Luận án Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa Methionine Sulfoxide Reductase trong điều kiện stress mặn, hạn ở cây Arabidopsis và đậu tương

Lời cam đoan. i

Lời cảm ơn .ii

Mục lục.iii

Danh mục chữ viết tắt . vi

Danh mục bảng.viii

Danh mục hình . ix

MỞ ĐẦU. 1

1. Tính cấp thiết của luận án . 1

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án . 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. 2

3.1. Ý nghĩa khoa học của luận án. 2

3.2. Ý nghĩa thực tiễn của luận án . 3

4. Những đóng góp mới của luận án. 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 4

1.1. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến đời sống thực vật . 4

1.1.1. Tác động của biến đổi khí hậu đối với cây trồng nông nghiệp

hiện nay. 4

1.1.2. Cơ chế tác động của yếu tố ngoại cảnh bất lợi đến tế bào thực vật. 9

1.1.3. Cơ chế đáp ứng của thực vật với điều kiện bất lợi . 15

1.2. ai trò của n ym m thionin sul oxid r ductas và quá trình

ôxi hóa m thionin ở thực vật. 18

1.2.1. Quá trình ôxi hóa m thionin ở thực vật . 18

1.2.2. Tổng quan về họ enzyme methionine sulfoxide reductase. 21

1.3. M thionin và prot in giàu m thionin ở thực vật. 29

1.3.1. Một vài nét về m thionin và vai trò của methionine ở thực vật . 29iv

1.3.2. Prot in giàu m thionin ở thực vật. 32

1.4. Tiềm năng ứng dụng của enzyme methionine sulfoxide reductase

trong chọn tạo giống nhằm nâng cao tính chống chịu ở cây trồng. 34

CHƯƠNG II T LIỆU À PHƯƠNG PH P NGHI N C U. 38

2.1. ật liệu nghiên cứu. 38

2.1.1. ật liệu cho nghiên cứu tin sinh học . 38

2.1.2. ật liệu cho nghiên cứu thực nghiệm. 38

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 38

2.2.1. Thời gian nghiên cứu . 38

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu. 38

2.3. Phương pháp nghiên cứu . 39

2.3.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học . 39

2.3.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm. 47

CHƯƠNG III KẾT QUẢ À THẢO LU N. 51

3.1. Xác định và phân tích prot in giàu methionine ở Arabidopsis . 51

3.1.1. Tìm kiếm, xác định và định danh g n mã hóa prot in giàu

methionine ở Arabidopsis . 51

3.1.2. Phân loại chức năng của prot in giàu m thionin ở Arabidopsis . 53

3.1.3. Phân tích đặc tính cơ bản của prot in giàu m thionin ở

Arabidopsis . 55

3.1.4. Phân tích mức độ biểu hiện g n mã hóa MRP trên Arabidopsis

trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi. 60

3.1.5. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây Arabidopsis thaliana chuyển

gen biểu hiện quá mức g n At3G55240 với điều kiện bất lợi . 67

3.2. Xác định và phân tích prot in giàu M thionin ở đậu tương . 74

3.2.1. Tìm kiếm, xác định và định danh g n mã hóa prot in giàu

methionine ở đậu tương . 75v

3.2.2. Phân loại chức năng của g n mã hóa prot in giàu m thionin ở

đậu tương . 76

3.2.3. Phân tích mức độ biểu hiện của g n mã hóa prot in giàu

methionine ở đậu tương . 78

3.3. Phân tích in silico họ g n mã hóa n ym MSR ở đậu tương. 82

3.3.1. Xác định họ g n mã hóa n ym MSRA ở g nom cây đậu tương. 83

3.3.2. Phân tích hiện tượng lặp g n của họ g n mã hóa n ym MSRA

ở đậu tương . 85

3.3.3. Phân tích một số đặc tính cơ bản của họ n ym MSRA ở đậu

tương . 87

3.4. Đánh giá đặc tính của họ g n mã hóa n ym MSR ở đậu tương. 90

3.4.1. Dự đoán yếu tố điều hòa cis- ở vùng promot r của họ g n mã hóa

enzyme MSR ở đậu tương . 90

3.4.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của g n mã hóa MSR ở đậu tương

trong điều kiện thường và điều kiện ngoại cảnh bất lợi bằng tin

sinh học . 93

3.4.3. Phân tích mức độ đáp ứng của g n mã hóa MSRB ở đậu tương

trong điều kiện thường và điều kiện ngoại cảnh bất lợi bằng thực

nghiệm. 97

KẾT LU N À Đ NGH . 105

Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án. 106

Tài liệu tham khảo. 107

Phụ lục. 128

pdf162 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 436 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa Methionine Sulfoxide Reductase trong điều kiện stress mặn, hạn ở cây Arabidopsis và đậu tương, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ợc biểu hiện và có thể biểu hiện mạnh ở ít nhất 1 mẫu mô trong bộ phận chính trên cây trong điều kiện thường, đặc biệt ở hoa, bao phấn ở giai đoạn non và trưởng thành là vị trí mà các gen AtMRP đều có xu hướng biểu hiện mạnh (Phụ lục hình S . Một số gen AtMRP có biểu hiện mạnh ở hầu hết các mô, sau đó đã được nhấn mạnh và minh họa ở Hình 3.3. 63 Hình 3.3. D liệu bi u hiện của mộ số gen AtMRP iêu bi u rong các m u mô ở A. thaliana 64 ii Câu hỏi tiếp th o được đặt ra là liệu rằng các gen mã hóa MRP có biểu hiện như thế nào trong các điều kiện bất thuận? Để trả lời câu hỏi này, một số dữ liệu microarray phân tích trên cây A. thaliana ở điều kiện xử lý mặn [122] và hạn [123] đã được lựa chọn để phân tích. Trong tổng số 121 gen AtMRP, giá trị biểu hiện của 108 gen AtMRP (chiếm 89,26% được tìm thấy trong cơ sở microarray này Phụ lục bảng S3 . Trong trường hợp này, gen có sự thay đổi tăng hoặc giảm ≥ lần được coi là có biểu hiện đáp ứng với điều kiện bất lợi tương ứng. Kết quả cho thấy có khoảng 50% gen mã hóa MRP có mức độ phiên mã thay đổi có ý nghĩa trong điều kiện mặn và/hoặc điều kiện hạn Phụ lục bảng S3 . Cụ thể, trong điều kiện xử lý mặn, và 7 gen có mức độ biểu hiện phiên mã lần lượt tăng và giảm ít nhất 2 lần. Trong điều kiện xử lý hạn, 3 và 6 gen lần lượt được chỉ ra có mức độ biểu hiện tương ứng là cao và thấp Phụ lục bảng S3). Khi kết hợp dữ liệu của các gen AtMRP trong cả cơ sở dữ liệu mircroarray trong trường hợp hạn và mặn, 6 gen đã được tìm thấy có biểu hiện đáp ứng tăng và 3 gen cùng giảm biểu hiện đi hơn lần trong cả điều kiện Phụ lục bảng S3 . Đáng chú ý, hầu hết gen có biểu hiện đáp ứng đồng thời với cả điều kiện bất lợi đều mã hóa cho các phân tử prot in đặc hiệu chỉ có trong thực vật. Điều này có thể được giải thích do g nom ở thực vật thường có kích thước lớn hơn ở động vật, đơn giản bởi chúng không có khả năng di chuyển như các loài động vật. Thực vật, trải qua quá trình tiến hóa, đã thích nghi bằng cách phát triển hệ thống prot in chức năng (functional protein) và prot in điều hòa (regulatory protein) để tham gia vào hàng loạt quá trình chống chịu lại điều kiện ngoại cảnh bất lợi. ì thế, rất nhiều phân tử prot in, chủ yếu liên quan đến cơ chế chống chịu điều kiện bất lợi, chỉ được tìm thấy và đặc trưng trên thực vật mà không tìm thấy các phân tử tương đồng trên cơ thể động vật. Trong số các gen đã tìm được, At3G59900 được tăng cường biểu hiện khoảng 10,7 lần trong điều kiện hạn nhưng lại giảm biểu hiện 65 -2,6 lần trong điều kiện xử lý mặn Bảng 3.4, Phụ lục Bảng S3 . Để tìm hiểu một cách cụ thể hơn, tổng số 10 gen mã hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh nhất trong cả điều kiện hạn hán và mặn được lựa chọn để phân tích ở Bảng 3.4. Bảng 3.4. Gen AtMRP có mức độ phiên mã đáp ứng rong điều kiện hạn à mặn # Tên gen Met (%) Mức độ hay đổi rong điều kiện hạn Mức độ hay đổi rong điều kiện mặn Chú giải chức năng gen 1 At1G32560 6,02 135,3 3,3 AtLEA4-1 2 At1G33860 8,55 2,4 2,2 Chưa rõ chức năng 3 At3G55240 6,12 -60,3 -26,9 Chưa rõ chức năng 4 At3G59900 6,20 10,7 -2,6 Chưa rõ chức năng 5 At3G62090 6,38 64,6 2,3 Nhân tố phiên mã bHLH 6 At4G12334 6,25 -9,8 -3,0 Cytochrome P450 7 At4G33467 8,91 337,5 6,2 Chưa rõ chức năng 8 At4G34590 6,33 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã b IP 9 At5G42325 6,03 2,7 2,4 Nhân tố phiên mã IIS 10 At5G67390 7,43 -4,2 -4,1 Chưa rõ chức năng Chú thích àu đỏ thể hiện gen có đáp ứng tăng trong hi màu xanh di n tả gen có đáp ứng giảm At4G33467 là gen có biểu hiện tăng mạnh nhất trong điều kiện hạn hán, mức độ thay đổi gấp hơn 33 lần Bảng 3.4). Một gen khác như At1G32560, mã hóa cho một thành viên trong họ LEA (Late embryogensis abundant nhóm I , được tăng cường biểu hiện gấp khoảng 135 lần trong điều kiện hạn. Trước đó, các prot in LEA nhóm I đã được chỉ ra là có liên quan đến cơ chế cảm ứng với điều kiện mất nước ở A. thaliana [37, 125], Gen At3G62090 mã hóa cho một thành viên của TF bHLH, đặc trưng bởi cấu trúc cơ bản xoắn-vòng-xoắn, có mức độ biểu hiện tăng cường gấp 6 và 2 lần tương ứng trong xử lý hạn và mặn. Nhân tố bHLH gần đây cũng được ghi nhận đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát các kích thích từ môi trường, đặc biệt là phản ứng với ánh sáng trong giai đoạn nảy mầm [132]. 66 Ngược lại, trong số các gen có biểu hiện giảm, At3G55240 bị kìm hãm biểu hiện mạnh nhất, tương ứng khoảng 6 và 6 lần trong điều kiện hạn và mặn Bảng 3.4 . Mặc dù gen này đến nay vẫn chưa rõ chức năng, tuy nhiên, trước đó, Ichikawa và cộng sự 6 đã ghi nhận về sự biểu hiện quá mức của gen này gây ra hiện tượng PEL trên cây A. thaliana [75]. At3G55240 mã hóa cho protein nhỏ, có chiều dài 95 amino acid Phụ lục Bảng S1), với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài 33 bp . At3G55240 đều có gen tương đồng trên thực vật, như Bradi2G23060 trên Brachypodium distachyon, Glyma02G10620 trên G. max, OJ1281_H05.17 trên O. sativa và Solyc05G054750.2 trên S. lycopersicum. Điều này cho thấy At3G55240 là gen mã hóa cho prot in đặc trưng chỉ được biểu hiện đặc thù trong thực vật [75]. Như đã đề cập ở mục 3. . , khoảng 50 % AtMRP chưa rõ chức năng, các gen mã hóa nhóm MRP này được xác định có biểu hiện thay đổi trong điều kiện bất lợi Phụ lục bảng S2, S3 . ì thế, kết quả của luận án này s cung cấp những dẫn liệu quan trọng cho các nghiên cứu chức năng gen sau này về các gen AtMRP chưa rõ chức năng. Tiếp th o, những gen còn lại có biểu hiện đáp ứng với điều kiện bất lợi có vai trò chủ yếu là truyền dẫn tín hiệu liên quan đến Ca2+ và là nhân tố phiên mã giúp cây trồng phản ứng với điều kiện bất lợi. Cụ thể, trong 6 AtMRP mã hóa cho prot in tham gia vào quá trình tín hiệu Ca2+, 3 gen đã được xác định có biểu hiện đáp ứng trong điều kiện mặn hoặc hạn hán Bảng 3.4, Phụ lục bảng S2), cho thấy rằng con đường tín hiệu Ca2+ có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình dẫn truyền thông tin khi thực vật chịu tác động từ yếu tố phi sinh học bất lợi. Suy luận này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó, ví dụ như về vai trò của calmodulin trong quá trình cân bằng ROS ở thực vật [10, 155, 162]. Hoạt tính xúc tác của n ym catalas xúc tác phân giải H2O2 trên Arabidopsis, bị kich thích bởi phức hệ Ca2+/calmodulin để duy trì mức độ cân bằng nội môi H2O2 [10]. Tiếp th o, 3 trên tổng số 20 AtMRP chiếm tỷ lệ 65% , mã hóa TF điều hòa quá trình phiên mã RNA, được tăng cường biểu hiện (7 gen và bị giảm biểu hiện 67 (6 gen) với điều kiện hạn hán và/hoặc mặn. Cụ thể, ba gen, At3G62090, At5G42325 và At4G3459 đều mã hóa những nhân tố phiên mã được tăng cường biểu hiện trong cả điều kiện hạn hán và chịu mặn. Trong đó, gen At4G34590, mã hóa cho b IP , đã được xác định có biểu hiện trong toàn bộ vòng đời của thực vật, đặc biệt là biểu hiện mạnh ở các mô mạch dẫn, như gân xung quanh lá. Tuy nhiên, tăng cường biểu hiện của b IP có thể gây ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật [110]. Có thể tóm tắt nội dung này như sau, i trong điều kiện thường, 49 gen AtMRP đã xác định được dữ liệu biểu hiện ở lá, thân và hoa. Trong đó, 6 gen AtMRP, bao gồm At3G05220, At4G35070, At2G46600, At1G67350 và At5G39570 và At4G32470, được tăng cường biểu hiện ở cả 3 cơ quan. Trên cơ sở dữ liệu RNA-s q mới nhất của Arabidopsis hiện nay, hầu hết AtMRP đều có xu hướng biểu hiện mạnh ở ít nhất vị trí mô trong 8 bộ phận chính trong điều kiện thường. Đặc biệt ở hoa, bao phấn ở giai đoạn non và trưởng thành là vị trí mà các gen AtMRP đều có xu hướng biểu hiện mạnh. ii Trong điều kiện hạn và mặn của một số nghiên cứu đã công bố, 108 gen AtMRP được tìm thấy dữ liệu biểu hiện. Khoảng 50% gen mã hóa MRP có biểu hiện đáp ứng với điều kiện mặn và/hoặc hạn. Kết quả phân tích cho thấy và 7 gen có biểu hiện lần lượt tăng và giảm ít nhất 2 lần trong điều kiện mặn. Trong điều kiện xử lý hạn, 3 và 6 gen lần lượt được chỉ ra có mức độ biểu hiện tăng và giảm. Trong số các gen có biểu hiện đáp ứng, At3G55240, một gen đặc trưng ở thực vật, bị kìm hãm biểu hiện mạnh nhất trong điều kiện hạn và mặn. Gen At3G55240 đến nay vẫn chưa rõ chức năng, vì vậy, tìm hiểu vai trò sinh học của gen này trong các điều kiện bất lợi s mở ra nhiều lời giải cho cơ chế chống chịu ôxi hóa ở thực vật. 3.1.5. ánh giá c độ đá ng củ cây Arabidopsis thaliana chuy n gen bi u hiện uá c gen At3 2 với điều kiện bất ợi Dựa trên các kết quả đã phân tích, At3G55240, bị kìm hãm biểu hiện mạnh nhất trong điều kiện hạn và mặn, đã được lựa chọn làm gen ứng viên 68 để thực hiện những nghiên cứu tiếp theo. Một phương pháp tiếp cận phổ biến khi nghiên cứu chức năng gen là tăng cường biểu hiện gen đó dựa vào dòng chuyển gen biểu hiện cDNA hoàn chỉnh. Trong khuôn khổ luận án này, để xác định đặc tính của gen At3G55240, một số thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá kiểu hình của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi. (i) Hạt Arabidopsis chuyển gen, ký hiệu là RBC1, được gi o trên môi trường chọn lọc để quan sát và mô tả đặc điểm hình thái của cây Arabidopsis chuyển gen biểu hiện quá mức gen At3G55240. Mức độ đáp ứng của cây A. thaliana chuyển gen được đánh giá trong (ii) điều kiện bất lợi, bao gồm nồng độ muối cao, bổ sung CdCl2 và paraquat. Kết quả được lần lượt trình bày như sau. (i) Hạt A. thaliana dòng chuyển gen được gi o trên môi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin ) để loại bỏ các hạt tạp nhiễm. Hạt chuyển gen được khử trùng và gi o đồng thời trên môi trường MS có và không có kháng sinh hygromycin 5 mg/l. Kết quả quan sát, hạt chuyển gen có tỷ lệ nảy mầm đồng đều trên cả môi trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm trên môi trường chọn lọc Hình 3.4). Điều này chứng tỏ các hạt chuyển g n RBC được thu thập từ RIKEN đều đạt chất lượng, sức nảy mầm tốt, không lẫn tạp nhiễm, Hình 3.4. D ng chuy n gen nảy mầm rên môi rường chọn lọc Các cây chuyển gen đư c trồng trên đ a thạch chứa có bổ sung háng sinh hygromycine. C1 Dòng chuyển gen biểu hiện uá mức gen At3G55240. 69 Hạt chuyển gen được gi o trên môi trường thạch và chuyển sang giá thể đất. Hạt chuyển gen và đối chứng (Col- được gi o trên môi trường MS. Đĩa cây được đặt trong phòng nuôi cấy mô ở nhiệt độ 24±2°C, quang chu kỳ với 16 giờ chiếu sáng điều kiện thường). Hình thái cây trong đĩa thạch được quan sát ở giai đoạn 7, và ngày tuổi. Kết quả cho thấy cây phát triển bình thường, lá có màu xanh nhạt hơn so với Col- Hình 3.5). Hình 3.5. Hình hái cây chuy n gen ở các giai đoạn tuổi khác nhau rên môi rường hạch Các hạt chuyển gen biểu hiện uá mức At3G 2 hiệu C1) và hạt Arabidopsis Col- đối chứng hiệu là C đư c gieo trên đ a thạch Cây ngày tuổi có kích thước tương đương nhau trên môi trường MS tiếp tục được chọn để chuyển sang giá thể đất và chăm sóc th o điều kiện tiêu chuẩn. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận ở giai đoạn 3, và 5 tuần tuổi. Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch và cây trên giá thể đất ở các giai đoạn phát triển khác nhau, cây chuyển gen có lá màu xanh nhạt, khác biệt so với đối chứng Col- Hình 3.6 . Sự sai khác về màu sắc lá cũng được quan sát từ khi cây non 7 ngày tuổi Hình 3.5 . Trước đó, như đề cập ở mục trên, hiện tượng PEL trên cây chuyển gen At3G55240 trong điều kiện thường do màu giả vàng úa này được cho là không ảnh hưởng đến cấu trúc lục lạp và khả năng quang hợp của dòng chuyển gen [75]. Tuy nhiên, số lượng lục lạp của cây chuyển gen và khả năng tích lũy tinh bột đã được ghi nhận thấp hơn so với dòng đối chứng [75]. Kết hợp với dữ liệu biểu hiện đã phân tích ở mục 70 3.1.4, gen At3G55240 biểu hiện mạnh ở mẫu mô phiến lá trưởng thành, gân lá trưởng thành cũng như toàn bộ lá trưởng thành Phụ lục hình S . Một điều khác cần nhắc tới, đó là dòng chuyển g n biểu hiện quá mức gen At3G55240 trong ngân hàng của RIKEN đã được kiểm tra có mức độ phiên mã của gen này tăng lên × 3 ÷ × 8 lần so với đối chứng Col-0 [75]. Có thể thấy rằng, mức độ biểu hiện của At3G55240 càng tăng, số lượng lục lạp càng giảm, nghĩa là mức độ biểu hiện của gen At3G55240 tỷ lệ nghịch với hàm lượng lục lạp trên lá của cây A. thaliana [75]. Một giả thuyết được đặt ra là sự tích lũy quá mức của prot in At3G55 trong lá có thể gây ức chế ngược đến sự biểu hiện của các gen liên quan đến cơ chế tổng hợp lục lạp và tinh bột ở lá, nhưng không ảnh hưởng đến khả năng quang hợp của lục lạp. Hình 3.6. Hình hái d ng cây chuy n gen rên giá h đất Cây chuyển gen biểu hiện uá mức At3G55240 hiệu là C1 và cây Arabidopsis Col- hiệu là WT đư c theo d i hình thái từ 3 đến tuần tuổi. 71 (ii Để kiểm tra việc giảm biểu hiện của gen At3G55240 có liên quan đến khả năng đáp ứng bất lợi như thế nào, cây Arabidopsis chuyển gen biểu hiện quá mức gen At3G55240 được thử nghiệm trong một số điều kiện bất lợi thường gặp. Đầu tiên, dòng chuyển g n RBC được gi o trên môi trường MS bổ sung kháng sinh hygromycin 5mg/l. Các cây có kích thước tương đương nhau ở giai đoạn ngày tuổi được lựa chọn để chuyển sang môi trường có bổ sung 75 mM NaCl và 75 µM CdCl2. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cây sống sót trên môi trường chọc lọc được ghi nhận bắt đầu từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8. Hình 3.7. Đánh giá khả năng đáp ứng của d ng cây chuy n gen à đối chứng khi xử lý mặn Các cây chuyển gen biểu hiện uá mức At3G 2 hiệu là C1 và cây Arabidopsis Col- đối chứng hiệu là WT đư c xử l mặn trên môi trường thạch. ố lư ng cây chết trắng đư c uan sát đến ngày sau xử l . Kết quả cho thấy, cây đối chứng và dòng cây chuyển gen RBC- đều có biểu hiện đáp ứng nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao. Minh họa rõ nét ở Hình 3.7, các cây bị trắng lá sau ngày xử lý mặn. Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8, số lượng cây chuyển gen chết trắng hoàn toàn tăng lên nhanh hơn 72 so với đối chứng. Cụ thể, sau ngày, số lượng cây chuyển gen chỉ còn 6/ 5 cây (40%) sống sót trong khi dòng cây đối chứng còn 9/ 5 cây 6 %). Kết quả cũng được ghi nhận tương tự ở các lần lặp lại. Có thể thấy rằng, biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao. Hình 3.8. Đánh giá khả năng đáp ứng của d ng cây chuy n gen à đối chứng khi xử lý CdCl2 Các cây chuyển gen biểu hiện uá mức At3G 2 hiệu là C1 và cây Arabidopsis Col- đối chứng hiệu là WT đư c xử l v i CdCl2 trên môi trường thạch. ố lư ng cây chết đư c uan sát đến ngày sau xử l . Trong khi đó, triệu chứng khi cây nhiễm độc do kim loại nặng Cd dễ nhận thấy nhất là lá vàng úa và cuộn lại do mất cân bằng nước và rối loạn quá trình đóng mở khí khổng. ề mặt sinh lý, lá cây vàng úa do Cd làm thay đổi tỷ lệ F : n và tác động đến quá trình chuyển hóa ở lục lạp [42]. Sau 5 ngày kể từ ngày chuyển sang môi trường có bổ sung CdCl2 75 µM, lá của dòng chuyển gen bắt đầu có hiện tượng vàng úa. Sau đó, từ ngày thứ 5, tốc độ mẫn cảm của các cây RBC , ghi nhận bởi tốc độ cây chết vàng, nhanh hơn so với 73 đối chứng Col- , Th o dõi cũng cho thấy, sau 7 ngày, số lượng cây chuyển g n sống sót chỉ còn 6/ 5 cây %) trong khi đối chứng còn / 5 cây (66,67%) sống sót Hình 3.8). Do vậy, dễ dàng nhận thấy rằng việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana cũng làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào với CdCl2 ở nồng độ cao. Cuối cùng, mức độ đáp ứng dòng chuyển gen RBC với paraquat được đánh giá trên đĩa. Như đã biết, paraquat là hợp chất có hoạt tính khử, nguyên nhân sinh ra O2 - trong tế bào được ghi nhận ở A. thaliana và N. benthamian [70]. Do đó, paraquat gây nên sự phá hủy và giết chết tế bào thực vật [182]. Kết quả của thí nghiệm cho thấy, tăng cường mức độ phiên mã của gen At3G55240 cũng làm tăng tính nhạy cảm của tế bào với paraquat Hình 3.9 . Khi quan sát, lá chuyển gen bị mất diệp lục và chuyển sang màu trắng hoàn toàn sau giờ xử lý với paraquat. Kết quả cũng được ghi nhận ở tất cả các nồng độ sử dụng trong thí nghiệm ,5 ÷ , µM Hình 3.9 . Ngược lại, lá đối chứng Col-0 bị mất diệp lục ở mức độ chậm hơn so với dòng RBC . Dễ nhận thấy rằng, biểu hiện của dòng cây đối chứng có sự khác nhau khá rõ nét so với RBC giữa các nồng độ xử lý. Hình 3.9. Thử nghiệm paraqua rên d ng cây đối chứng à d ng cây chuy n gen RBC1 Các cây chuyển gen biểu hiện uá mức At3G 2 hiệu là C1 và cây Arabidopsis Col- đối chứng hiệu là WT đư c xử l v i para uat ở các nồng độ hác nhau trên giếng. Tốc độ và hả năng mất màu của lá đư c uan sát sau 2 giờ xử l . 74 Tóm lại, việc biểu hiện quá mức gen At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana cho thấy sự gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào trong điều kiện bất lợi, cụ thể là mặn, độc CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat. Tất cả thí nghiệm đều ghi nhận cây chuyển gen chết nhanh hơn so với đối chứng Col- . Một giả thuyết đã được đề xuất, đó là gen At3G55240 có thể đóng vai trò trong quá trình loại bỏ ROS nội bào. ROS, như đã đề cập, đóng vai trò quan trọng như chất truyền tín hiệu trong việc kích hoạt cơ chế phòng thủ chống lại điều kiện ngoại cảnh bất lợi [21, 109]. Khi tế bào chịu tác động của điều kiện bất lợi, ROS nội bào được tích lũy, thực vật có xu hướng kích hoạt cơ chế phản ứng phức tạp để khử và dọn dẹp ROS. Tăng cường tổng hợp prot in có vai trò dọn dẹp ROS, trong trường hợp này là biểu hiện quá mức gen At3G55240, ở giai đoạn đầu của điều kiện bất lợi, có thể đã làm giảm tín hiệu kích hoạt cơ chế phòng thủ, vì thế làm suy yếu khả năng đề kháng cây chuyển gen [181]. Hiện nay, chưa có một công bố nào mô tả về việc tăng cường biểu hiện của gen mã hóa prot in đóng vai trò khử ROS lại làm tăng tính nhạy cảm của cây chuyển gen trong điều kiện phi sinh học bất lợi, chứ không phải trong điều kiện sinh học bất lợi [116, 118, 181]. í dụ như biểu hiện quá mức gen OsMT2b, mã hóa cho m tallothion in - một prot in giàu Cys, có chức năng dọn dẹp ROS và giúp cân bằng kim loại bên trong tế bào lại làm tăng mức độ mẫn cảm của lúa đối với vi khuẩn gây bệnh bạc lá và nấm gây bệnh đạo ôn [181]. 3.2. Xác định à phân ích pro ein giàu Methionine ở đ u ư ng Với bức tranh tổng quát khá chi tiết về MRP trên cây mô hình A. thaliana, có thể thấy rằng, AtMRP đóng vai trò quan trọng trong tế bào, liên quan đến hàng loạt quá trình sinh lý, trao đổi chất và năng lượng, chuỗi dẫn truyền tín hiệu và đặc biệt là liên quan đến phản ứng đáp ứng của cây với điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Mặc dù vậy, rất nhiều gen mã hóa MRP ở A. thaliana vẫn chưa biết rõ chức năng. Điều này đã mở ra rất nhiều hướng nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ toàn bộ cơ chế phòng thủ của cây trồng với tác động của 75 điều kiện ngoại cảnh. Trong nội dung này, các MRP, được ký hiệu là GmMRP , đã tiếp tục được tìm hiểu ở cây đậu tương, một loài cây trồng rất quan trọng ở iệt Nam nhưng lại khá mẫn cảm với điều kiện hạn và mặn. iệc tìm ra các gen mã hóa cũng như phân tích đặc tính của GmMRP có thể giải đáp cho cơ chế chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi của đậu tương. Nội dung này lần lượt gồm phần, cụ thể là i tìm kiếm, xác định và định danh gen mã hóa MRP ở G. max, ii phân loại chức năng của GmMRP, iii phân tích một số đặc tính cơ bản của GmMRP và cuối cùng, iv đánh giá mức độ biểu hiện của các gen mã hóa MRP ở đậu tương trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi. 3.2.1. Tì kiế , ác đ nh và đ nh danh gen ã hó rotein giàu methionine ở đậu t ơng Dựa trên cơ sở proteome của đậu tương (Wm82.a2.v1) [149], tổng số 3 phân tử MRP đã được xác định với tiêu chí có ít nhất 6% M t và kích thước > 95 amino acid. Toàn bộ prot in sau đó được blastP trên cơ sở dữ liệu NCBI (BioProject: PRJNA19861) [149] để xác định thông tin định danh của gen mã hóa. Tất cả MRP tìm được đều có thông tin gen mã hóa đầy đủ, không có phân tử nào được mã hóa bởi gen nằm trong nhóm chưa được sắp xếp. Kết quả phân tích 213 gen GmMRP cho thấy tất cả các gen này phân bố rải rác trên g nom của đậu tương. Khác với AtMRP, không có gen mã hóa MRP nào được tìm thấy trong tế bào chất của đậu tương Phụ lục Bảng S4). Các gen mã hóa MRP ở đậu tương phân bố ở tất cả nhiễm sắc thể với tỷ lệ khác nhau. Trong đó, nhiễm sắc thể số 5 và 7 chứa ít gen mã hóa MRP nhất tương ứng 6 và 5 gen trong khi có các nhiễm sắc thể còn lại đều chứa đa dạng các gen mã hóa MRP Phụ lục Bảng S4). Một số GmMRP giàu M t nhất đã được liệt kê ở Bảng 3.5. Trong số 5 MRP có ít nhất 10% Met, Glyma01G3 9 là phân tử MRP giàu M t nhất, chứa 9, % M t được tìm thấy ở đậu tương, phân tử còn lại có số lượng M t, xấp xỉ 10%. 76 Bảng 3.5. Thông in ề mộ số MRP có hành phần Me à kích hước phân ử nổi b t STT Mã định danh Ch số Me Kích hước (aa) (%) (#) 1 Glyma01G32890 19,18 28 147 2 Glyma05G03240 10,79 15 140 3 Glyma17G13820 10,07 14 140 4 Glyma16G21670 10,08 12 120 5 Glyma06G39910 10,34 12 117 TT ố thứ tự, Tỷ lệ phần trăm et trong phân tử, ố lư ng gốc et trong phân tử; aa: amino acid. Tóm lại, 3 phân tử MRP đã được xác định ở đậu tương với tiêu chí có kích thước 95 amino acid và chứa số lượng M t > 6%. Glyma01G3 9 là phân tử giàu M t nhất ở đậu tương, với tỷ lệ M t lên đến 19,18%. Tiếp th o, để hiểu rõ hơn về chức năng của g n mã hóa GmMRP, tên định danh của chúng lần lượt được đưa vào công cụ Mapman. 3.2.2. Phân oại ch c năng củ gen ã hó rotein giàu methionine ở đậu t ơng Trong nội dung này, tương tự như phương pháp tiếp cận để tìm hiểu chức năng gen mã hóa MRP ở cây mô hình A. thaliana, 213 gen GmMRP được xác định và phân loại bằng MAPMAN [168]. Kết quả được tóm lược ở Bảng 3.6. Tương tự như các gen mã hóa MRP ở Arabidopsis, GmMRP tham gia vào hầu hết quá trình diễn ra trong tế bào. Cụ thể, các quá trình này bao gồm kiểm soát ion kim loại, xử lý RNA, phản ứng với điều kiện bất lợi, biến đổi prot in, điều hòa phiên mã RNA, truyền dẫn tín hiệu, chu trình tế bào, sự phát triển, vận chuyển kim loại, hormon và chuyển hóa lipid. Bên cạnh đó, 43% số gen mã hóa MRP ở đậu tương chưa rõ chức năng, bao gồm cả một số MRP giàu M t nhất như đã đề cập ở Bảng 3.6. Phân tích này đã đặt ra câu hỏi rằng liệu các gen này có liên quan đến khả năng đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh ở đậu tương hay không? 77 Bảng 3.6. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP ở đ u ư ng heo Mapman STT Nhóm chức năng gen GmMRP (%) 1 Kiểm soát ion kim loại 1 2 Phản ứng điều kiện bất lợi 1 3 Xử lý RNA 4 4 Điều hòa phiên mã RNA 20 5 Biến đổi protein 6 6 Truyền dẫn tín hiệu 14 7 Chu trình tế bào 1 8 Sự phát triển 1 9 Vận chuyển (kim loại) 4 10 Chưa biết chức năng 43 Tập trung vào một số chức năng chính, có thể thấy rằng, các GmMRP chủ yếu tham gia vào quá trình điều hòa phiên mã RNA và dẫn truyền tín hiệu trong tế bào, lần lượt chiếm và % Bảng 3.6 . Trong khi đó, GmMRP cũng được xác định là tham gia vào quá trình xử lý RNA % , biến đổi prot in 6% và vận chuyển kim loại % . Một lượng nhỏ gen mã hóa MRP khác có thể tham gia vào việc kiểm soát ion kim loại, phản ứng với điều kiện bất lợi, chu trình tế bào và sự phát triển Bảng 3.6 . í dụ như 2 gen, Glyma11G14290 và Glyma18G41530, lần lượt nằm trên nhiễm sắc thể số và ở đậu tương, được xác định liên quan đến con đường vận chuyển kim loại trong tế bào. Hai gen này tương đồng với At5G59030, mã hóa cho prot in vận chuyển ion Cu2+ - COPT Copp r ion transm mbran transport r ở A. thaliana. Tóm lại, 213 gen mã hóa MRP ở đậu tương được dự đoán có thể tham gia vào rất nhiều quá trình diễn ra trong tế bào. Trong đó, chúng chủ yếu liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã RNA và dẫn truyền tín hiệu. Bên cạnh đó, khoảng một nửa trong số GmMRP, tương ứng 43%, chưa rõ chức năng trong tế bào. Rõ ràng là mặc dù các gen mã hóa MRP ở đậu tương đã biết chức năng nhưng chưa nhiều gen trong số đó được nghiên cứu chức năng một 78 cách rõ ràng. Kết hợp với những gen GmMRP chưa rõ chức năng, đây có thể là nguồn vật liệu rất có tiềm năng để tìm hiểu vai trò của chúng liên quan đến khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở đậu tương. Để hiểu rõ hơn về điểm này, mức độ biểu hiện của các gen GmMRP tiếp tục được phân tích trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi thông qua một số cơ sở dữ liệu microarray đã công bố. 3.2.3. Phân tích c độ bi u hiện củ gen ã hó rotein giàu methionine ở đậu t ơng Trong khuôn khổ của luận án này, mức độ biểu hiện của các gen GmMRP được phân tích trong i điều kiện thường [104] và ii điều kiện xử lý với hạn [96] dựa trên một số dữ liệu microarray đã công bố trên cơ sở dữ liệu GEO [19, 20]. Những thông tin này có thể cung cấp những hiểu biết mới về MRP ở đậu tương cũng như cung cấp một số gen GmMRP tiềm năng liên quan đến khả năng đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi. i Đầu tiên, để x m xét dữ liệu biểu hiện của 213 gen GmMRP trong điều kiện thường, transcriptom của giống đậu tương Williams ở 9 mẫu mô cơ quan thu được trong nghiên

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_su_bieu_hien_cua_gen_ma_hoa_methionine_su.pdf
Tài liệu liên quan