 65 3 chất lượng giống tốt, chậm xuất hiện quả thể, thấy xuất hiện nhiều bào tử phấn trên bề mặt thạch, đây là biểu hiện của giống Đầu khỉ có chất lượng cao. Do vậy, NCS lựa chọn quả thể ở giai đoạn trưởng thành 7-9 ngày tuổi để phân lập lại giống gốc. 3.1.2.3. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập giống nấm Đầu khỉ a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi giống gốc. Nguồn cacbon mà nấm lớn nói chung và nấm Đầu khỉ nói riêng có thể sử dụng được bao gồm rất nhiều loại như các loại đường, rượu, axít hữu cơ và các chất tan trong nước của chúng, các lipit, các hydroxit và một số chất vô cơ có cacbon. Trong thí nghiệm này, sử dụng môi trường MTĐC (môi trường Czapek) làm môi trường nền sau đó thay đổi các loại đường khác nhau với hàm lượng 20g/l để lựa chọn loại đường phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ; Tiến hành cấy mô nấm vào các công thức môi trường, nuôi trong cùng một điều kiện, quan sát ghi lại đặc điểm hệ sợi và tốc độ phát triển của hệ sợi trong suốt quá trình nuôi; Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.8; Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy khi không bổ sung đường vào MTĐC thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm Đầu khỉ chỉ đạt 3,0 mm/ngày; Khi bổ sung các loại đường Glucose, Fructose, Maltose, Saccarose thì tốc độ mọc của hệ sợi tăng đáng kể, tuỳ thuộc vào loại đường bổ sung mà tốc độ sinh trưởng của hệ sợi tăng ở mức độ khác nhau; Trong đó đường Glucose và Fructose cho tốc độ sinh trưởng của hệ sợi lớn nhất đạt 6,25 mm/ ngày, đồng thời đặc điểm hệ sợi tốt nhất, tiếp đến là Saccarose và Maltose. Khi bổ sung Lactose vào môi trường MTĐC thì không có lợi cho sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ, hệ sợi không phát triển được và teo dần sau 3-5 ngày nuôi. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đối với sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ TT Môi trƣờng Tốc độ mọc sợi (mm/ngày) Đặc điểm hệ sợi 1 MTĐC 3,0 Sợi rất mảnh, mờ gần như không nhìn rõ, sợi nấm phát triển kém. 2 MTĐC + Glucose 6,25 Hệ sợi nấm trắng mượt, đậm sợi, phát triển đều, đầu sợi nấm phân nhánh như lông tơ. 3 MTĐC + Fructose 6,25 Hệ sợi trắng mượt, đậm sợi, phát triển đều, đầu sợi nấm phân nhánh như lông tơ. 4 MTĐC + Maltose 4,75 Hệ sợi trắng, nhưng mờ, đậm không đều; tốc độ phát triển trung bình. 5 MTĐC + Lactose 0 Hệ sợi không phát triển, môi trường xung quanh mô nấm chuyển mầu đen sau 3 ngày nuôi. 6 MTĐC + Saccarose 4,92 Hệ sợi trắng đồng nhất, phát triển khá tốt. CV% 3,2 LSD0,05 0,242 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 66 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ cũng được tác giả Ahmed Imtiaj và cộng sự (2008) ghi nhận khi nghiên cứu sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các môi trường PDA, Czapek Dox, Hoppokins, Hennerberg, Lily, môi trường cơ bản với thành phần 0,5gam MgSO4; 0,5 gam KH2PO4; 1 gam K2HPO4, có thay đổi 10 nguồn cácbon khác nhau bao gồm: Dextrin, Fructose, Maltose, Glucose, Lactose, Galactose, Sorbitol, Sucrose, Xylose, Mannose; Kết quả được ghi nhận là ngoài Lactose thì các loại đường còn lại đều có ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu k