Luận án Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei pq6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf Ďược tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/b. Trong Ďó: a là khoảng cách từ Ďiểm xuất phát Ďến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm; b là khoảng cách từ Ďiểm xuất phát Ďến mức dung môi Ďo trên cùng Ďường Ďi của vết, tính bằng cm; Rf: Chỉ có giá trị từ 0 Ďến l. 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene Squalene Ďược phân tích bằng HPLC tại Viện Công nghệ Môi trường (Viện Hàn lâm KH và CNVN) với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 m), pha Ďộng là dung dịch acetonitrile : nước (9:1, v/v), tốc Ďộ dòng 250 57 µL/min. Sự nhận dạng squalene Ďược thực hiện bằng cách sử dụng Ďầu dò PDA Accella với khoảng quét 190-400 nm, bước sóng UV Ďặt ở 198 nm và thời gian lưu của mẫu có chứa squalene Ďược so sánh với thời gian lưu của squalene chuẩn. Hàm lượng squalene trong mẫu Ďược xác Ďịnh dựa trên Ďường chuẩn về mối tương quan giữa nồng Ďộ của squalene chuẩn với diện tích peak tương ứng. Độ tinh sạch của squalene Ďược tính dựa trên phần trăm diện tích peak so với squalene chuẩn có Ďộ tinh sạch Ďã Ďược biết [94]. 2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene Cấu trúc squalene Ďược xác Ďịnh bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng máy Bruker Avance - 500 MHz spectrometer (Bruker, Karlsruhe, Đức) ở tần số hoạt Ďộng 500 MHz (1H) và 125 MHz (13C) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong tất cả các thí nghiệm, CDCl3 Ďược sử dụng làm dung môi và chất chuẩn nội. Cấu trúc của squalene Ďược xác Ďịnh bằng việc so sánh dữ liệu phổ NMR với chất squalene Ďã Ďược công bố [132]. 2.2.3. Nhóm phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Phương pháp xác định chỉ tiêu cảm quan Trạng thái cảm quan của squalene như mầu sắc, mùi vị Ďược xác Ďịnh theo tiêu chuẩn bằng cách quan sát như TCVN (Technical Commit of Vietnam - Tiêu chuẩn quốc gia của Việt Nam) 2627-1993 [133]. Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý Độ ẩm và chất bay hơi của squalene Ďược xác Ďịnh theo TCVN 6120:2007, trị số acid, xà phòng hóa, peroxyt, Iod Ďược xác Ďịnh theo TCVN 6127:2010, TCVN 6126:2007, TCVN 6121:2010 và TCVN 6122:2010, tương ứng [134, 135, 136, 137, 138]. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật Các chỉ tiêu vi sinh vật như vi sinh vật hiếu khí, tổng số men mốc, E. coli, Coliforms, Salmonella, Staphylococcus aureus Ďược xác Ďịnh theo TCVN 4884:2005, TCVN 8275-2:2010, TCVN 7924-2:2008, TCVN 6848:2007, TCVN 4829:2005 và TCVN 4830-1:1999, tương ứng tại Phòng thử nghiệm Hóa sinh, Trung tâm chứng nhận phù hợp (Quacert), thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ [139, 140, 141, 141, 143, 144]. Phương pháp xác định chỉ tiêu kim loại Các chỉ tiêu kim loại như sắt, Ďồng, asen, chì, ure Ďược xác Ďịnh theo AOAC (Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hóa phân 58 tích chính thống 999.10.2012, AOAC 999.10.2012, AOAC 986.15.2012 và TCVN 7602:2007, tương ứng tạị Phòng thử nghiệm Hóa sinh, Trung tâm chứng nhận phù hợp (Quacert), thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ [145, 146]. 2.2.4. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro) 2.2.4.1. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo Phương pháp đánh giá độc tính cấp của squalene Nghiên cứu Ďộc tính cấp và xác Ďịnh LD50 (Lethal dose 50%) bằng Ďường uống theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon [147], theo qui Ďịnh của Bộ Y tế Việt Nam (2018) [148], hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2002) và của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) (2000) [149, 150]. Chuột nhắt trắng (CNT) chủng Swiss gồm 40 con chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 08 con. Trước khi thí nghiệm chuột nhịn ăn 16 giờ, cho uống nước bình thường. Sau 16 giờ nhịn ăn, cho chuột uống squalene không pha loãng với các mức liều tăng dần 10, 20, 30, 40, 50 mL/kg khối lượng cơ thể (KLCT) tương ứng với các mức liều 11,65; 23,30; 34,95; 46,60; 58,25 g/kg KLCT. Chuột Ďược uống squalene cưỡng bức bằng cách dùng kim cong Ďầu tù Ďưa thẳng vào dạ dày chuột. Trong vòng 72 giờ và 168 giờ sau khi uống squalene, chuột Ďược theo dõi tình trạng chung (vận Ďộng, ăn uống, bài tiết...), xác Ďịnh số lượng chuột chết ở mỗi lô và xác Ďịnh liều cao nhất không gây chết chuột, liều thấp nhất gây chết 100% số chuột và các liều trung gian. Tiến hành phẫu tích quan sát tình trạng các mô gan, lách và tạng ngay sau khi có chuột chết (nếu có) Ďể xác Ďịnh nguyên nhân gây Ďộc [21, 46]. Phương pháp đánh giá độc t nh bán trường diễn Độc tính bán trường diễn Ďược Ďánh giá theo qui Ďịnh của Bộ Y tế Việt Nam (2018) hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2000) và của Tổ chức Y tế thế giới (2000) [149, 150]. Chuột cống trắng (CCT) 24 con, Ďược chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 08 con. Công thức thí nghiệm gồm: Lô Ďối chứng: uống dầu oliver liều 1,00 mL/kg KLCT/24 giờ; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver), liều 400 59 mg/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg/ngày. Chuột Ďược uống như trên với cùng thể tích 1,00 mL/kg KLCT/ngày trong 60 ngày liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu gồm: Tình trạng chung, thể trọng của chuột; Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu; Đánh giá chức năng gan, thận, chuyển hóa thông qua Ďịnh lượng một số chỉ số sinh hóa trong máu: Aspartat - aminotransferase (ALT); Alanin - aminotransferase (AST); bilirubin toàn phần, albumin huyết tương và cholesterol toàn phần; HDL-C; creatinin huyết thanh. Các thông số theo dõi Ďược kiểm tra vào trước lúc uống squalene (D0), ngày thứ 30 (D30) ngày thứ 60 (D60) của nghiên cứu. Mô bệnh học: Sau 60 ngày uống squalene, chuột Ďược mổ Ďể quan sát Ďại thể toàn bộ các cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, lách, thận của ít nhất 30% số chuột ở mỗi lô. Các xét nghiệm vi thể Ďược thực hiện tại Bộ môn khoa Giải phẫu bệnh - Pháp y, Bệnh viện Quân y 103. Phương pháp đánh giá tác dụng làm tăng HDL-C của squalene Tác dụng làm tăng HDL-C của squalene trên CNT Ďược tiến hành Ďánh giá theo phương pháp Ďược mô tả bởi Clara Gaba´s-Rivera và cộng sự [46]. CNT có 24 con, chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con bao gồm: Lô 1 (Ďối chứng): uống dầu oliver; Lô 2 (thí nghiệm 1): uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 600 mg/kg KLCT/ngày; Lô 3 (thí nghiệm 2): uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày. Chuột Ďược uống như trên với cùng thể tích 1,00 mL/kg/ngày trong 60 ngày, cuối thí nghiệm giết chuột, Ďánh giá các chỉ tiêu: Cân nặng cơ thể (thể trọng), cân nặng gan; Cholesterol toàn phần, HDL-C; LDL-C; VLDL-C (very low density lipoprotein - cholesterol, cholesterol gắn với lipoprotein có tỷ trọng rất thấp), tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần; TG máu. 2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipit của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro Phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm tác dụng sinh học của squalene Tế bào HepG2 và RAW264.7 Ďược nuôi cấy trên môi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37C, 5% CO2. 60 Đối với các thí nghiệm có sử dụng squalene, ban Ďầu các tế bào HepG2 Ďược nuôi cấy 24 h trong môi trường DMEM trong Ďĩa nuôi cấy loại 6 giếng với mật Ďộ 1 x 10 6 tế bào/ giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa lipid bằng cách ủ với môi trường DMEM có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin và 600 M acid palmitic pha trong 0,16% fatty acid-free BSA trong thời gian 4 h. Tế bào HepG2 bị rối loạn chuyển hóa lipid sau Ďó Ďược ủ với dải nồng Ďộ của squalene (từ 10 Ďến 100 μM), hoặc 1 μM chất chuẩn kích hoạt thụ thể gan LXR/β (T0901317) trong 24 h - 72h. 0,1% DMSO Ďược sử dụng như là Ďối chứng. Sau thời gian ủ với squalene và thuốc, thu tế bào và sử dụng cho các thí nghiệm về phân tích hàm lượng lipit, Ďịnh lượng qPCR. Đối với tế bào RAW264.7, ban Ďầu các tế bào Ďược nuôi cấy 24 h trong môi trường DMEM trong Ďĩa nuôi cấy loại 6 giếng với mật Ďộ 1 x 106 tế bào/giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào RAW264.7 Ďược ủ với nhiều dải nồng Ďộ của nồng Ďộ của squalene (từ 10 Ďến 100 μM) và 1 μM chất chuẩn kích hoạt thụ thể LXR/β (T0901317) trong 48h. 0,1% DMSO Ďược sử dụng như là Ďối chứng. Sau thời gian ủ với squalene và thuốc, thu tế bào và sử dụng cho các thí nghiệm về phân tích hàm lượng lipit, Ďịnh lượng qPCR. Phương pháp đánh giá độc t nh của squalene đối với tế bào HepG2 Độc tính của squalene tách chiết từ chủng PQ6 lên tế bào HepG2 Ďược phân tích theo phương pháp MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide) [151]. Các dòng tế bào có mật Ďộ 0,5 x 104 tế bào/mL Ďược nuôi cấy trong Ďĩa 96 giếng với môi trường DMEM có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin, ủ ở nhiệt Ďộ 37°C, 5% CO2. Sau 24 giờ nuôi cấy, Ďĩa 96 giếng Ďược chuyển Ďổi sang môi trường DMEM không có FBS. Tế bào Ďược xử lý với squalene Ďược pha loãng bằng dung môi DMSO ở các nồng Ďộ khác nhau và Ďảm bảo nồng Ďộ cuối của DMSO trong môi trường nuôi cấy không vượt quá 0,1% (v/v) Ďể tránh gây Ďộc tế bào do dung môi. Sau 24-72 giờ, 20 μL dung dịch MTT có nồng Ďộ 2 mg/mL Ďược cho vào mỗi giếng và tiếp tục ủ trong 4 giờ; sau Ďó, tiến hành loại bỏ môi trường, thêm 100 mL DMSO lắc Ďều Ďọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometer Genios TECAN (Đức). Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (GI (%)) Ďược tính theo công thức sau: OD 540nm mẫu Ďối chứng - OD 540 nm mẫu thử GI (%) = --------------------------------------------- ----------x 100 OD 540 nm mẫu Ďối chứng 61 Mỗi thí nghiệm Ďược lặp lại từ 3-5 lần. Phương pháp nhuộm lipid bằng Oil Red O [152] Các dòng tế bào sau khi Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ khác nhau Ďược rửa 2 lần bằng dung dịch Ďệm phosphate buffered saline (PBS) và cố Ďịnh với 10% (v/v) formalin ở nhiệt Ďộ phòng trong thời gian 1 h. Các tế bào sau Ďó Ďược nhuộm với dung dịch ORO (Sigma-Aldrich, Biologycal Stain Commision) trong 15 phút. Rửa các dung dịch nhuộm thừa bằng nước cất. Chụp ảnh tế bào sau khi nhuộm lipid bằng máy ảnh Canon IXY digital 70 (Canon, Tokyo, Nhật Bản). Định lượng lipid nội bào bằng cách hòa tan các tế bào Ďược nhuộm ORO trong isopropanol và Ďo mật Ďộ quang ở bước sóng 500 nm trên máy quang phổ Hitachi U-1100 (Hitachi Ltd., Tokyo, Nhật Bản). Phương pháp tách chiết lipid nội bào Tế bào sau khi Ďược ủ với squalene, sẽ Ďược rửa 2 lần với PBS. Sau Ďó, tế bào Ďược ủ với hỗn hợp dung môi n-hexane: isopropanol (2:1, v:v) trong thời gian 30 phút. Dung dịch chứa lipid Ďược làm bay hơi bằng máy speed-vac và hòa tan trở lại trong 100 l ethanol. Phương pháp xác định hàm lượng lipid (cholesterol và triglycerit) nội bào Hàm lượng lipid nội bào sẽ Ďươc xác Ďịnh bằng phương pháp enzym. Để Ďịnh lượng cholesterol toàn phần, trước hết phải dùng phản ứng thuỷ phân cắt Ďứt liên kết este (sử dụng enzyme cholestrol esterase), sau Ďó biến cholesterol este thành cholesterol tự do (sử dụng enzyme cholesterol oxydase). Độ Ďậm màu của phức hồng cánh sen tỷ lệ thuận với nồng Ďộ cholesterol toàn phần trong huyết thanh và Ďược xác Ďịnh bằng Ďộ hấp thụ ở bước sóng 546 nm bằng phép Ďo Ďiểm cuối. Giá trị này Ďược Ďo trên máy phân tích tự Ďộng Olympus AU400 (Olympus Analyzers, Tokyo, Nhật Bản) tại Phòng khám Ďa khoa 125 Thái Thịnh, Hà Nội. Protein tổng số Ďược xác Ďịnh với kít Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Hàm lượng lipid trong tế bào sau Ďó sẽ Ďược chuẩn hóa với nồng Ďộ của protein tổng số theo công thức sau: Hàm lượng lipid tổng số Hàm lượng lipid trong tế bào (mg/mg protein) = ---------------------------- Hàm lượng protein tổng số Phương pháp tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, phân t ch qPCR (real time PCR) 62 RNA tổng số Ďược tách chiết theo kit RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản) và thực hiện theo quy trình như hãng Ďã khuyến cáo (Phụ lục 2, Hình P2). Tổng hợp cDNA theo kit RevertAid First Strand cDNA (Thermo Fisher, Scientific Ins., Singapore) và thực hiện theo quy trình của hãng Ďã khuyến cáo cho người sử dụng (Phụ lục 2, 2.2). Kết quả thu Ďược là 20 L cDNA. Các cDNA sau Ďó Ďược sử dụng như khuôn mẫu cho phản qPCR với các cặp mồi như Ďược trình bày trong Bảng 2.1. Phản ứng qPCR Ďược thực hiện ở Ďiều kiện phản ứng là: 95oC trong 10 phút tiếp theo là 45 chu kỳ |”của 95oC trong 20 giây, 58oC trong 10 giây và 72oC trong 20 giây. Tính Ďặc hiệu của mồi Ďược xác Ďịnh ở 65-95oC với tốc Ďộ làm nóng 0,1 oC/giây và kết thúc bằng cách hạ nhiệt Ďộ xuống 40oC trong 30 giây. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Ďược sử dụng Ďể chuẩn hóa số liệu. Bước đầu nghiên cứu cơ chế phân tử về tác dụng giảm cholesterol và triglycerid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Xác Ďịnh mức Ďộ biểu hiện của các gen mã hóa như thụ thể LDL- R là protein bề mặt tế bào, Ďóng một vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển cholesterol, bằng cách vận chuyển LDL- cholesterol từ huyết thanh Ďến các tế bào gan; CYP7A1 có vai trò là ở tại tế bào gan, khi cholesterol dư thừa sẽ Ďược chuyển hóa thành acid mật dưới tác dụng của CYP7A1 [153]; Thụ thể gan X (liver X receptor; LXR) thuộc nhóm các thụ thể hormone nội bào, Ďóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống xơ vữa Ďộng mạch bằng cách Ďiều hòa mức Ďộ biểu hiện của gen Ďích là các gen mã hóa cho các protein vận chuyển như ATP-binding cassette (ABC) proteins A1 (ABCA1), G1, và apolipoprotein E (ApoE), dẫn Ďến tăng cường quá trình lưu thông cholesterol, kích thích vận chuyển cholesterol ngược từ các mô ngoại biên và tăng cường lượng cholesterol tốt (HDL-C) trong cơ thể [42]. Xác Ďịnh mức Ďộ biểu hiện gen bằng phương pháp qPCR Ďịnh lượng. Sau khi tách chiết ARN tổng số và tổng hợp cDNA tiến hành chạy phản ứng real time PCR ở Ďiều kiện phản ứng là: 95oC trong 10 phút tiếp theo là 45 chu kỳ của 95oC trong 20 giây, 58 o C trong 10 giây và 72 oC trong 20 giây. Tính Ďặc hiệu của mồi Ďược xác Ďịnh ở 65-95oC với tốc Ďộ làm nóng 0,1oC/giây và kết thúc bằng cách hạ nhiệt Ďộ 63 xuống 40oC trong 30 giây. Gen GAPDH Ďược dùng Ďể chuẩn hóa (gen giữ nhà - house keeping- luôn biểu hiện trong bất kì Ďiều kiện thí nghiệm nào). 2.2.5. Thống kê phân t ch số liệu Số liệu Ďươc trình bày bằng số trung bình ± sai số chuẩn. Sự sai khác Ďược coi là có ý nghĩa thống kê ở mức P <0,05, số liệu Ďược xử lý thống kê theo phương pháp Student’s t-test, so sánh bằng anova test sử dụng phần mềm SPSS 16.0. 2.2.6. Địa điểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm và phân tích các kết quả trong nghiên cứu Ďược trình bày trong Bảng 2.3. Bảng 2.3. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu STT Nội dung nghiên cứu Địa Ďiểm tiến hành thí nghiệm 1 Sàng lọc chủng/loài vi tảo biển tiềm năng của Việt Nam cho sản xuất cao squalene Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược sinh khổi tảo có hàm lượng squalene cao Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3 Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối tảo; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Ďược Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH và Ďo tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH và kiểm tra tại Trung tâm chứng nhận phù hợp (Quacert), Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ. 4 Đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene trên mô hình in vivo Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH và Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y 5 Bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên mô hình in vitro Nuôi cấy tế bào Phòng Công nghệ Tảo và Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH và CNVN Thí nghiệm tách chiết lipid nội bào, Oil Red O, tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH và CNVN Phân tích qPCR Phòng Công nghệ Tảo và Phòng thí nghiệm trọng Ďiểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH và CNVN 64 Để thực hiện các nội dung nghiên cứu Ďã Ďược Ďề ra, sơ Ďồ thí nghiệm Ďã Ďược chỉ ra trên Hình 2.1. - Độc tính cấp trên CNT - Độc tính bán trường diễn trên CCT -Tác dụng tăng HDL-C của squalene -Tách chiết squalene từ lipid tổng số + Điều kiện tách chiết lipid tổng số: ảnh hưởng của dung môi, nhiệt Ďộ, thời gian phản ứng, Ďiều kiện khuấy trộn, số lần chiết, tỷ lệ sinh khối/dung môi, nhiệt Ďộ sấy sinh khôi, Ďộ ẩm sinh khối + Điều kiện tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số: ảnh hưởng tỷ lệ n- hexane/chloroform -Tinh sạch và làm giàu squalene bằng dung môi Quy mô phòng thí nghiệm Tách chiết và tinh sạch squalene Quy mô pilot -Tách chiết squalene từ sinh khối khô (ảnh hưởng dung môi, Ďộ ẩm) -Tách chiết squalene từ dịch tế bào -Tinh sạch squalene thô bằng sắc kí cột (lựa chọn hệ dung môi rửa giải cho chạy sắc kí) Xác Ďịnh hàm lượng và Ďộ tinh sạch bằng HPLC HPLCHPLC Xác Ďịnh cấu trúc squalene Xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của squalene (Cảm quan, hóa lý, vi sinh vật, kim loại) Bình lên men 30L -Lên men theo mẻ: glucose (3, 6, 9, 12, 22%), nito (cao nấm men và cao nấm men + mì chính) -Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (ảnh hưởng của vitamin) Bình tam giác -Nhiệt Ďộ (15, 20, 25, 30 o C) - Glucose (15, 30, 40, 60, 90 g/L) -Cao nấm men (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4%) -Terbinafine (0, 0,1, 1, 10, 100, 150, 200 µg/mL) - Vitamin (0, 0,2, 0,4, 0,6%) Tối ưu Ďiều kiện kiện nuôi trồng Vi tảo biển dị dưỡng 32 chủng Schizochytrium và 8 chủng Thraustochytrium Schizochitryum mangrovei PQ6 Tính an toàn và tác dụng sinh dược của squalene Mô hình invivo Mô hình invitro -Nuôi cấy tế bào Hep G2 và RAW264.7 -Đánh giá Ďộc tính của squalene trên 2 dòng tế bào -Tác dụng giảm lipid của squalene -Cơ chế phân tử tác dụng giảm chlesterol của squalene Hình 2.1. Sơ Ďồ thí nghiệm nghiên cứu squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 65 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất squalene Tiêu chí tuyển chọn các chủng/loài vi tảo biển dị dưỡng tiềm năng cho việc sản xuất squalene trong Ďiều kiện phòng thí nghiệm trước tiên Ďược dựa trên khả năng sinh trưởng (tạo sinh khối), tích lũy lipid và squalene. Chúng tôi tiến hành sàng lọc 31 chủng thuộc chi Schizochytrium và 8 chủng thuộc chi Thraustochytrium phân lập từ các vùng bờ biển và rừng ngập mặn ở Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An và Bình Định trong năm 2013-2014 và chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 Ďược lưu giữ trong tập Ďoàn giống của phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học. Các chủng sau khi phân lập, làm sạch Ďược nuôi riêng rẽ trên môi trường lỏng M1 (Ďối với các chủng thuộc chi Schizochytrium) hoặc Bajpai cải tiến (Ďối với các chủng thuộc chi Thraustochytrium) Ďể xác Ďịnh các thông số như MĐTB, SKK, hàm lượng lipid và squalene sau 5 ngày nuôi cấy. Đây là thời Ďiểm mà hầu hết các chủng sinh trưởng Ďạt cực Ďại. Kết quả Ďược trình bày trên Bảng 3.1. Bảng 3.1. Sinh trưởng, hàm lượng lipid tổng số và squalene của các chủng thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium Ďã phân lập Số thứ tự Chủng Mật Ďộ tế bào (x10 6 TB/mL) Sinh khối khô (g/L) Hàm lượng lipid (% SKK) Hàm lượng squalene (mg/g SKK) Thuộc chi Schizochytrium Hải Phòng 1 HP1 38,45 ± 0,09 10,05 ± 0,15 17,95 ± 0,13 35,77 ± 0,78 2 HP2 42,83 ± 0,20 8,19 ± 0,13 20,03 ± 0,05 28,59 ± 0,46 3 HP3 45,95 ± 1,04 7,72 ± 0,24 14,12 ± 0,14 31,34 ± 1,25 4 HP4 44,96 ± 0,12 10,17 ± 0,84 12,61 ± 0,05 35,98 ± 2,78 5 HP5 45,20 ± 0,12 11,12 ± 0,32 36,21 ± 0,31 47,05 ± 1,53 6 HP6 31,16 ± 0,14 10,02 ± 0,55 15,36 ± 0,01 20,31 ± 0,25 Nam Định 7 ND1 38,48 ± 0,09 10,07 ± 0,03 17,98 ± 0,15 15,09 ± 0,08 8 ND2 44,85 ± 0,21 8,04 ± 0,02 21,07 ± 0,02 17,04 ± 0,07 9 ND3 46,95 ± 1,04 10,92 ± 0,17 13,93 ± 0,14 9,37 ± 0,05 10 ND4 45,96 ± 0,15 10,02 ± 0,64 10,67 ± 0,25 15,08 ± 2,03 11 ND5 47,20 ± 0,13 11,09 ± 0,02 30,04 ± 0,31 32,98 ± 0,54 66 12 ND6 32,16 ± 0,19 9,03 ± 0,07 14,87 ± 0,01 22,16 ± 1,25 Quảng Ninh 13 QN1 33,82 ± 0,14 9,04 ± 0,01 16,05 ± 0,05 57,14 ± 3,07 14 QN2 38,05 ± 1,05 9,07 ± 0,04 16,94 ± 0,46 36,74 ± 1,78 15 QN3 33,40 ± 0,02 11,12 ± 0,03 20,84 ± 0,56 18,26 ± 0,74 16 QN4 31,90 ± 0,03 11,09 ± 0,01 34,34 ± 0,74 45,98 ± 1,73 17 QN5 28,63 ± 0,24 10,15 ± 0,02 18,64 ± 0,61 19,08 ± 0,74 18 QN6 47,34 ± 0,27 12,11 ± 0,01 25,70 ± 0,32 7,13 ± 0,25 Thanh Hóa 19 TH1 40,08 ± 3,06 9,98 ± 0,26 25,89 ± 1,46 45,70 ± 1,56 20 TH3 41,27 ± 2,39 10,06 ± 0,56 30,56 ± 1,74 78,50 ± 1,78 21 TH6 47,56 ± 3,04 11,39 ± 1,07 35,46 ± 1,05 41,30 ± 1,05 Nghệ An 22 NA1 33,82 ± 0,14 9,04 ± 0,01 16,05 ± 0,05 67,56 ± 1,97 23 NA2 38,05 ± 1,05 9,07 ± 0,04 16,94 ± 0,46 25,93 ± 0,72 24 NA3 33,40 ± 0,02 11,12 ± 0,03 30,84 ± 0,56 60,21 ± 1,89 25 NA4 31,90 ± 0,03 11,09 ± 0,01 24,34 ± 0,74 45,07 ± 0,83 26 NA5 28,63 ± 0,24 10,15 ± 0,02 18,64 ± 0,61 45,33 ± 1,85 Bình Định 27 BĐ6 38,48 ± 0,09 10,07 ± 0,63 17,98 ± 0,15 8,15 ± 0,09 28 BĐ7 44,85 ± 0,21 10,04 ± 0,12 21,07 ± 0,02 11,25 ± 0,16 29 BĐ8 46,95 ± 1,04 11,02 ± 0,34 13,93 ± 0,14 22,38 ± 1,85 30 BĐ9 45,96 ± 0,15 10,15 ± 0,44 11,61 ± 0,05 36,48 ± 1,42 31 BĐ10 47,20 ± 0,13 11,09 ± 0,92 28,04 ± 0,31 30,01 ± 0,82 32 PQ6 * 40,62 ± 0,96 12,38 ± 0,72 39,61 ± 0,12 102,01 ± 1,04 Thuộc chi Thraustochytrium 33 TN1 32,15 ± 0,17 9,97 ± 0,07 14,85 ± 0,03 13,76 ± 0,56 34 TN2 33,80 ± 0,15 9,04 ± 0,01 16,07 ± 0,02 15,25 ± 0,31 35 TG4 46,82 ± 1,78 9,07 ± 1,13 20,45 ± 1,16 43,85 ± 0,56 36 TG9 84,48 ± 1,76 8,98 ± 0,23 16,87 ± 1,78 35,70 ± 2,47 37 TG10 108,03 ± 1,96 10,05 ± 0,45 20,36 ± 1,69 40,32 ± 1,89 38 TG11 98,72 ± 1,24 11,04 ± 1,07 20,01 ± 1,32 28,90 ± 0,07 39 TG12 82,88 ± 1,38 10,65 ± 1,16 18,95 ± 1,14 10,40 ± 1,78 40 TG15 114,56 ± 1,27 11,86 ± 1,63 28,79 ± 1,09 12,20 ± 0,05 Ghi chú: PQ6* - chủng PQ6 được phân lập ở Huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang năm 2006-2008; hàm lượng squalene được xác định sơ bộ theo phương pháp quang phổ; Ký hiệu chủng: chữ cái - địa điểm phân lập, chữ số: ký hiệu chủng. Do kích thước tế bào sau 5 ngày nuôi ở các chủng phân lập là hoàn toàn khác nhau nên trong Bảng 3.1 Ďã không có sự tuyến tính giữa SKK và MĐTB giữa các chủng trong một chi. Kết quả thu Ďược Ďã cho thấy, trong số các chủng Schizochytrium và Thraustochytrium Ďã phân lập thì các chủng Schizochytrium spp. bao gồm HP5, ND5, QN4, TH6 và NA3 là chủng có khả năng tạo sinh khối lớn (>11 g SKK/Lit), hàm lượng lipit tổng số tích lũy cao (> 30% SKK), cũng như hàm 67 lượng squalene cao (> 40 mg/g SKK). Tuy nhiên, khi so sánh hàm lượng squalene và khả năng tạo sinh khối thì tất cả các chủng này Ďều thấp hơn chủng PQ6 (102,01 mg/g SKK); sinh khối Ďạt > 12 g SKK/Lit; hàm lượng lipit Ďạt > 40 % SKK- chủng Ďược sử dụng Ďể tham chiếu. Chủng PQ6 Ďã Ďược chứng minh là chủng tiềm năng Ďể sản xuất squalene trong số các chủng vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng trong tập Ďoàn giống của phòng Công nghệ tảo trước Ďây [90, 120]. Dựa trên những Ďặc Ďiểm hình thái, Ďọc và so sánh trình tự nucleotide Ďoạn gen 18S rRNA, tên khoa học của chủng PQ6 Ďược xác Ďịnh thuộc về loài Schizochytrium mangrovei Raghukumar với mã số Ďăng ký trên Genbank là EU72865 [125]. Các công bố trước Ďây của chúng tôi cũng Ďã chứng minh Ďược chủng S. mangrovei PQ6 là một chủng tiềm năng cho sản xuất PUFAs trong Ďó có DHA, Ďặc Ďiểm sinh học và khả năng nuôi trồng chúng trên quy mô lớn cũng Ďã Ďược nghiên cứu tương Ďối kỹ [125, 154]. Do vậy, chúng tôi Ďã lựa chọn chủng PQ6 cho các nghiên cứu tiếp t