Luận án Nghiên cứu sự biểu hiện mrna của gen ciz1b, vegf và đột biến egfr với nhiễm virus merkel cell tại bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

.0mmol/L, tăng khi > 5.0 mmol/L, giảm khi < 3.5 mmol/L. + Clor bình thường: 100 – 108 mmol/L, tăng khi > 108 mmol/L, giảm khi < 100 mmol/L. + CEA bình thường: Không hút thuốc: ≤ 3.4 ng/mL, tăng khi > 3,4 . + Cyfra21-1bình thường 3,3 ng/mL. 2.7.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA VEGF, mRNA CIZ1b, đột biến EGFR với tình trạng nhiễm virus Merkel ở nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ - Mức độ biểu hiện của mRNA VEGF và mRNA CIZ1b ở nhóm UTP nghiên cứu (ở các type mô bệnh, độ biệt hoá, giai đoạn bệnh). - Tỷ lệ đột biến EGFR - Tỷ lệ nhiễm virus Merkel cell ở nhóm UTP và nhóm chứng. - Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA VEGF, mRNA CIZ1b với một số yếu tố cận lâm sàng: chức năng thận, hoạt độ men gan, đường máu, CEA, CYFRA21-1, đột biến EGFR, giai đoạn bệnh, độ biệt hoá và với nhiễm virus Merkel cell. 2.8. Xử lý số liệu Số liệu được nhập và quản lý bằng Excel 2010 và được phân tích bằng phần mềm SPSS v.19. Các thông số là các biến rời rạc được trình bày bằng giá trị tuyệt đối và tỷ lệ phần trăm. Kiểm định sự khác biệt giữa các nhóm bằng phương pháp Khi bình phương hoặc Fisher’s exact test. Các thông số là các biến liên tục được trình bầy bằng giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, trung vị. Kiểm định sự khác biệt giữa các nhóm bằng phương pháp t-student test hoặc ANOVA nếu các biến định lượng tuân theo phân phối chuẩn. Kiểm định sự khác biệt giữa các nhóm bằng phương pháp phi tham số Mann–Whitney U test hoặc Kruskal–Wallis test nếu các biến định lượng không tuân theo phân phối chuẩn. Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA VEGF, mRNA CIZ1b và nhiễm virus Merkel với các thông số lâm sàng, cận lâm sàng được phân tích bằng phương pháp tương quan Spearman. Hiệu quả chẩn đoán (độ nhạy, độ đặc hiệu) của biểu hiện mRNA VEGF và mRNA CIZ1b trong UTP. Các giá trị ngưỡng hiệu quả nhất để phân biệt giữa người bình thường và các bệnh nhân ung thư được xác định bằng cách sử dụng phân tích đường cong ROC (receiver operating characteristic). Tất cả các giá trị p đều được dựa trên kiểm định 2 chiều và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong các phân tích so sánh khi giá trị P< 0,05. 2.9. Đạo đức trong nghiên cứu Nghiên cứu được sự chấp thuận của Hội đồng chấm Nghiên cứu sinh của Học viện Quân y, Hội đồng đạo đức của Bệnh viện Quân Y 175 cho phép lấy mẫu nghiên cứu. 2.10. Sơ đồ nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu (n=151) Nhóm bình thường (n=51) Nhóm bệnh UTPKTBN (n=100) Lâm sàng, cận lâm sàng, làm các xét nghiệm thường quy và chuyên sâu Hỏi, khám, làm xét nghiệm thường quy, dấu ấn khối u, sinh học phân tử Xác định sự biểu hiện gen VEGF, CIZ1b, đột biến EGFR và nhiễm MCV Kết luận So sánh, đánh giá mối liên quan giữa mức độ biểu hiện VEGF, CIZ1b và nhiễm MCV với LS, CLS và giai đoạn của bệnh nhân UTPKTBN CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 3.1.1. Tuổi và giới của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm chứng Bảng 3.1. Đặc điểm tuổi của các nhóm nghiên cứu Đặc điểm tuổi Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người khoẻ mạnh (n = 51) ± SD Trung vị ± SD Trung vị Giá trị 60,0 ± 10,5 61,0 53,9 ± 2,9 53,0 p 0,158 Nhóm bệnh nhân UTPKTBN độ tuổi trung bình là 60 tuổi trong khi nhóm người bình thường trong nghiên cứu có độ tuổi trung bình là 53,9 tuổi. Kết quả phân tích so sánh cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tuổi giữa nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm người bình thường (p=0,158). Bảng 3.2. Phân bố về tuổi của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Tuổi (năm) Khoảng tuổi (năm) Tổng số < 44 45 - 54 55 - 64 65 - 74 ≥ 75 Số BN 7 20 42 21 10 100 Tỉ lệ % 7 20 42 21 10 100 Phân bố về tuổi của nhóm bệnh nhân nghiên cứu có khác nhau, phần lớn số bệnh nhân ở nhóm tuổi cao 55- 74 (63%), sau đó đến nhóm tuổi 45-54 (20%). Số bệnh nhân dưới 44 tuổi chiếm 7% còn số bệnh nhân trên 75 tuổi chỉ chiếm 10%, đặc biệt những bệnh nhân trên 80 tuổi chỉ có 3%. Như vậy, đa số các bệnh nhân tham gia vào nhóm nghiên cứu có độ tuổi trung bình cao (trung bình 60 tuổi, như bảng 3.1). Bảng 3.3. Đặc điểm về giới của các nhóm nghiên cứu Giới Nhóm UTPKTBN (n=100) Nhóm người bình thường (n=51) p n % n % Nam 73 73 35 71 0,47 Nữ 27 27 16 29 Về sự phân bố theo giới tính giữa hai nhóm nghiên cứu, trong 100 bệnh nhân UTPKTBN có 73 bệnh nhân là nam, chiếm 73% và 27 bệnh nhân là nữ, chiếm 27%. Trong số 51 người bình thường tham gia nghiên cứu thì có 35 người là nam, chiếm 71% và 16 người là nữ, chiếm 29%. Kết quả so sánh sự phân bố về giới giữa hai nhóm nghiên cứu cho thấy không có sự khác nhau giữa nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm người bình thường (p=0,47). 3.1.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân khi nhập viện Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu được thăm khám lâm sàng và các kết quả được trình bày trong các bảng dưới đây. Hình 3.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ khi nhập viện Các triệu chứng lâm sàng phổ biến của các bệnh là ho, đau ngực, khó thở, sụt cân và có hạch. Trong đó, ho là triệu chứng phổ biến nhất chiếm đến 83%, sau đó là đau ngực, chiến đến 56%, khó thở chiến đến 20%, sụt cân chiếm 17% và có hạch chiếm 8%. 3.1.3. Tiền sử cá nhân của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Các bệnh nhân được khai thác tiền sử và được biểu hiện qua sơ đồ sau: Hình 3.2. Tiền sử cá nhân của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Ở thời điểm nhập viện, 25 bệnh nhân (25%) có tiền sử về bệnh tim mạch, 24 bệnh nhân (24%) có bệnh phổi, 22 bệnh nhân (22%) có hút thuốc, 2 bệnh nhân (2%) uống rượu và 27 bệnh nhân (27%) có các tiền căn khác. 3.1.4. Một số đặc điểm cận lâm sàng nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ 3.1.4.1. Một số đặc điểm xét nghiệm Huyết học, Sinh hoá, Miễn dịch Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu được làm các xét nghiệm về tế bào máu ngoại vi, Sinh hoá (Ion đồ, hoạt độ men gan, thận, đường máu), các xét nghiệm về dấu ấn khối u. Các kết quả được trình bày trong các bảng dưới đây. Bảng 3.4. Đặc điểm tế bào máu ngoại vi của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ Chỉ số Nghiên cứu (n = 100) Chung (n = 100) Bình thường (n = 82) Bất thường (n = 18) p (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị Bạch cầu (K/uL) 8,9 ± 3,7 8,2 9,0 ± 3,7 8,2 8,4 ± 3,8 6,9 >0,05 Trung tính (%) 65,9 ± 10,5 65,7 65,8 ± 10,0 65,6 66,4 ± 12,5 67,3 >0,05 Mono (%) 8,7 ± 3,1 8,4 8,3 ± 2,7 8,0 10,4 ± 3,8 10,0 <0,05 Lympho (%) 24,6 ± 21,9 23,4 22,9 ± 9,1 23,8 32,1 ± 46,8 19,7 <0,05 Hồng cầu (M/uL) 4,3 ± 0,6 4,3 4,4 ± 0,5 4,4 3,6 ± 0,7 3,5 <0,05 Hematocrit (%) 38,0 ± 4,4 38,6 39,2 ± 3,5 39,4 32,7 ± 4,1 32,5 <0,05 Tiểu cầu (K/uL) 288,2 ± 99,3 261,0 280,4±97,9 254,0 323,6±97,6 335,5 <0,05 Trong số 100 bệnh nhân thực hiện các xét nghiệm thì phát hiện thấy có 18% số bệnh nhân có bất thường về tế bào máu ngoại vi. Bảng 3.5. Hoạt độ men gan của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ Chỉ số nghiên cứu (n = 100) Chung (n = 100) Bình thường (n = 89) Bất thường (n = 11) p (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị AST (U/L) 29,0 ± 14,1 26,1 25,3 ± 7,2 24,2 58,7 ± 20,3 50,6 <0,05 ALT (U/L) 29,3 ± 22,9 22,7 23,7 ± 10,8 19,9 74,6 ± 38,7 58,4 <0,05 Trong số 100 bệnh nhân thực hiện các xét nghiệm Sinh hoá thì phát hiện thấy có 11% số bệnh nhân có bất thường về các chỉ số hoạt độ men gan như AST và ALT. Bảng 3.6. Chức năng thận của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Chức năng Thận (n = 100) Chung (n = 100) Bình thường (n = 99) Bất thường (n = 01) p (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị Ure (mmol/L) 5,3 ± 2,1 5,1 5,2 ± 2,1 5,1 9,1 ± 0,0 9,1 <0,05 Creatinine (umol/L) 80,5 ± 16,8 78,4 79,5 ± 14,1 78,0 173,2 ± 0,0 173,2 <0,05 Trong số 100 bệnh nhân thực hiện các xét nghiệm thì phát hiện thấy có 1% số bệnh nhân có bất thường về các chỉ số chức năng thận Ure và Creatine. Bảng 3.7. Nồng độ Glucose máu của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Glucose máu (n = 100) Chung (n = 100) Bình thường (n = 66) Bất thường (n = 34) p (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị Glucose (mmol/L) 6,1 ± 1,9 5,5 5,2 ± 0,5 5,2 8,0 ± 2,2 7,1 <0,05 Trong số 100 bệnh nhân thực hiện các xét nghiệm nồng độ Glucose trong máu thì phát hiện thấy có 34% số bệnh nhân có bất thường về nồng độ glucose trong máu. Bảng 3.8. Đặc điểm Ion đồ của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ Ion đồ (n = 100) Chung (n = 100) Bình thường (n = 87) Bất thường (n = 13) p (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị Na+ (mmol/L) 137,8 ± 3,7 138,1 138,2 ± 3,3 138,4 132,5 ± 4,3 130,6 >0,05 K+ (mmol/L) 3,7 ± 0,4 3,7 3,8 ± 0,4 3,7 3,5 ± 0,5 3,3 >0,05 Cl- (mmol/L) 101,9 ± 3,6 102,1 102,3 ± 2,9 102,7 97,3 ± 6,2 97,8 >0,05 Đa số các bệnh nhân UTPKTBN có các chỉ số Ion đồ bình thường, chỉ phát hiện thấy 13% số bệnh nhân có Ion đồ bất thường. * Một số đặc điểm về marker UTP Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu được thăm khám lâm sàng và làm các xét nghiệm phát hiện các dấu ấn ung thư như CEA và CyFra 21.1. Các kết quả được trình bầy trong các hình dưới đây. Bảng 3.9. Một số đặc điểm của dấu ấn ung thư liên quan đến ung thư phổi không tế bào nhỏ * Chỉ số CEA Chỉ số CEA (n = 87) Chung (n = 87) Bình thường (n = 39) Bất thường (n = 48) p (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị CEA (ng/mL) 99,3 ± 262,0 6,2 2,5 ± 1,5 2,3 178,0 ± 334,0 17,0 <0,05 * Chỉ số CYFRA 21-1 Chỉ số CYFRA 21.1 (n = 61) Chung (n = 61) Bình thường (n = 33) Bất thường (n = 28) p (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị (± SD) Trung vị CYFRA 21.1 (ng/mL) 11,6 ± 34,8 3,6 2,6 ± 0,8 2,7 22,7 ± 49,5 8,2 <0,05 Các xét nghiệm marker ung thư như CEA và CyFra 21.1 thì có 56,1 % số bệnh nhân có dấu hiệu bất thường (đối với CEA) và có 41,94 % số bệnh nhân có dấu hiệu bất thường (đối với CyFra 21.1). 3.1.4.2. Đặc điểm chẩn đoán hình ảnh ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu được làm các xét nghiệm về chẩn đoán hình ảnh . Các kết quả được trình bày trong các bảng dưới đây. Bảng 3.10. Vị trí khối u tại phổi ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ STT Vị trí khối u phổi (n=100) Số lượng Tỷ lệ % 1 Phổi phải Thùy trên 34 34 Thùy giữa 9 9 Thùy dưới 18 18 2 Phổi trái Thùy trên 26 26 Thùy dưới 13 13 Trong số 100 bệnh nhân UTPKTBN thì có 61 bệnh nhân có khối u ở phổi phải (34 bệnh nhân có khối u ở thùy trên, 18 bệnh nhân có khối u ở thùy dưới, 9 bệnh nhân có khối u ở thùy giữa), 39 bệnh nhân có khối u ở phổi trái (26 bệnh nhân có khối u ở thùy trên và 13 bệnh nhân có khối u ở thùy dưới). Bảng 3.11. Vị trí hạch ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Đặc điểm Kết quả Số lượng (N=100) Tỷ lệ % Hạch Có hạch 66 66 Không hạch 34 34 Vị trí hạch Cổ 3 3 Thượng đòn 10 10 Khí quản 7 7 Quai động mạch chủ 4 4 Trung thất 46 46 Rốn phổi 10 10 Carena 8 8 Khác 5 5 Trong số 100 bệnh nhân nghiên cứu thì 66 bệnh nhân có hạch và vị trí hạch chủ yếu tập trung ở trung thất (46/100) sau đó đến rốn phổi và thượng đòn (10/100). Các vị trí khác chúng tôi quan sát thấy là ở Carena, khí quản, quai động mạch chủ, cổ. 3.1.4.3. Đặc điểm mô bệnh học, độ biệt hoá của tế bào khối u ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Bảng 3.12. Kết quả đặc điểm mô bệnh học STT Kết quả Mô bệnh học (n=100) Số lượng Tỷ lệ % 1 Ung biểu mô tuyến (Adeno carcinoma) 91 91 2 Ung thư biểu mô tế bào gai (Squamus cell) 9 9 Trong số 100 bệnh nhân UTPKTBN, thì có 91 bệnh nhân là ung thư biểu mô tuyến (91%), 9 bệnh nhân là ung thư biểu mô tế bào gai (vảy) chiếm 9%. Không có bệnh nhân ung thư tế bào lớn và tế bào hỗn hợp. Bảng 3.13. Độ biệt hóa của khối u ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ STT Độ biệt hoá (n=100) Số lượng Tỷ lệ % 1 Không đánh giá 37 37 2 Được đánh giá (n=63) Độ 1 6/63 9,52 Độ 2 35/63 55,56 Độ 3 22/63 34,92 Về độ biệt hóa tế bào khối u, có đến 56% số bệnh nhân có độ biệt hóa 2, 35% số bệnh nhân có độ biệt hóa 3 và chỉ có 9% số bệnh nhân có độ biệt hóa 1. Như vậy, đa số các bệnh nhân có độ biệt hoá trung bình 3.1.4.4. Đánh giá giai đoạn của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Bảng 3.14. Phân loại giai đoạn theo TNM của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ STT Giai đoạn (n=100) Số lượng Tỷ lệ % 1 Không đánh giá 9 9 2 Được đánh giá (n=91) Giai đoạn IA 2/91 2,20 Giai đoạn IIA 4/91 4,40 Giai đoạn IIIA 2/91 2,20 Giai đoạn IIIB 14/91 15,38 Giai đoạn IV 69/91 75,82 Theo hệ thống phân loại TNM [7], các bệnh nhân được phân thành các giai đoạn IA, IIA, IIIA, IIIB và IV, đa số các bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu ở giai đoạn muộn IV (76%), 15% số bệnh nhân ở giai đoạn IIIB, 5% số bệnh nhân ở giai đoạn IIA, và chỉ có 2% số bệnh nhân ở giai đoạn IA và IIIA. 3.1.5. Một số đặc điểm cận lâm sàng nhóm người bình thường Đối với nhóm chứng bao gồm những người bình thường, chúng tôi cũng xét nghiệm các chỉ số tế bào máu ngoại vi, hoạt độ men gan, chức năng thận và xác định một số dấu ấn ung thư như CEA và CyFra 21.1. Kết quả xét nghiệm được tóm tắt trong bảng dưới đây. Bảng 3.15. Một số chỉ số xét nghiệm về tế bào máu ngoại vi của nhóm người bình thường Chỉ số nghiên cứu (n = 51) Kết quả (n = 51) ± SD Trung vị Bạch cầu (K/uL) 7,2 ± 1,3 6,8 Tế bào trung tính (%) 56,5 ± 22,5 55,2 Tế bào Mono (%) 7,5 ± 1,6 7,5 Tế bào Lympho (%) 33,8 ± 7,3 34,3 Hồng cầu (M/uL) 4,8 ± 0,4 4,8 Hematocrit (%) 43,1 ± 3,5 43,8 Tiểu cầu (K/uL) 211,8 ± 58,2 200,0 Các chỉ số tế bào máu ngoại vi của nhóm người bình thường đều nằm trong giới hạn bình thường. Bảng 3.16. Một số đặc điểm về xét nghiệm hoạt độ men gan, chức năng thận và dấu ấn ung thư của nhóm người bình thường Chỉ số nghiên cứu (n = 51) Kết quả (n = 51) ± SD Trung vị AST (U/L) 27,2 ± 9,8 24,9 ALT (U/L) 28,1 ± 14,7 24,6 Ure (mmol/L) 5,2 ± 1,0 5,2 Creatine (umol/L) 88,1 ± 12,5 89,1 CEA (ng/mL) 1,9 ± 1,1 1,7 CyFra 21.1 (ng/mL) 2,2 ± 0,6 2,3 Các chỉ số về hoạt độ men gan (ALT và AST), chức năng thận (nồng độ Ure và Creatine), các dấu ấn ung thư (CEA và CyFra 21.1) của nhóm người bình thường đều nằm trong giới hạn bình thường. 3.2. Kết quả so sánh các chỉ số cận lâm sàng giữa 2 nhóm đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành so sánh các chỉ số cận lâm sàng như đặc điểm tế bào máu ngoại vi, đặc điểm hoạt độ men gan, chức năng thận và kết quả xét nghiệm các dấu ấn ung thư. Kết quả được tổng hợp ở bảng dưới đây. Bảng 3.17. Kết quả so sánh các chỉ số cận lâm sàng giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người bình thường Các chỉ số nghiên cứu Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người bình thường (n = 51) p ± SD Trung vị ± SD Trung vị Bạch cầu (K/uL) 8,9 ± 3,7 8,2 7,2 ± 1,3 6,8 < 0,05 Tế bào trung tính (%) 65,9 ± 10,5 65,7 56,5 ± 22,5 55,2 < 0,05 Tế bào Mono (%) 8,7 ± 3,1 8,4 7,5 ± 1,6 7,5 < 0,05 Tế bào Lympho (%) 24,6 ± 21,9 23,4 33,8 ± 7,3 34,3 < 0,05 Hồng cầu (M/uL) 4,3 ± 0,6 4,3 4,8 ± 0,4 4,8 < 0,05 Hematocrit (%) 38,0 ± 4,4 38,6 43,1 ± 3,5 43,8 < 0,05 Tiểu cầu (K/uL) 288,2 ± 99,3 261,0 211,8 ± 58,2 200,0 < 0,05 AST (U/L) 29,0 ± 14,1 26,1 27,2 ± 9,8 24,9 > 0,05 ALT (U/L) 29,3 ± 22,9 22,7 28,1 ± 14,7 24,6 > 0,05 Ure (mmol/L) 5,3 ± 2,1 5,1 5,2 ± 1,0 5,2 > 0,05 Creatine (umol/L) 80,5 ± 16,8 78,4 88,1 ± 12,5 89,1 > 0,05 CEA (ng/mL) 99,3 ± 262,0 6,2 1,9 ± 1,1 1,7 < 0,05 CyFra 21.1 (ng/mL) 11,6 ± 34,8 3,6 2,2 ± 0,6 2,3 < 0,05 Số lượng của các tế bào bạch cầu, tế bào trung tính, tế bào mono, và tiểu cầu ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN lớn hơn so với nhóm chứng, và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,05, trong khi số lượng tế bào hồng cầu và tế bào lympho ở nhóm bệnh nhân nhỏ hơn so với nhóm chứng, và sự khác biệt này cũng có ý nghĩa thống kê với p<0,05. Trong khi đó không có sự khác biệt về hoạt độ AST và ALT giữa các bệnh nhân UTP và người bình thường (p>0,05). Nồng độ Ure và Creatine ở hai nhóm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nồng độ các dấu ấn ung thư CEA và CyFra 21.1 ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN cao hơn rất rõ rệt so với nhóm những người bình thường (p<0,05). 3.3. Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu huyết tương của các bệnh nhân UTP và người bình thường sau đó được chuyển thành cDNA. Kết quả nồng độ cDNA chúng tôi đạt được trung bình 93,8 ng/µl, giao động từ 35 ng/µl đến 135 ng/µl. Khi đưa các mẫu cDNA vào các phản ứng real-time PCR, chúng tôi phải điều chỉnh nồng độ để đưa cùng một lượng cDNA vào các phản ứng để đảm bảo xác định sự biểu hiện của các gen CIZ1b và VEGF được chính xác. Bảng 3.18. Kết quả nồng độ DNA và OD 260/280 của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người bình thường Các chỉ số nghiên cứu Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người bình thường (n=51) p ± SD Trung vị ± SD Trung vị OD 260/280 1,5 ± 0,05 1,6 1,58 ± 0,03 1,59 >0,05 DNA 105,8 ± 19,9 99,8 101,5 ± 11,62 98,5 >0,05 Nồng độ DNA ở các nhóm được tách chiết đảm bảo cả về nồng độ cho phép và độ tinh sạch. 3.4. Kết quả real-time PCR phát hiện biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF huyết tương Kết quả phát hiện mRNA của gen CIZ1b và VEGF lưu hành trong máu ngoại vi được xác định bằng kỹ thuật real-time PCR và được biểu hiện bằng giá trị Ct (cycle threshold). 3.4.1. Kết quả Ct của phản ứng real-time PCR cho gen CIZ1b Bảng 3.19. Giá trị Ct của CIZ1b thu được từ phản ứng real-time PCR Chỉ số nghiên cứu Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người bình thường (n = 51) ± SD Trung vị ± SD Trung vị Giá trị Ct 24,2 ± 2,6 23,9 24,1 ± 1,3 24,0 p > 0,05 Giá trị Ct của CIZ1b thu được từ phản ứng real-time PCR ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm chứng không có sự khác biệt (p>0,05). 3.4.2. Kết quả Ct của phản ứng real-time PCR cho gen VEGF Bảng 3.20. Giá trị Ct của VEGF thu được từ phản ứng real-time PCR Chỉ số nghiên cứu Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người bình thường (n = 51) ± SD Trung vị ± SD Trung vị Giá trị Ct 26,4 ± 1,8 26,5 26,6 ± 1,1 26,4 p > 0,05 Giá trị Ct của VEGF thu được từ phản ứng real-time PCR ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm chứng không có sự khác biệt (p>0,05). 3.4.3. Kết quả Ct của phản ứng real-time PCR cho gen ABL Bảng 3.21. Giá trị Ct của ABL thu được từ phản ứng real-time PCR Chỉ số nghiên cứu ABL Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người bình thường (n = 51) ± SD Trung vị ± SD Trung vị Giá trị Ct 27,5 ± 2,7 27,2 27,0 ± 1,1 26,9 p > 0,05 Giá trị Ct của ABL thu được từ phản ứng real-time PCR ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm chứng không khác nhau (p>0,05). 3.5. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF huyết tương ở đối tượng nghiên cứu 3.5.1. Biểu hiện của mRNA của CIZ1b huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và người bình thường Biểu hiện mRNA của gen CIZ1b trong huyết tương của bệnh nhân UTPKTBN và của người bình thường được tính bằng phương pháp ∆Ct hiệu chỉnh với sự biểu hiện của gen ALB. Các giá trị Ct của các mẫu nghiên cứu được xác định bằng phương pháp real-time PCR. Kết quả phân tích cho thấy sự biểu hiện của gen CIZ1b ở bệnh nhân UTPKTBN cao hơn có ý nghĩa thống kê so với người bình thường (p<0,05) (Bảng 3.25, Hình 3.4). Bảng 3.22. Biểu hiện mRNA của CIZ1b huyết tương ở nhóm nghiên cứu Biểu hiện CIZ1b (2-∆Ct) Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người bình thường (n = 51) ± SD Trung vị ± SD Trung vị 10,5 ± 6,3 8,9 7,8 ± 2,6 7,0 p 0,008 Sự biểu hiện mRNA của CIZ1b huyết tương ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm chứng khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Hình 3.3. Mức độ biểu hiện của mRNA của CIZ1b huyết tương ở các nhóm nghiên cứu 3.5.2. Biểu hiện của mRNA của VEGF huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và người bình thường Biểu hiện mRNA của gen VEGF huyết tương của bệnh nhân UTPKTBN và người bình thường được tính bằng phương pháp ∆Ct hiệu chỉnh với sự biểu hiện mRNA của gen ALB. Kết quả phân tích cũng cho thấy sự biểu hiện của gen VEGF ở bệnh nhân UTPKTBN cao hơn có ý nghĩa thống kê so với người bình thường (p<0,05) (Bảng 3.26, Hình 3.5). Bảng 3.23. Biểu hiện mRNA của VEGF huyết tương ở nhóm nghiên cứu Biểu hiện VEGF (2-∆Ct) Nhóm UTPKTBN (n = 100) Nhóm người bình thường (n = 51) ± SD Trung vị ± SD Trung vị 2,3 ± 2,3 1,7 1,5 ± 1,0 1,3 p 0,007 Sự biểu hiện mRNA của VEGF ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm chứng khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Hình 3.4. Mức độ biểu hiện của mRNA VEGF ở nhóm nghiên cứu 3.6. Đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Đột biến trên gen EGFR có liên quan đến sự xuất hiện và phát triển của UTPKTBN, chúng tôi tiến hành xét nghiệm đột biến trên gen EGFR, kết quả được trình bày trong như sau. Hình 3.5. Tín hiệu real-time PCR phát hiện đột biến EGFR trên exon 21 (đột biến L858R) ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Bảng 3.24. Vị trí đột biến trên gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Vị trí đột biến Số BN thực hiện (n=51) Tỷ lệ % Exon 19 11 21,57 Exon 20 2 3,92 Exon 21 13 25,49 Không đột biến 25 49,02 Trong số 51 bệnh nhân UTPKTBN được xét nghiêm đột biến gen EGFR, chúng tôi phát hiện thấy 26 bệnh nhân có đột biến chiếm 51%. Trong số 26 bệnh nhân này thì 11 bệnh nhân có đột biến ở Exon 19 (chiếm 21,57%), 2 bệnh nhân có đột biến ở Exon 20 (chiếm 3,92%), 13 bệnh nhân có đột biến ở Exon 21(chiếm 25,49%). Có 25 bệnh nhân không phát hiện đột biến EGFR. 3.7. Kết quả xác định MCV ở người khỏe mạnh và bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng kỹ thuật real-time PCR. 3.7.1. Kết quả xác định MCV huyết tương nhóm người khỏe mạnh bằng kỹ thuật real-time PCR Trong 51 người khỏe mạnh được đánh giá tình trạng nhiễm MCV bằng kỹ thuật real-time PCR chúng tôi xác định có 3 trường hợp nhiễm MCV. Hình 3.6. Tín hiệu real-time PCR phát hiện MCV huyết tương ở người bình thường. Các mẫu dương tính HC 14, 27, 57; mẫu chứng dương và mẫu chứng âm. 3.7.2. Kết quả xác định MCV ở mô ung thư và huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phản ứng real-time PCR Kết quả real-time PCR cho thấy trong 100 bệnh nhân UTPKTBN có 25 mẫu dương tính với MCV ở cả mô ung thư và huyết tương bệnh nhân. Hình 3.7. Tín hiệu real-time PCR phát hiện MCV huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Các mẫu dương tính Kp 2, 3, 13, 15; mẫu chứng dương và mẫu chứng âm. 3.7.3. Kết quả xác định dương tính với MCV bằng phản ứng PCR. Để xác định chính xác nhiễm MCV trong mô ung thư và trong huyết tương bệnh nhân, những bệnh nhân có mẫu dương tính bằng phản ứng real-time PCR, được thực hiện phản ứng PCR thường với cặp mồi Tr-MCV-seq-F/ Tr-MCV-seq-R. Cặp mồi này khuếch đại sản phẩm có kích thước 780 bp trên bộ gen của MCV. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 3.8). Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản MCV- DNA trong huyết tương của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và người bình thường. MK, thang chuẩn DNA, cột số 1, chứng âm; cột số 2 và 3 là mẫu dương tính của người bình thường (HC14 và HC27); cột 4-7 bệnh nhân UTPKTBN âm tính với MCV, cột 8-12: mẫu bệnh nhân UTPKTBN dương tính với MCV (Pk2,3,13,15). 3.7.4. Kết quả giải trình tự và so sánh đoạn giải trình tự với trình tự MCV trên dữ liệu NCBI. Sản phẩm PCR được tinh sạch giải trình tự. Dữ liệu giải trình tự được so sánh, sử dụng chương trình NCBI blast với trình tự tham khảo từ dữ liệu NCBI Entrez. Các trình tự 780 bp được xác định thuộc về genome MCV với độ tương đồng 99%- 100%. Hình 3.9. Kết quả giải trình tự đoạn gen MCV (A) và so sánh với trình tự MCV trên dữ liệu NCBI (B) 3.7.5. Tỷ lệ nhiễm MCV ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm chứng người bình thường Tình trạng nhiễm MCV ở những bệnh nhân UTP và nhóm chứng được phát hiện bằng phương pháp PCR và được so sánh với nhóm chứng. Đối với nhóm UTP, tình trạng nhiễm MCV được phát hiện cả ở máu và ở mô UTP. Kết quả được trình bày ở bảng 3.25. Bảng 3.25. Tỷ lệ nhiễm MCV ở nhóm bệnh và nhóm chứng Kết quả Nhóm bệnh n, (%) Nhóm chứng n, (%) OR (95% CI) P MCV máu MCV mô Dương tính 25 (25) 25 (25) 3 (5,9) 5,33 (1,49- 28,83) 0,004 Âm tính 75 (75) 75 (75) 48 (94,1) Tổng số 100 (100) 100 (100) 51 (100) Kết quả phân tích cho thấy ở các bệnh nhân UTP không tế bào nhỏ, tình trạng nhiễm MCV được phát hiện ở bệnh nhân UTPKTBN (25%), cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm người bình thường (5,9%) với p = 0,013, Chi bình phương: 8,17. Kết quả phân tích mối liên quan giữa tình trạng nhiễm MCV với UTPKTBN cho thấy bệnh nhân nhiễm MCV có liên quan đến UTPKTBN. Ở những người nhiễm MCV có nguy cơ mắc UTP cao hơn 5,33 lần so với những người không nhiễm MCV (OR = 5,33). 3.8. Mối liên quan giữa biểu hiện mR